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    山楂食用酵素抗氧化及對(duì)脂肪酶活性

    2021-11-25 09:33:42聶俊蓮蘇嘉燁張存莉
    食品工業(yè) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:原液酵素脂肪酶

    聶俊蓮,蘇嘉燁,張存莉

    1.西北農(nóng)林科技大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院(楊凌 712100);2.陜西五丁生物科技有限公司,漢中市食用植物酵素研發(fā)與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧強(qiáng) 724400)

    食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料,添加或不添加輔料,經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人類食用的酵素產(chǎn)品[1],2019年被國(guó)家發(fā)改委列入《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》鼓勵(lì)類產(chǎn)業(yè)。但目前社會(huì)上對(duì)酵素產(chǎn)品爭(zhēng)議較大,褒貶不一。山楂(Crataegus pinnatifidaBunge)為薔薇科植物山里紅或山楂的干燥成熟果實(shí),其含有豐富的黃酮、多糖、酚和有機(jī)酸等化合物,具有顯著的降脂減肥、降血糖、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化等作用[2-6],目前國(guó)內(nèi)對(duì)山楂酵素的研究多集中于發(fā)酵工藝研究[7-9]。因此,此次試驗(yàn)以山楂為原料,采用多菌種混合發(fā)酵,探究山楂發(fā)酵前后的抗氧化和對(duì)胰脂肪酶的活性作用,以期為山楂資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    山楂,市售;葡萄酒高活性干酵母,安琪酵母有限公司產(chǎn)品;乳酸菌(植物乳桿菌),臺(tái)灣亞芯生物科技有限公司;醋酸菌,滬釀1.01號(hào)醋酸菌,上海佳民釀造食品有限公司;纖維素酶,廣東永信食品配料有限公司;脂肪酶、磷酸氫二鈉(分析純)、磷酸二氫鈉(分析純)、DPPH(分析純)、ABTS(分析純)、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;水楊酸(分析純),天津市天力化學(xué)試劑有限公司;七水合硫酸亞鐵(分析純),廣東光華科技股份有限公司;橄欖油(分析純)、聚乙烯醇(分析純)、95%乙醇(分析純),上海麥克林生化科技有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    UV-1801型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠);SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);DHP-9052B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);BPG-9056A型精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);ME204E/02型精密和分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 試驗(yàn)材料

    山楂酵素:取500 g山楂,按適當(dāng)比例加水,取纖維素酶酶解后的山楂漿,將活化好的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌先后接種到待發(fā)酵液中,發(fā)酵90 d左右。

    1.3.2 有效成分的測(cè)定

    1.3.2.1 黃酮的測(cè)定

    以空白試劑為對(duì)照,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁濃度X與吸光度Y間的回歸方程為Y=11.391X+0.006 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

    精密吸取2.0 mL樣品溶液,置于10 mL具塞試管中,加入0.3 mL 5% NaNO2溶液,反應(yīng)6 min,再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液,搖勻,反應(yīng)6 min,再加4 mL 1 mol/L NaOH溶液終止反應(yīng),最后加入50%乙醇至10 mL,搖勻,以空白試劑為對(duì)照,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總黃酮的濃度[10]。

    1.3.2.2 粗多糖的測(cè)定

    以空白試劑為對(duì)照,在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度葡萄糖吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)Y,以對(duì)照品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X,做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程Y=38.658X-0.002 4,相關(guān)系數(shù)為0.999 6。

    精密吸取1.0 mL樣品溶液,置于10 mL具塞試管中,加入4 mL蒽酮試劑(0.2 g蒽酮溶于100 mL濃H2SO4),迅速置于冰水浴中冷卻。待各管加完后一起浸于沸水中煮沸10 min,取出后用流水冷卻,室溫放置10 min,搖勻,以空白試劑為對(duì)照,在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多糖的含量[11]。

