qseC及l(fā)uxS雙基因缺失對多殺性巴氏桿菌毒力及其交叉免疫保護性的影響

胡 沛,彭 旭,程 丹,李 甜,王媛媛,高麗旭,袁 祥,彭遠(yuǎn)義,李能章

(西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,重慶 北碚 400715)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種重要的畜禽病原,可感染人和多種動物[1-5],嚴(yán)重威脅人和動物健康。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前發(fā)現(xiàn)有40余種動物可感染多殺性巴氏桿菌,包括所有家禽家畜,給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟損失[6-7]。根據(jù)莢膜和LPS組成差異,多殺性巴氏桿菌可以分為5種莢膜血清型(A、B、D、E和F)和1～16種LPS血清型[8-9],不同血清型間的交叉免疫保護性弱。多殺性巴氏桿菌現(xiàn)有商品化疫苗種類較少,主要針對豬牛源莢膜B型和兔及家禽源莢膜A型等少數(shù)幾種多殺性巴氏桿菌血清型的防控,由于多殺性巴氏桿菌菌株的宿主特異性差異及出現(xiàn)的部分血清型菌株跨物種感染,致使傳統(tǒng)的多殺性巴氏桿菌滅活疫苗和弱毒疫苗并不能達(dá)到理想的免疫保護效果,因此,開發(fā)新型廣譜性疫苗是多殺性巴氏桿菌感染防控的關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn),群體感應(yīng)基因qseC的缺失,可致使多殺性巴氏桿菌的毒力顯著降低,并且賦予了菌株較強的交叉免疫保護特性[10],該研究表明群體感應(yīng)基因缺失賦予了多殺性巴氏桿菌菌株交叉免疫保護特性。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system)主要有4種:LuxI/LuxR信號系統(tǒng)[11]、AIP介導(dǎo)的信號系統(tǒng)[12]、AI-2介導(dǎo)的信號系統(tǒng)[13]和AI-3介導(dǎo)的信號系統(tǒng)[14]。qseC基因?qū)儆贏I-3介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)[15],分析發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌中還存在AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng),luxS基因參與AI-2合成[16],有研究發(fā)現(xiàn),基于大腸桿菌aroA基因缺失株構(gòu)建的aroA及l(fā)uxS雙基因缺失株,其運動性、黏附性、侵入性和毒力進一步得到了降低[17]。那么在多殺性巴氏桿菌中,qseC及l(fā)uxS這2個來源不同群體感應(yīng)系統(tǒng)的基因缺失,是否在菌株相關(guān)生物性狀變化量及交叉免疫保護效果上有疊加效應(yīng),這是本研究想要探討的問題,以期為多殺性巴氏桿菌廣譜性疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

本研究在多殺性巴氏桿菌qseC基因缺失株的基礎(chǔ)上,進行了luxS基因的缺失,成功獲得qseC及l(fā)uxS基因雙缺失株(ΔqseCΔluxS),并對其莢膜、生物膜產(chǎn)生、生長繁殖情況及抗逆性等生物學(xué)特性以及致病力變化、交叉免疫保護特性等,與ΔqseC及野生株P(guān)mCQ2進行了比較分析。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及實驗動物牛源A型多殺性巴氏桿菌qseC基因缺失株(ΔqseC：LD50=5.28×107CFU,來源于PmCQ2)、牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1:LD50=3.80×102CFU,PmCQ2:LD50=3.40×103CFU)、牛源F型多殺性巴氏桿菌(PmF:LD50=1.00×108CFU)、禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmQ:LD50≈1.00 CFU)和兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR:LD50=1.00×104CFU)均由西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實驗室構(gòu)建及分離暫存。牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB,CVCC470:LD50=5.00×103CFU)和豬源A型多殺性巴氏桿菌(PmP,CVCC1662:LD50≈1.00 CFU)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸醫(yī)微生物菌種保藏中心,以上LD50均為肌肉途徑感染小鼠模型測定。用于多殺性巴氏桿菌溫敏型基因缺失載體pUC19oriKanR由實驗室前期構(gòu)建保藏。昆明小鼠(雌性,18～20 g)購自恩斯維爾實驗動物中心,其飼養(yǎng)及試驗方法由西南大學(xué)實驗動物倫理審查委員會監(jiān)督。

1.2 主要試劑馬丁肉湯、LB等培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司;卡那霉素、Stains all粉末(7423-31-6)、結(jié)晶紫(548-62-9)及吐溫-20均購自上海生工生物工程股份有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶購自TaKaRa;In-Fusion?HD Cloning Kit (PT5-162-1)購自Clontech;羊抗鼠IgG-HRP購自Thermo Scientific公司;15 A VG礦物油乳化劑為重慶澳龍生物制品有限公司贈送;TMB顯色液(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺)購自Beyotime公司。

1.3 雙基因缺失株的構(gòu)建本研究選擇對ΔqseC中的luxS基因進行缺失。缺失株構(gòu)建方法參見前期研究[18],所用引物見表1。取-80℃保藏的ΔqseC劃線接種在馬丁固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h,提取基因組DNA備用。以基因組DNA為模板,利用luxS5′ARM-F/R和luxS3′ARM -F/R引物對,擴增luxS基因上、下游同源臂,純化上、下游同源臂,以此為模板,采用luxS5′ ARM -F/luxS3′ ARM-R進行擴展,獲得上、下游同源臂融合DNA片段,純化片段克隆進多殺性巴氏桿菌溫敏型基因缺失載體pUC19oriKanR中,重組載體通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入ΔqseC細(xì)胞中,PCR初步篩選獲得luxS基因缺失株,其后通過PCR方法確認(rèn)luxS基因的缺失情況,驗證luxS缺失株的準(zhǔn)確性,對驗證正確的缺失株,在無抗培養(yǎng)基上37℃條件下連續(xù)傳代培養(yǎng),保證缺失株的抗性消除和遺傳穩(wěn)定性。

