伊犁河流域春季可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其胞外酶檢測(cè)

程 剛, 程 艷, 胡海洋, 邢 月, 別爾德別克·庫(kù)布加沙

(1.新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院 新疆環(huán)境污染監(jiān)控與風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院,新疆 烏魯木齊 830011;3.上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,江西 上饒 334001;4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 水利與土木工程學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052;5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)

伊犁河位于新疆西北部中亞的伊犁-巴爾喀什湖盆地，是新疆降水量最多的地區(qū)，具有亞濕潤(rùn)的大陸性溫帶氣候特征。伊犁河是典型的干旱半干旱區(qū)內(nèi)陸河流，其流向從東向西，南支特克斯河與東支鞏乃斯河匯合后稱(chēng)為伊犁河，北支喀什河在雅馬渡匯入，形成伊犁河干流，最終流入哈薩克斯坦境內(nèi)的巴爾喀什湖[1]。已有研究表明，伊犁河流域整體綜合水質(zhì)較好，但隨著經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)，人為活動(dòng)加劇，伊犁河流域部分河流面臨水質(zhì)退化風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。當(dāng)前，伊犁河流域水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)防控主要針對(duì)水源地、地下水和河流健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，污染物因子分析和有機(jī)污染物溯源等方面[3，5-6]，而對(duì)該流域微生物群落結(jié)構(gòu)特征的研究較少。水生生物群落結(jié)構(gòu)可作為流域生態(tài)質(zhì)量評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)，被廣泛運(yùn)用在河流生態(tài)系統(tǒng)水環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中[7]。近年來(lái)，伊犁河流域已通過(guò)魚(yú)類(lèi)、大型底棲動(dòng)物和浮游動(dòng)植物的群落結(jié)構(gòu)完整性來(lái)評(píng)價(jià)伊犁河流域河流的健康狀況[8-11]。細(xì)菌作為水生生物中數(shù)量最大和功能最多的類(lèi)群之一，相較其他大型水生生物，水生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成會(huì)隨環(huán)境因子及人類(lèi)活動(dòng)影響發(fā)生改變，但其多樣性損失并不明顯[12-13]。此外，西北高海拔地區(qū)河流有著與中東部地區(qū)河流顯著差異的外在環(huán)境條件，細(xì)菌等微生物群落結(jié)構(gòu)以及多樣性有明顯的地域特征，其中蘊(yùn)含著許多“土著”菌種，功能菌株以及潛在新菌種資源亟待開(kāi)發(fā)[14-15]。運(yùn)用可培養(yǎng)法對(duì)伊犁河流域細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析，可了解伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息，獲得該流域珍稀菌種資源。目前，針對(duì)伊犁河流域細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和菌種資源的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以伊犁河流域水體和沉積物為研究對(duì)象，通過(guò)傳統(tǒng)可培養(yǎng)法獲得該流域的可培養(yǎng)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息，并對(duì)分離菌株進(jìn)行胞外酶活性篩選，以期為伊犁河流域微生物資源的利用、發(fā)掘和深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自新疆伊犁河流域境內(nèi)河段,于2021年4月在伊犁河流域特克斯河支流(4個(gè)樣點(diǎn))、鞏乃斯河支流(3個(gè)樣點(diǎn))、喀什河支流(4個(gè)樣點(diǎn))以及伊犁河干流(4個(gè)樣點(diǎn)),每隔直線(xiàn)距離約45～50 km設(shè)置采樣點(diǎn),沿河采集表層水樣(水下50 cm左右)和水底沉積物(表層0～5 cm)樣品,將樣品裝入50 mL無(wú)菌離心管于4 ℃低溫保藏,送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌菌株的分離鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌分離純化培養(yǎng)基[16](g/L):① 溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基:蛋白胨10,酵母浸粉5,NaCl 