    1.3.2.3 多酚的測(cè)定

    按照GB/T 8313—2018[12]中規(guī)定的茶多酚的檢測(cè)方法測(cè)定。以空白試劑為對(duì)照,在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液吸光度,以吸光度(A)為縱坐標(biāo)Y,以對(duì)照品取樣量(mg)為橫坐標(biāo)X,進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程Y=0.001 6X+0.007 6,相關(guān)系數(shù)為0.999 1。

    精密吸取1 mL樣品溶液,置于10 mL具塞試管中,加5 mL 10%福林酚試劑,搖勻。反應(yīng)3~8 min內(nèi),加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,搖勻,室溫下放置60 min,以空白試劑為對(duì)照,在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中多酚的濃度。

    1.3.2.4 總酸的測(cè)定

    按GB/T 12456—2008[13]酸堿滴定法測(cè)定發(fā)酵液中總酸濃度。

    1.3.3 抗氧化活性研究

    1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

    參考You等[14]的方法,準(zhǔn)確配制4×10-4mol/L的DPPH溶液,置于冰箱內(nèi)冷凍避光保存。將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋,分別按5%,10%,15%,20%,25%和30%的體積分?jǐn)?shù)加水稀釋,制備不同體積濃度的樣液。取0.5 mL樣液,準(zhǔn)確加入3 mL DPPH溶液,充分混勻后在避光的環(huán)境下放置30 min后,在517 nm條件下測(cè)定吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定0.5 mL樣液與3 mL無水乙醇混合液的吸光度Aj,以及無水乙醇0.5 mL與3 mL DPPH溶液混合液的吸光度A0。按式(1)計(jì)算。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:依次配制50,100,150,200和250 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照上述樣品測(cè)定方法測(cè)定吸光度,以VC濃度為橫坐標(biāo),清除率縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,VC質(zhì)量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.003 8X+0.035 8,相關(guān)系數(shù)為0.991 4。

    1.3.3.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定

    參考閆亞美等[15]的方法,準(zhǔn)確稱取0.038 4 g的ABTS自由基和0.013 4 g的過硫酸鉀樣品,分別用純水定容至10 mL;之后按照1∶1混合均勻避光保存12 h,形成ABTS+工作液,使用前純水稀釋10倍。將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋,分別按5%,10%,15%,20%,25%和30%的體積濃度加水稀釋,制備不同體積濃度的樣液。在樣品管中加入200 μL稀釋好的樣液和3 mL ABTS+溶液靜置6 min,在734 nm處測(cè)定溶液的吸光度Ai。同時(shí)測(cè)定200 μL樣品液和3 mL超純水的吸光度Aj,以及200 μL蒸餾水和3 mL ABTS混合溶液的吸光度A0。按式(2)計(jì)算。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:依次配制50,100,150,200和250 μg/mL的VC標(biāo)準(zhǔn)液,按照上述樣品測(cè)定方法測(cè)定A值,以VC濃度為橫坐標(biāo),清除率為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,VC質(zhì)量濃度X與清除率Y間的回歸方程為Y=0.004X-0.033 6,相關(guān)系數(shù)為0.995 8。

    1.3.3.3 總抗氧化能力測(cè)定

    依據(jù)北京索萊寶科技有限公司總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒說明書,稍加改動(dòng),首先將體積分?jǐn)?shù)100%的山楂果醋,分別按5%,10%,15%,20%,25%和30%的體積濃度加水稀釋,制備不同體積濃度的樣液。按照試劑盒規(guī)定的方法測(cè)定593 nm處的吸光度,計(jì)算ΔA=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。以Fe2+濃度為橫坐標(biāo)X,ΔA為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性方程Y=11.186X-0.080 2,將A樣品帶入方程求得X(μmol/mL)。則總抗氧化能力(μmol/mL)按式(3)計(jì)算。

