栽培基質(zhì)中發(fā)酵羊糞濃度對(duì)靈芝多糖含量的影響

楊鄭州，謝曉娜*

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000；2.廣西芒果生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西百色 533000；3.亞熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣西百色 533000）

靈芝為多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體，是我國(guó)醫(yī)學(xué)寶庫(kù)中一種珍貴的食藥用菌[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，靈芝具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、治療心腦血管疾病及抗衰老等功效[2]。靈芝含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性成分。研究表明靈芝的主要生理活性成分有靈芝多糖、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、多肽、核苷類、呋喃類、甾醇、生物堿和氨基酸等[3-4]，其中的靈芝多糖、三萜類化合物是靈芝的主要活性成分。賈少杰等采用響應(yīng)面分析方法對(duì)微波輔助法提取靈芝多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)研究靈芝多糖抑菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn)靈芝多糖對(duì)5 種供試菌均表現(xiàn)出抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用明顯[5]。羊糞含有豐富的有機(jī)質(zhì)和N、P、K 等元素，混合一定的輔料發(fā)酵之后是生產(chǎn)食用菌的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)料[6]。近年來靈芝人工栽培已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，但對(duì)生物有機(jī)肥基質(zhì)栽培靈芝的研究卻少見報(bào)道。以赤靈芝為材料，初步研究發(fā)酵羊糞栽培基質(zhì)中靈芝多糖含量的變化，對(duì)羊糞資源的循環(huán)利用及靈芝培養(yǎng)基異源基質(zhì)材料的探究具有創(chuàng)新意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌種為赤靈芝，由百色學(xué)院農(nóng)學(xué)院食用菌基地提供。發(fā)酵羊糞由山東豐潤(rùn)農(nóng)資有限公司提供。培養(yǎng)基材料由桉木屑、雜木屑、羊糞、石膏、麥麩、石灰粉等組成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 栽培料配方

以赤靈芝為研究對(duì)象，設(shè)置5 組不同羊糞添加濃度的配方（詳見表1）。靈芝栽培方法為袋料栽培，選用聚乙烯塑料袋填料，每個(gè)配方8袋，3次重復(fù)。于高壓滅菌鍋中121 ℃條件下滅菌2 h，冷卻至室溫，于超凈工作臺(tái)進(jìn)行接種，在溫度26～28 ℃、濕度60%～65%、避光條件下培養(yǎng)，菌絲滿袋后開袋出芝并移至大棚，保持溫度26～28 ℃、濕度85%～90%。每袋子實(shí)體僅留存最健壯的一個(gè)，當(dāng)菌袋干癟養(yǎng)料耗盡，子實(shí)體菌蓋整體呈褐色時(shí)，采收子實(shí)體。

表1 靈芝栽培料配方 單位：%

1.2.2 羊糞有機(jī)質(zhì)及總養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

1）羊糞有機(jī)質(zhì)的測(cè)定。用定量的重鉻酸鉀-硫酸溶液，在加熱條件下，使有機(jī)肥料中的有機(jī)碳氧化，多余的重鉻酸鉀用硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，同時(shí)以二氧化硅為添加物作空白試驗(yàn)。根據(jù)氧化前后氧化劑耗量，計(jì)算有機(jī)碳含量，乘以系數(shù)1.724，為有機(jī)質(zhì)含量[7]。

2）羊糞總養(yǎng)分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定（N+P2O5+K2O）。總氮的測(cè)定：有機(jī)肥中的有機(jī)氮經(jīng)過硫酸-過氧化氫消煮，轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮。堿化后蒸餾出來的氨，用硼酸溶液吸收，以標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定，計(jì)算樣品中總氮含量[7]。磷含量測(cè)定：有機(jī)肥試樣采用硫酸和過氧化氫消煮，在一定酸度下，待測(cè)液中的硫酸根離子與偏釩酸和鉬酸反應(yīng)生成黃色三元雜多酸。在一定濃度范圍內(nèi)，黃色溶液的吸光度與磷含量呈正比例關(guān)系，用分光光度法測(cè)定磷含量[7]。鉀含量測(cè)定：有機(jī)肥料試樣經(jīng)過硫酸和過氧化氫消煮，稀釋后用火焰光度法測(cè)定。在一定濃度范圍，溶液中鉀濃度與發(fā)射強(qiáng)度成正比例關(guān)系[7]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.3 超聲波法提取靈芝多糖