10,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.0,121 ℃高壓滅菌15 min;② 胰酪大豆胨(TSA)培養(yǎng)基:胰酪胨15,大豆木瓜蛋白酶消化物5,NaCl 5,瓊脂15,蒸餾水 1 L,pH 7.5,121 ℃高壓滅菌15 min;③營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基:牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.4,121 ℃高壓滅菌15 min;④ R2A培養(yǎng)基:酸水解酪蛋白 0.5,蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,酵母浸粉0.5,可溶性淀粉0.5,丙酮酸鈉0.3,K2HPO40.3,MgSO4·7H2O 0.024,瓊脂15,蒸餾水 1 L,pH 7.4,121 ℃高壓滅菌15 min;⑤ 高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20,KNO31,K2HPO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,NaCl 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,瓊脂15,蒸餾水1 L,pH 7.5,121 ℃高壓滅菌15 min。⑥細(xì)菌胞外酶活性檢測(cè)培養(yǎng)基:分別選取分離純化培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在其中添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可溶性淀粉作為淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基;添加1%(體積分?jǐn)?shù))的吐溫-60作為酯酶檢測(cè)培養(yǎng)基;添加0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)羧甲基纖維素鈉作為纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基;添加1%木聚糖作為木聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基;添加1.5%明膠作為明膠檢測(cè)培養(yǎng)基。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(B518255,上海生工生物工程股份有限公司);TaqDNA聚合酶(R001B,寶生物工程(大連)有限公司)。超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2D,江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司);微生物培養(yǎng)箱(MJX-160B-Z,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);高壓滅菌鍋(BXM-50VE,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司);醫(yī)用低溫保存箱(BDF-86H118,濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司);高速冷凍離心機(jī)(H1850R,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司);PCR儀(WD-9402D,北京六一生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(tǒng)(WD-9413B,北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化及培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度指數(shù)計(jì)算 將每條河流不同樣點(diǎn)采集到的水體和沉積物樣品分別等量混合,水樣取1 mL用0.85%的生理鹽水按照100、10-1、10-2進(jìn)行梯度稀釋,沉積物稱(chēng)取約1 g,用2 mL 0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的生理鹽水混勻,按照10-2、10-3、10-4進(jìn)行梯度稀釋,分別涂布于LB、NA、TSA、R2A和高氏1號(hào)5種固體培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度下的樣品涂布3個(gè)平板作為平行對(duì)照?？紤]采樣點(diǎn)春季平均水溫約10 ℃左右,水體pH值約8.0,設(shè)置培養(yǎng)溫度32 ℃,涂布平板倒置培養(yǎng)3～7 d。挑取不同的單菌落,劃線(xiàn)純化2～3次,純化后的細(xì)菌菌株用含40%甘油的分離純化培養(yǎng)基于-80 ℃保藏。培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度通過(guò)下列公式計(jì)算:D=N/NT,其中N為各種培養(yǎng)基分離的細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量,NT為分離到細(xì)菌的全部種類(lèi)數(shù)量[16]。