    式中:X為Fe2+濃度,μmol/mL;V反總為反應(yīng)總體積,1.02 mL;V樣為反應(yīng)中樣本體積,0.03 mL。

    1.3.4 胰脂肪酶活性測(cè)定

    參考祁靜等[16]的方法,在干凈錐形瓶中準(zhǔn)確移入8 mL橄欖油乳液、5 mL 0.1 mol/L pH 7.2的PBS緩沖液,然后分別準(zhǔn)確移入3 mL提前調(diào)至pH 7.2的山楂果醋,置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢杈鶆?,最后?zhǔn)確移入1 mL 0.20 mg/mL的胰脂肪酶液,再次充分?jǐn)嚢杈鶆?。將上述反?yīng)液置于37 ℃下的恒溫培養(yǎng)振蕩器中反應(yīng)1.5 h,然后加入15 mL 95%乙醇終止酶反應(yīng)。于反應(yīng)液中滴加2滴酚酞指示劑,使用0.02 mol/L NaOH滴定體系中產(chǎn)生的脂肪酸量。

    對(duì)胰脂肪酶的活性進(jìn)行檢測(cè),平行試驗(yàn)3次,胰脂肪酶的酶活計(jì)算采用胰脂肪酶的活力測(cè)定公式(4),胰脂肪酶的活性抑制率計(jì)算公式如式(5)所示。

    式中:X為樣品的酶活,μmol/(min·mg);V1為滴定樣品時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V2為滴定空白時(shí)消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;CNaOH為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;t為反應(yīng)時(shí)間,min;C酶為胰脂肪酶的質(zhì)量濃度,mg/mL;V酶為胰脂肪酶的添加體積,mL。

    式中:抑制率為胰脂肪酶的活性抑制率,%;X1為對(duì)照組酶活,μmol/(min·mg);X2為樣品組酶活,μmol/(min·mg)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 有效成分變化

    山楂發(fā)酵前后有效成分變化如圖1所示。

    圖1 山楂發(fā)酵前后有效成分含量變化

    由圖1可知:山楂原液中黃酮、多酚、粗多糖和總酸質(zhì)量濃度分別為4.5,4.7,14.6和10.4 mg/mL;山楂酵素中它們的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.4,6.7,13.7和36 mg/mL,其中黃酮、多酚、總酸濃度分別提高了64%,43%和246%。

    2.2 抗氧化性結(jié)果分析

    將不同體積分?jǐn)?shù)(5%~30%)的山楂原液和山楂酵素進(jìn)行清除DPPH、ABTS清除率和總抗氧化能力進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如圖2所示。

    由圖2(A)可知,不同體積分?jǐn)?shù)山楂原液和酵素對(duì)DPPH清除率均呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢(shì),當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為5%和10%時(shí),酵素的清除率高于原液,當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí)二者的清除率相差不大,在95%和97%左右,原液和酵素分別相當(dāng)于241和246 μg/mL VC的清除作用。說明山楂本身含有的有效成分和微生物發(fā)酵產(chǎn)生的代謝物對(duì)DPPH自由基的清除具有顯著作用,經(jīng)發(fā)酵后清除作用增強(qiáng),隨著體積分?jǐn)?shù)增加,兩者清除作用趨于一致,由此可以看出發(fā)酵引起的成分變化對(duì)DPPH自由基影響不大。

    由圖2(B)可知,體積分?jǐn)?shù)在5%~30%區(qū)間內(nèi),山楂原液對(duì)ABTS自由基的清除率低于酵素,原液在25%~30%區(qū)間逐漸平穩(wěn),清除率在85%左右,而酵素在20%時(shí)對(duì)ABTS的清除率達(dá)到最大值(99%左右),原液和酵素分別相當(dāng)于221和250 μg/mL左右VC的清除作用。說明微生物發(fā)酵后引起營(yíng)養(yǎng)成分變化,產(chǎn)生的代謝物在清除ABTS自由基方面優(yōu)于原液,且不會(huì)隨酵素體積分?jǐn)?shù)增加而變化。