采收不同配方的靈芝子實(shí)體粉碎成末。稱取1.0 g過20 mm 孔徑篩的樣品粉末，置于50 mL 具塞離心管內(nèi)，用5 mL 水浸潤(rùn)樣品，加入20 mL 無水乙醇，震蕩搖勻，置于超聲波清洗機(jī)中于120 W、60 ℃條件下提取30 min，提取結(jié)束后，于4 000 r·min-1離心10 min棄去上清液，不溶物用10 mL 乙醇溶液（80%）洗滌、離心。用水將上述不溶物轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加入50 mL水，于120 W、60 ℃下超聲提取30 min，重復(fù)2 次。冷卻至室溫，過濾，將上清液轉(zhuǎn)移至200 mL 容量瓶中，殘?jiān)礈?～3 次，洗滌液轉(zhuǎn)至容量瓶，加水定容。此溶液為樣品待測(cè)液。如多糖含量較高，可適當(dāng)稀釋后進(jìn)行分析測(cè)定。

1.2.4 苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量

糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長(zhǎng)490 nm 處和一定的濃度范圍內(nèi)，其吸光度與多糖含量呈線性關(guān)系，利用分光度計(jì)測(cè)定其吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的多糖含量[16]。具體試劑配制、試驗(yàn)步驟及多糖含量計(jì)算方法參考《SN/T 4260-2015 出口植物源食品中粗多糖的測(cè)定苯酚-硫酸法》。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊糞質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

由表2 可知試驗(yàn)所用發(fā)酵羊糞肥料中，有機(jī)質(zhì)含量最高，鉀含量其次，磷含量較低，氮含量最低。羊糞中含有豐富的有機(jī)質(zhì)，在靈芝栽培過程中主要為靈芝生長(zhǎng)提供碳源。碳源是提供食用菌生長(zhǎng)發(fā)育碳素的重要營(yíng)養(yǎng)來源。食用菌吸收的碳約有20%被用來合成細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中的碳架結(jié)構(gòu)，80%被用來維持生命活動(dòng)所需的能量[8]。因此，利用發(fā)酵羊糞栽培靈芝不失為一種好的羊糞資源的無害化處理方式。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證 單位：%

2.2 不同羊糞添加濃度下靈芝菌袋污染率比較

據(jù)表3 可知，隨著發(fā)酵羊糞在栽培基質(zhì)中的占比越來越大，菌袋污染率也隨之升高，由此推測(cè)羊糞添加量與菌袋污染率呈正相關(guān)。在羊糞添加量為0%時(shí)，菌袋污染率僅為8.33%；而在靈芝栽培基質(zhì)中羊糞含量占比達(dá)45%時(shí)，菌袋污染率高達(dá)62.5%。造成這種趨勢(shì)的原因是靈芝菌絲無法充分分解羊糞中的養(yǎng)分，而一些霉菌微生物適應(yīng)性強(qiáng)，添加羊糞使其競(jìng)爭(zhēng)力大大提高，抑制了靈芝菌絲生長(zhǎng)，造成菌袋污染。

表3 不同羊糞添加濃度下靈芝菌袋污染率統(tǒng)計(jì)

2.3 不同羊糞添加濃度下菌絲生長(zhǎng)速度比較

利用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。據(jù)表4 可知，不同羊糞添加量下的靈芝菌絲生長(zhǎng)速度差異極顯著（p<0.01）；10%試驗(yàn)組、20%試驗(yàn)組、30%試驗(yàn)組菌絲生長(zhǎng)速度與對(duì)照組之間差異極顯著（p<0.01），45% 試驗(yàn)組與對(duì)照組無顯著差異（p＞0.05）。表明隨著羊糞添加量的增加，靈芝菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。羊糞添加量在0%～20%之間，菌絲生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；羊糞添加量大于20%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度顯著下降。當(dāng)羊糞添加量為20%時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度達(dá)到最大；10%試驗(yàn)組和30%試驗(yàn)組菌絲生長(zhǎng)速度相近，僅次于20%試驗(yàn)組。30%試驗(yàn)組和45%試驗(yàn)組菌絲生長(zhǎng)速度下降的原因可能是培養(yǎng)料中羊糞作為碳源占比過大導(dǎo)致料內(nèi)碳氮比不適宜靈芝菌絲生長(zhǎng)，菌絲體活性下降，分解養(yǎng)分能力不足。