1.2.2 細(xì)菌DNA提取及16S rRNA基因擴(kuò)增 純培養(yǎng)菌株的DNA提取使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用細(xì)菌通用引物[17]27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)純化菌株的16S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25 μL):DNA模板2 μL,10×PCR緩沖液2.5 μL,10 mmol/L的P1和P2各1 μL,dNTP(10 mmoL/L)2 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.5 μL,補(bǔ)齊滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)?；厥占兓蟮?6S rRNA基因PCR樣品送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 分離細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育和可培養(yǎng)細(xì)菌分布狀況分析 測(cè)序結(jié)果在BLAST(http://www. ncbi. nlm. nib.gov/ blast/ blast.cgi)上進(jìn)行比對(duì)分析,獲得最相近菌株的16S rRNA基因序列。并用MEGA7.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)軟件進(jìn)行序列分析,用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì),系統(tǒng)進(jìn)化矩陣根據(jù)Kimura-2模型估算,采用鄰近相連法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[18]。將所分離的細(xì)菌菌株的序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行篩選,利用Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)軟件進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析。

1.2.4 分離細(xì)菌的胞外酶檢測(cè)分析 淀粉酶、酯酶、纖維素酶、木聚糖酶和明膠酶檢測(cè)及驗(yàn)證方法參照文獻(xiàn)[19-20]進(jìn)行。活化菌株用滅菌牙簽分別點(diǎn)接于添加酶作用底物的細(xì)菌胞外酶活性檢測(cè)固體培養(yǎng)基上,32 ℃培養(yǎng)3～7 d。待菌落形成后,觀(guān)察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈(水解圈),以此作為分離菌株胞外酶產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)量菌落直徑(d)和透明圈(水解圈)(D)直徑,以D/d的數(shù)值大小評(píng)價(jià)菌株產(chǎn)胞外酶活性的強(qiáng)弱[21]。淀粉酶是用新鮮配置的Lugol′s碘液將菌落染色后,觀(guān)察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈(水解圈)進(jìn)行篩選;明膠酶是用50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸處理菌落后,觀(guān)察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈(水解圈)進(jìn)行篩選;纖維素酶和木聚糖酶是用1 mg/mL的剛果紅溶液將菌落染色后,觀(guān)察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈(水解圈)進(jìn)行篩選;酯酶可直接觀(guān)察菌落周?chē)欠癯霈F(xiàn)透明圈(水解圈)進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度指數(shù)分析

本研究選取的LB、TSA、NA、R2A和高氏1號(hào)培養(yǎng)基對(duì)伊犁河流域細(xì)菌的篩選分離結(jié)果有明顯差異(表1)。利用可培養(yǎng)法從伊犁河流域共分離得到225株細(xì)菌,通過(guò)菌落特征和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察,發(fā)現(xiàn)高氏1號(hào)和R2A培養(yǎng)基分離到的菌落數(shù)最多,菌落形態(tài)豐富,其他3種培養(yǎng)基分離到的菌落數(shù)較少,菌落形態(tài)較單一。從5種培養(yǎng)基分離效果來(lái)看,R2A培養(yǎng)基分離得到46株細(xì)菌,分屬于19個(gè)屬,23個(gè)物種,分離效果最好;LB培養(yǎng)基分離得到41株細(xì)菌,分屬于10個(gè)屬,20個(gè)物種,分離效果最差。從5種培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)計(jì)算結(jié)果可知,TSA培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最高,為0.393,LB培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最低,為0.238。

表1 LB、TSA、NA、R2A和高氏1號(hào)5種培養(yǎng)基分離細(xì)菌的多樣性及優(yōu)勢(shì)度指數(shù)Table 1 The diversity and dominant index of isolated bateria on 5 types of different medium (LB, NA, TSA, R2A and Gauze′s No.1 medium)