    由圖2(C)可知,在5%~30%范圍內(nèi),山楂原液和酵素總抗氧化能力整體均呈逐漸上升趨勢(shì),且酵素的總抗氧化能力明顯高于原液。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為30%時(shí),山楂原液和酵素的總抗氧化性分別為6.9和8.8 μmol/mL,酵素的總抗氧化性高于原液。說明微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的成分變化對(duì)總抗氧化能力T-AOC值影響顯著,山楂經(jīng)過多菌種發(fā)酵更有利于山楂中抗氧化活性成分的保持且隨著體積分?jǐn)?shù)的增加對(duì)總抗氧化能力的影響逐漸增大。

    圖2 山楂原液和山楂酵素對(duì)DPPH自由基(A)、ABTS自由基(B)清除率和總抗氧化能力(C)

    2.3 山楂酵素對(duì)脂肪酶活性測(cè)定結(jié)果分析

    山楂原液和山楂酵素對(duì)脂肪酶活性研究如圖3所示。

    圖3 山楂酵素和山楂原液對(duì)脂肪酶抑制率

    由圖3可知,山楂酵素和原液均對(duì)脂肪酶有抑制作用,山楂酵素、原液對(duì)脂肪酶的抑制率分別為71.2%和64.7%,酵素的抑制率高于原液,說明經(jīng)混合菌種發(fā)酵后,產(chǎn)生的成分變化和代謝物能夠促進(jìn)對(duì)脂肪酶的抑制作用,提高對(duì)脂肪酶的抑制率。

    3 結(jié)論與討論

    研究結(jié)果表明:山楂酵素中黃酮、多酚、總酸濃度分別比原液提高了64%,43%和246%,對(duì)DPPH、ABTS自由基清除率、總抗氧化能力和體外對(duì)脂肪酶抑制率分別提高了2%,16.5%,27.5%和246%,差異顯著,表明山楂酵素的抗氧化能力和對(duì)脂肪酶抑制活性優(yōu)于山楂原液,與相關(guān)研究結(jié)論一致[17-19]。

    酵素產(chǎn)品中主要有機(jī)酸為乳酸、乙酸、蘋果酸等[20],山楂酵素總酸含量大幅上升的原因是體系中的酵母菌、乳酸菌利用可發(fā)酵的碳水化合物,轉(zhuǎn)化成乙醇和乳酸,醋酸菌利用體系中的乙醇將其轉(zhuǎn)化成乙酸;另外山楂本身也含有大量有機(jī)酸,隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),有機(jī)酸逐漸溶出;山楂酵素黃酮類物質(zhì)含量上升的原因,可能是由于:①酵母菌發(fā)酵過程中能產(chǎn)生果膠酶;②前處理過程中加入纖維素酶,二者可破壞植物細(xì)胞壁,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)溶出[21-22]。酚類化合物含量上升,可能是由于乳酸菌產(chǎn)生的酶及有機(jī)酸能增加發(fā)酵液中的總酚含量,酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的混菌體系在飲料發(fā)酵過程中可將大分子酚類物質(zhì)降解成小分子酚類物質(zhì)[23-24];山楂發(fā)酵后,抗氧化活性明顯增強(qiáng),可能是黃酮和多酚類物質(zhì)含量增加的原因,與相關(guān)研究一致[25]。對(duì)脂肪酶活性抑制增加,可能是體系中的黃酮類以及乙酸[26]、乳酸[27]等物質(zhì)含量增加所致,因?yàn)槿呔哂酗@著調(diào)節(jié)血脂的功效[28]。相比山楂原液,山楂酵素的抗氧化能力增強(qiáng),可以降低氧化應(yīng)激反應(yīng),從而對(duì)肥胖、高血脂和糖尿病等代謝綜合征產(chǎn)生一定防治作用;抑制胰脂肪酶活性,可有效抑制脂質(zhì)代謝過程,降低人體對(duì)膳食脂肪的消化率和代謝產(chǎn)物的吸收率,從而控制血漿脂原濃度的升高,達(dá)到降血脂的功效[17],這可能也就是2019年國(guó)家將食用酵素列為《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》鼓勵(lì)類產(chǎn)業(yè)原因之一。

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