表4 不同羊糞添加濃度下菌絲生長(zhǎng)速度比較

2.4 不同羊糞添加濃度下靈芝的多糖含量比較

利用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。據(jù)表5 可知，不同配方所得靈芝子實(shí)體的多糖含量差異極顯著（p<0.01）；同一配方下所得樣品的多糖含量無顯著差異。10%試驗(yàn)組、45%試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品之間的多糖含量無顯著差異；20%試驗(yàn)組、30%試驗(yàn)組與其他各組樣品的多糖含量差異極顯著（p<0.01）。隨著羊糞添加劑量的升高，樣品的多糖含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且差異極顯著（p<0.01），其中20%試驗(yàn)組中樣品多糖含量最高，30%試驗(yàn)組次之。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵羊糞中含有豐富的有機(jī)質(zhì)，可作為靈芝生長(zhǎng)的碳源；此外羊糞含有豐富的有機(jī)質(zhì)和N、P、K 等元素，混合一定的輔料發(fā)酵之后是生產(chǎn)食用菌的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)料。本次研究結(jié)果還表明發(fā)酵羊糞添加量與菌袋污染率呈正相關(guān)；對(duì)照組與20%、30%試驗(yàn)組的菌絲生長(zhǎng)速度、樣品多糖含量均存在極顯著差異（p<0.01）；20%試驗(yàn)組所得靈芝的菌絲生長(zhǎng)速度、多糖含量最大。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可以添加較低劑量的發(fā)酵羊糞(20%～30%)來改良靈芝培養(yǎng)基，提高靈芝品質(zhì)。此外，培養(yǎng)過程中也要保持環(huán)境嚴(yán)格無菌，將菌袋污染率控制在合理范圍內(nèi)，以降低生產(chǎn)材料的耗損率。在靈芝菌絲生長(zhǎng)過程中，保持一定的溫度、濕度，及時(shí)補(bǔ)水、通風(fēng)，適當(dāng)添加一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)料內(nèi)碳氮比，可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，縮短靈芝生長(zhǎng)周期，達(dá)到增產(chǎn)的目的。利用畜禽糞便和農(nóng)作物秸稈等栽培食用菌不僅是對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用，而且生產(chǎn)出高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益的食用菌，栽培后的菌渣還能還田作肥料，真正實(shí)現(xiàn)了資源的多層次循環(huán)利用。

隨著近年來農(nóng)牧業(yè)的迅速發(fā)展，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)逐漸增多，如何解決羊糞堆積、防止環(huán)境污染，保證人畜健康已成為養(yǎng)殖者面臨的重大問題。據(jù)報(bào)道羊糞含有有機(jī)質(zhì)24%～27%、氮0.7%～0.8%、磷0.45%～0.6%、鉀0.4%～0.5%。羊糞的有機(jī)質(zhì)含量比其他畜糞多，糞質(zhì)較細(xì)，肥分濃厚[8]。試驗(yàn)所購(gòu)羊糞的有機(jī)質(zhì)含量略低于上述報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)，總氮含量低于報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)，磷含量和鉀含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出報(bào)道標(biāo)準(zhǔn)。形成這種差異的原因可能在于所使用的羊糞來源不同，如羊的品種、產(chǎn)地、所喂食料的不同均有可能造成羊糞養(yǎng)分含量的差異。也有可能是羊糞發(fā)酵過程中有機(jī)質(zhì)養(yǎng)分被某些微生物所利用，導(dǎo)致一定量的損耗和流失。劉大徹等用羊糞培育金針菇，結(jié)果顯示袋栽金針菇比瓶栽產(chǎn)量高[9]。任愛民研究發(fā)現(xiàn)用麥草羊糞培養(yǎng)料栽培雙孢蘑菇具有出菇早、產(chǎn)量高、品質(zhì)好的優(yōu)點(diǎn)[10]。毛偉娟利用牛糞和大蒜秸稈等農(nóng)村固體廢棄物生產(chǎn)食用菌，1 m2菇床可生產(chǎn)8 kg 雙孢蘑菇[11]。雅梅用干羊糞和禾草堆肥發(fā)酵制作菌菇培養(yǎng)料，因羊糞中含有一些殺菌物質(zhì)，與其他糞肥發(fā)酵制作的培養(yǎng)基相比較，羊糞培養(yǎng)料污染和生蟲的概率更低[12]。為明確蟹味菇菌渣的堆肥效果，明晰菌渣與豬糞、羊糞、稻草等原料在堆肥過程中的碳氮轉(zhuǎn)化效率和損失，干瑩瑩等按濕質(zhì)量比設(shè)菌渣、菌渣與豬糞、菌渣與羊糞進(jìn)行堆肥試驗(yàn)，結(jié)果顯示純菌渣堆肥后有機(jī)肥總養(yǎng)分含量高，但產(chǎn)出量較低，發(fā)酵過程中碳氮損失多，相對(duì)于豬糞，羊糞的C/N 高，養(yǎng)分含量低[13]。梁明勤等報(bào)道用杏鮑菇菌糠和玉米芯為主料，麩皮、石膏和過磷酸鈣為輔料，添加不同比例的豬糞沼液栽培平菇1618，結(jié)果表明其菌絲生長(zhǎng)速度顯著高于CK，菌絲長(zhǎng)勢(shì)也好于CK[14]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，早在2000年國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖所產(chǎn)生的畜禽糞便等廢棄物達(dá)到27 億t，到2018 年高達(dá)38 億t，2020 年時(shí)全國(guó)產(chǎn)生42.44 億t 的畜禽糞便廢棄物，成為中國(guó)最主要的農(nóng)業(yè)污染源之一[15]，因此畜禽糞便廢棄物的資源化利用成為亟待解決的問題。