2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)可培養(yǎng)法共獲得225株細(xì)菌(水樣139株,沉積物86株),其中特克斯河54株,鞏乃斯河62株,喀什河60株,伊犁河干流49株,并分別編號(hào)。對(duì)純化菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定,在BLAST上進(jìn)行序列同源性比對(duì)(表2)。同源比對(duì)結(jié)果表明,225株細(xì)菌分屬于變形菌門(mén)γ亞群(Gamma-pseudomonadota,56.44%)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinomycetota,18.22%)、厚壁菌門(mén)(Bacillota,14.22%)、變形菌門(mén)α亞群(Alpha-pseudomonadota,4.89%)、變形菌門(mén)β亞群(Beta-pseudomonadota,4%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota,0.44%)和異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcota,0.44%)等7個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群。其中假單胞菌屬(Pseudomonas,42.22%)作為優(yōu)勢(shì)屬分離頻率最高,共分離得到95株該屬菌株,分屬于26個(gè)種。其次是芽胞桿菌屬(Bacillus,9.33%),共分離得到21株該屬菌株,分屬于11個(gè)種。不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter,9.33%)第三,共分離得到21株該屬菌株,分屬于6個(gè)種。紅球菌屬(Rhodococcus,4.89%)第四,共分離得到11株該屬菌株,分屬于3個(gè)種。除上述檢出的高頻細(xì)菌外,還分離得到37個(gè)屬的細(xì)菌,包括節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)(8株,3種)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)(7株,3種)、拉思氏菌屬(Rahnella)(7株,1種)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)(4株,2種)、氫噬胞菌屬(Hydrogenophaga)(4株,1種)、假節(jié)桿菌屬(Pseudarthrobacter)(4株,2種)、微桿菌屬(Microbacterium)(3株,2種)、鏈霉菌屬(Streptomyces)(3株,2種)、食酸菌屬(Acidovorax)(2株,1種)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)(2株,1種)、考克氏菌屬(Kocuria)(2株,2種)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)(2株)、血桿菌屬(Sanguibacter)(2株,2種)、鞘脂菌屬(Sphingobium)(2株,1種)、氣單胞菌屬(Aeromonas)(1株,1種)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)(1株,1種)、包西氏菌屬(Bosea)(1株)、Cereibacter(1株,1種)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium(1株,1種)、金黃微桿菌屬(Chryseomicrobium)(1株,1種)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(1株,1種)、短小桿菌屬(Curtobacterium)(1株)、奇異球菌屬(Deinococcus)(1株,1種)、杜搟氏菌屬(Duganella)(1株)、Microcella(1株,1種)、Pararheinheimera(1株,1種)、泥單胞菌屬(Pelomonas)(1株)、游球菌屬(Planococcus)(1株)、游動(dòng)微菌屬(Planomicrobium)(1株,1種)、植物桿菌屬(Plantibacter)(1株,1種)、Proteobacterium(1株)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)(1株)、皺紋單胞菌屬(Rugamonas)(1株,1種)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)(1株)、鞘脂單胞菌屬(Sphingopyxis)(1株,1種)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)(1株,1種)、束毛球菌屬(Trichococcus)(1株,1種)。

對(duì)分離純化的225株細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增片段進(jìn)行序列測(cè)定,在BLAST上進(jìn)行同源比對(duì),根據(jù)菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分析其進(jìn)化關(guān)系(圖1)。結(jié)果表明,可培養(yǎng)細(xì)菌菌株聚類(lèi)于7個(gè)大的分支,變形菌門(mén)為最大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,分屬于變形菌門(mén)α亞群(4.89%)、β亞群(4%)和γ亞群(56.44%),三者聚類(lèi)在進(jìn)化樹(shù)上部的大分枝上,其中變形菌門(mén)γ亞群占分離細(xì)菌多樣性的主要位置。放線(xiàn)菌門(mén)(18.22%)為第二大優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,其次是厚壁菌門(mén)(14.22%)。而擬桿菌門(mén)(0.44%)和異常球菌-棲熱菌門(mén)(0.44%)各自獨(dú)占一個(gè)分類(lèi)單元,分散于進(jìn)化樹(shù)的不同分支上。從分離細(xì)菌菌株分布狀況來(lái)看,特克斯河共分離得到54株細(xì)菌,分屬于變形菌門(mén)γ亞群(46.30%)、放線(xiàn)菌門(mén)(24.07%)、厚壁菌門(mén)(12.96%)、變形菌門(mén)α亞群(7.41%)、變形菌門(mén)β亞群(5.56%)5個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群,22個(gè)屬28個(gè)種。其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬,占特克斯河總分離菌株的40.74%,次之為芽胞桿菌屬占7.41%。鞏乃斯河共分離到62株細(xì)菌,分屬于變形菌門(mén)γ亞群(51.62%)、放線(xiàn)菌門(mén)(19.35%)、厚壁菌門(mén)(14.52%)、變形菌門(mén)β亞群(8.06%)、變形菌門(mén)α亞群(3.23%)和異常球菌-棲熱菌門(mén)(1.61%)6個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群,16個(gè)屬30個(gè)種。其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬,占鞏乃斯河總分離菌株的50%,次之為紅球菌屬和芽胞桿菌屬,兩者均占8.06%?？κ埠庸卜蛛x到60株細(xì)菌,分屬于變形菌門(mén)γ亞群(70%)、放線(xiàn)菌門(mén)(21.66%)、厚壁菌門(mén)(5%)、變形菌門(mén)α亞群(1.67%)和變形菌門(mén)β亞群(1.67%)5個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群,12個(gè)屬25個(gè)種。其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬,占喀什河總分離菌株的38.33%,次之是不動(dòng)桿菌屬,占18.33%。伊犁河干流共分離得到49株細(xì)菌,分屬于變形菌門(mén)γ亞群(57.14%)、厚壁菌門(mén)(26.53%)、變形菌門(mén)α亞群(8.16%)、放線(xiàn)菌門(mén)(6.12%)和擬桿菌門(mén)(2.05%)5個(gè)大的系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)群,11個(gè)屬28個(gè)種。其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬,占伊犁河干流總分離菌株的38.78%,次之是不動(dòng)桿菌屬,占16.33%。

圖1 16S rRNA基因部分序列構(gòu)建的伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic relationships among cultivable bacterial isolates from Ili River Basin based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌分布狀況分析

通過(guò)比較分離菌株的門(mén)水平分布(圖2),可見(jiàn)鞏乃斯河樣品中細(xì)菌所占優(yōu)勢(shì)類(lèi)群以及分離菌株數(shù)量最多,細(xì)菌門(mén)水平占比與伊犁河全流域細(xì)菌分類(lèi)基本保持一致,依次為變形菌門(mén)γ亞群、放線(xiàn)菌門(mén)和厚壁菌門(mén),并且從鞏乃斯河樣品中分離得到了1株異常球菌-棲熱菌門(mén)的細(xì)菌。特克斯河和喀什河樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群基本保持一致,依次為變形菌門(mén)γ亞群、放線(xiàn)菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。樣品中優(yōu)勢(shì)類(lèi)群比例有一定差異,如變形菌門(mén)γ亞群占比升高,其在特克斯河樣品中占46.30%,鞏乃斯河樣品中占51.62%,而喀什河樣品中達(dá)到70%?？κ埠又蟹啪€(xiàn)菌門(mén)占比為21.66%,與特克斯河樣品相比有所降低,與鞏乃斯河和伊犁河全流域樣品相比有所增加。除此之外,喀什河樣品中厚壁菌門(mén)占比最低,僅占5%,而在特克斯河樣品中占12.96%,鞏乃斯河樣品中占14.52%,伊犁河全流域樣品中占14.22%。

圖2 伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌的門(mén)水平分布示意圖Fig.2 Phylum horizontal distribution of cultivable bacteria in Ili River Basin

從伊犁河干流樣品中分離得到的細(xì)菌數(shù)量最少,僅為49株,分別歸屬5大細(xì)菌類(lèi)群,依次為變形菌門(mén)γ亞群、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)α亞群、放線(xiàn)菌門(mén)和擬桿菌門(mén),其細(xì)菌類(lèi)群分布與特克斯河、鞏乃斯河、喀什河以及伊犁河全流域相比有明顯差異,其中變形菌門(mén)γ亞群所占的比例最高,為57.14%,與其他河流樣品基本保持一致。厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)α亞群所占比例最高,例如厚壁菌門(mén)在特克斯河樣品中占12.96%,在鞏乃斯河樣品中占14.52%,在喀什河樣品中占5%,在伊犁河全流域中占14.22%,而在伊犁河干流樣品中占26.53%。變形菌門(mén)α亞群在特克斯河樣品中占7.41%,在鞏乃斯河樣品中占1.61%,在喀什河樣品中占1.67%,在伊犁河全流域中占4%,而在伊犁河干流樣品中占8.16%。放線(xiàn)菌門(mén)所占比例最低,例如放線(xiàn)菌門(mén)在特克斯河樣品中占24.07%,在鞏乃斯河樣品中占19.35%,在喀什河樣品中占21.67%,在伊犁河全流域中占18.22%,而在伊犁河干流樣品中僅占6.12%。除此之外,從伊犁河干流樣品中分離得到1株擬桿菌門(mén)細(xì)菌。與特克斯河、鞏乃斯河和喀什河樣品分離結(jié)果不同,本研究在伊犁河干流未分離到變形菌門(mén)β亞群細(xì)菌。

根據(jù)已純化菌株的測(cè)序結(jié)果,最終將伊犁河全流域分離到的225株細(xì)菌劃分為84個(gè)物種,其中特克斯河28種,鞏乃斯河30種,喀什河25種,伊犁河干流28種(圖3)。由于伊犁河流域三大支流和伊犁河干流地理位置、環(huán)境條件的不同,導(dǎo)致4條河流細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布上差異明顯,僅有Pseudomonaslinyingensis在4條河流樣品中均分離到,多數(shù)菌種為各河流樣品所特有。特克斯河分布的28種細(xì)菌中,與伊犁河干流共有的6種,與鞏乃斯河和喀什河均共有的4種,特克斯河獨(dú)有的菌種19種,占分離細(xì)菌菌種的22.6%。鞏乃斯河分布的30種細(xì)菌中,與特克斯河共有的4種,與喀什河和伊犁河干流均共有的6種,特克斯河獨(dú)有的菌種18種,占分離細(xì)菌菌種的21.4%。喀什河分布的25種細(xì)菌中,與特克斯河共有的4種,與鞏乃斯河共有的6種,與伊犁河干流共有的9種,喀什河獨(dú)有菌種13種,占分離細(xì)菌菌種的15.5%。伊犁河干流分布的28種細(xì)菌中,與喀什河共有的9種外,與特克斯河和鞏乃斯河均共有的6種,伊犁河干流獨(dú)有菌種14種,占分離細(xì)菌菌種的16.7%。上述結(jié)果表明,雖然伊犁河流域三大支流最終匯集成伊犁河干流,但各支流和干流中可培養(yǎng)細(xì)菌地域分布性強(qiáng),不同河流區(qū)域具有獨(dú)特的細(xì)菌菌種分布。

圖3 伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌菌種分布示意圖Fig.3 Venn diagram of cultivable bacterial species distribution in Ili River Basin

2.4 可培養(yǎng)細(xì)菌胞外酶活性測(cè)定

從伊犁河全流域的特克斯河、鞏乃斯河、喀什河和伊犁河干流共分離得到225株細(xì)菌,隸屬于七大細(xì)菌發(fā)育類(lèi)群,41個(gè)屬84個(gè)種。為深入挖掘伊犁河流域潛在的菌種資源,對(duì)已測(cè)序菌株進(jìn)行了胞外酶活性檢測(cè)(表3),結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有淀粉酶活性的細(xì)菌共有89株,占比39.56%;能夠降解吐溫-60的細(xì)菌共有130株,占比57.78%;具有明膠酶活性的細(xì)菌共有91株,占比40.44%;具有纖維素酶活性的細(xì)菌共有54株,占比24%;具有木聚糖酶活性的細(xì)菌共有9株,占比4%。其次,225株細(xì)菌中具有2種及以上酶活性的菌株共113株,占總分離菌株的50.22%,其中假單胞菌屬作為優(yōu)勢(shì)屬,共56株,占比49.56%,芽胞桿菌屬15株,占比13.27%。優(yōu)勢(shì)種為Pseudomonaskunmingensis,該菌種有8株具有2種及以上酶活性。初步表明伊犁河流域河流微生物具有較廣泛降解大分子物質(zhì)的能力。

從上述潛在功能菌株的篩選培養(yǎng)基來(lái)源分析(表4)的結(jié)果發(fā)現(xiàn),TSA培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基獲得潛在功能菌株的數(shù)量最多,含有2種及以上酶活性的菌株在TSA培養(yǎng)基中占比高達(dá)68.89%,其次是NA培養(yǎng)基,占比68.18%。而R2A培養(yǎng)基和高氏1號(hào)培養(yǎng)基獲得潛在功能菌株數(shù)量最低,其中R2A培養(yǎng)基中含有2種及以上酶活性的菌株占比僅30.43%。除此之外,從上述潛在功能菌株的空間分布來(lái)看,特克斯河含有2種及以上酶活性的菌株數(shù)量最高,占比61.11%。喀什河含有2種及以上酶活性的菌株數(shù)量最低,占比43.33%。伊犁河干流相較其他三條河流,水樣中具有2種及以上酶活性的菌株占比最低,為28.57%,而沉積物中具有2種及以上酶活性的菌株占比最高,為67.86%。

表4 不同樣點(diǎn)和培養(yǎng)基中具有胞外酶活性菌株的分布Table 4 Distribution of strains with extracellular enzyme activity in different sample points and medium

3 討 論

對(duì)比高通量測(cè)序技術(shù)(High throughput sequencing,HTS),梯度稀釋加平板涂布的可培養(yǎng)法仍然是分離和獲取環(huán)境樣品中微生物菌種資源最簡(jiǎn)單有效的方法之一。基于細(xì)菌16S rRNA基因分析的HTS技術(shù)雖然可以進(jìn)行特殊基因和生態(tài)功能層面的深入研究,但并不能獲取細(xì)菌菌種資源,以及分辨特殊近源菌種的毒性強(qiáng)弱[22-24]。本研究利用5種培養(yǎng)基對(duì)伊犁河流域水體和沉積物中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了分離純化。結(jié)果表明,不同培養(yǎng)基分離純化伊犁河可培養(yǎng)細(xì)菌類(lèi)群差異明顯,其中R2A培養(yǎng)基分離得到19個(gè)屬的細(xì)菌,分離效果最好。而TSA培養(yǎng)基分離得到33個(gè)種的細(xì)菌,培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)度指數(shù)最高。除此之外,結(jié)合胞外酶活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)含有2種及以上酶活性的菌株在TSA培養(yǎng)基中占比最高,而R2A培養(yǎng)基占比最低?？膳囵B(yǎng)法雖然不能完整體現(xiàn)環(huán)境樣本中真實(shí)微生物菌群結(jié)構(gòu),但運(yùn)用多種不同類(lèi)型培養(yǎng)基能部分彌補(bǔ)菌群結(jié)構(gòu)的偏差,為進(jìn)一步研究該流域細(xì)菌生理和生態(tài)功能提供菌種資源。

伊犁河流域可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性較為豐富,分離菌株經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),225株細(xì)菌歸屬于變形菌門(mén)γ亞群(Gamma-pseudomonadota,56.44%)、放線(xiàn)菌門(mén)(18.22%)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes,14.22%)等七大細(xì)菌發(fā)育類(lèi)群,共41個(gè)屬84個(gè)種。其中變形菌門(mén)γ亞群和放線(xiàn)菌門(mén)為伊犁河流域中的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和芽胞桿菌屬(Bacillus)。比較特克斯河、鞏乃斯河、喀什河和伊犁河干流細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),三大支流細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)大致相同,優(yōu)勢(shì)類(lèi)群依次為變形菌門(mén)γ亞群、放線(xiàn)菌門(mén)和厚壁菌門(mén),與伊犁河全流域中優(yōu)勢(shì)類(lèi)群一致。其中鞏乃斯河分離到的細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)最多,并且分離到了1株異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcota)的細(xì)菌。而伊犁河干流分離到的細(xì)菌數(shù)量和種類(lèi)較少,其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群中厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)α亞群(Alpha-pseudomonadota)比例上升明顯。已有研究報(bào)道,厚壁菌門(mén)在長(zhǎng)期工業(yè)污染的城市河流的細(xì)菌群落中為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群[25-26]。對(duì)比同處新疆高海拔地區(qū)的開(kāi)都河細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布,變形菌門(mén)α亞群也是其優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,并隨地理距離的增加而增加[14]。其次,從分離細(xì)菌菌種的分布情況來(lái)看,特克斯河、鞏乃斯河、喀什河三條支流與伊犁河干流菌落構(gòu)成差異明顯,4條河流共有菌種只有Pseudomonaslinyingensis。4條河流彼此間共有菌種最多為9種,為喀什河和伊犁河干流所共有?？κ埠又Я髋c特克斯河和鞏乃斯河形成的伊犁河匯合形成伊犁河干流,兩者屬于流域環(huán)境過(guò)渡區(qū),細(xì)菌菌種構(gòu)成有部分重疊。但4條河流共有菌種數(shù)遠(yuǎn)低于每條河流獨(dú)有菌種數(shù),表明伊犁河流域細(xì)菌菌種的地域分布性強(qiáng),不同河流具有各自不同的細(xì)菌菌種分布。

細(xì)菌胞外酶在大分子量聚合物降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用,異養(yǎng)細(xì)菌通過(guò)胞外酶將水環(huán)境中的高聚有機(jī)物降解,作為菌株主要碳源和能量來(lái)源加以利用[27-28]。本研究選取五種胞外酶檢測(cè)培養(yǎng)基檢測(cè)分離菌株的胞外酶活性,結(jié)果表明,伊犁河流域細(xì)菌降解吐溫-60的酯酶、明膠酶和淀粉酶活性較好,木聚糖酶活性較差。胞外酶活性?xún)?yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬和芽胞桿菌屬,其中由于其營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單,適應(yīng)力強(qiáng)等特征在自然界中普遍存在,并且經(jīng)常發(fā)現(xiàn)具有降解復(fù)雜有機(jī)物能力的菌株[29-31]。其中,菌株YL-215(OK147810)含有5種胞外酶活性;菌株YL-89(OK135823)與菌株YL-4(OK136188)的標(biāo)準(zhǔn)菌株相似性<98%,為潛在新種,且含有多種胞外酶活性,值得進(jìn)一步深入研究。由伊犁河流域水體和沉積物分離的菌株一半以上(50.22%)具備至少2種胞外水解酶活性,表明該流域細(xì)菌的生態(tài)營(yíng)養(yǎng)多功能性較高,部分菌株可作為潛在可用種質(zhì)資源在河流水質(zhì)凈化及水質(zhì)檢測(cè)方面發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)可培養(yǎng)法對(duì)伊犁河流域細(xì)菌群落進(jìn)行了分析,伊犁河全流域的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性較豐富,分離得到的225株細(xì)菌歸屬于七大細(xì)菌類(lèi)群,41個(gè)屬84個(gè)種?？膳囵B(yǎng)細(xì)菌菌種具有地域分布性強(qiáng)的特點(diǎn)。分離細(xì)菌的產(chǎn)胞外酶活性比例較高,具備2種及以上胞外水解酶活性菌株占比達(dá)50.22%。運(yùn)用5種通用培養(yǎng)基獲得了伊犁河流域部分易培養(yǎng)細(xì)菌多樣性信息,后續(xù)研究可運(yùn)用高通量測(cè)序等技術(shù)全面分析該流域微生物群落結(jié)構(gòu),設(shè)置不同培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式,進(jìn)一步挖掘該流域珍稀菌種資源,為伊犁河流域微生物資源的開(kāi)發(fā)和利用提供前期參考。