表1 基因缺失株構(gòu)建所需引物

1.4 生長曲線測定取-80℃保存的PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS分別劃線接種于馬丁固體平板,37℃倒置培養(yǎng)24.0 h,各挑取3～4個菌落分別接種于5 mL 馬丁液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)12.0 h,平板計數(shù),其后接種等量菌體于相同體積馬丁液體培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min震蕩培養(yǎng),每隔1.5 h取樣測定D600值,共取11個時間點,繪制生長曲線。試驗每次設(shè)3個生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.5 莢膜多糖含量測定分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對數(shù)生長期菌液各1 mL,12 000 r/min離心15 min,棄上清,無菌PBS洗滌菌體3次,用1 mL PBS重懸菌體,其后取10 μL稀釋進行平板計數(shù),剩余菌懸液放置42℃金屬浴中處理1 h后,12 000 r/min離心15 min,取100 μL上清液加入900 μL莢膜染色液(由0.2 g/L 的Stains all固體粉末、0.06%的冰醋酸和50%的甲酰胺配制而成)中,測定D640值。分別取濃度為0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 μg/100 μL的透明質(zhì)酸溶液100 μL,加入到900 μL莢膜染液中,測定D640值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各菌株的莢膜多糖含量(多殺性巴氏桿菌莢膜主要成分為透明質(zhì)酸)。試驗每次設(shè)5個生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.6 生物膜形成量測定分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對數(shù)生長期菌液,平板計數(shù)后,用BHI肉湯液體培養(yǎng)基稀釋(108CFU/mL),分別加入 48孔板中(400 μL/孔),陰性對照組加入BHI肉湯,37℃靜置培養(yǎng)48 h,吸凈菌液,于培養(yǎng)孔中加入甲醇固定(200 μL/孔),30 min后,吸出甲醇液,PBS洗滌3次,室溫干燥1 h,其后,每孔加入1%結(jié)晶紫200 μL ,靜置處理30 min后,棄染色液, PBS洗滌3次,室溫干燥,每孔加入33%冰乙酸200 μL,37℃恒溫處理30 min,測定D630值。試驗每次設(shè)5個生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.7 血清敏感性試驗分別取PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS對數(shù)生長期菌液,平板計數(shù),稀釋至1×105CFU/mL,各取10 μL菌液,分別加入900 μL滅活牛血清(56℃處理30 min)和未滅活牛血清中,37℃處理1 h后進行平板計數(shù)。血清處理細(xì)菌存活率=(未滅活牛血清中細(xì)菌數(shù)/滅活牛血清中細(xì)菌數(shù))×100%。試驗每次設(shè)3個生物重復(fù),重復(fù)2次。

1.8 半數(shù)致死量(LD50)測定取ΔqseCΔluxS對數(shù)生長期菌液,平板計數(shù),分別以2.2×106,2.2×107,2.2×108,2.2×109CFU劑量腹腔途徑感染小鼠(8只/組),對感染小鼠進行1周監(jiān)測,對瀕死小鼠實施安樂死并記入死亡數(shù)。采用Reed-Muench計算ΔqseCΔluxS的LD50。

1.9 雙缺失株滅活疫苗的制備取ΔqseCΔluxS進行劃線培養(yǎng),挑取3～4個菌落接種于5 mL馬丁液體培養(yǎng)基,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,按1∶100接種入200 mL馬丁培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h后取出,取菌液進行活菌計數(shù)的同時進行濃縮,加入終濃度為0.15%的甲醛溶液,37℃靜置處理24 h,靜置期間每隔6 h搖1次,使菌體充分滅活,其后取滅活菌100 μL,涂于馬丁固體平板,37℃培養(yǎng)24 h,檢驗滅活效果。滅活合格菌液及PBS液分別與15A VG礦物油佐劑按4∶1的體積比混合,充分振蕩乳化直至靜置不分層為止,制備出ΔqseCΔluxS滅活疫苗(5×109CFU/mL)和PBS乳化劑。取100 μL滅活疫苗涂布于馬丁固體平板上,37℃培養(yǎng)24 h,進行活菌檢測,另取6只小鼠,分別在背部皮下接種100 μL滅活疫苗,評價疫苗的安全性。合格疫苗4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 雙缺失株疫苗免疫保護性測定選用18～20 g雌性昆明小鼠分組(6只/組),按照表2～3分別接種滅活疫苗和弱毒疫苗(對數(shù)生長期培養(yǎng)菌的PBS重懸液),免疫劑量與文獻(xiàn)YANG等[10]中的ΔqseC疫苗一致。滅活疫苗免疫途徑采用背部皮下多點注射,加強免疫1次,在首免后14 d進行,弱毒疫苗免疫采用腿部肌肉注射,僅免疫1次。2種疫苗菌在首免后21 d分別采用3.6×107CFU PmCQ1 (LD50=3.8×102CFU),1.8×107CFU PmCQ2 (LD50=3.4×103CFU),1.1×107CFU PmB (LD50=5.0×103CFU),1.2×108CFU PmF (LD50=1.0×108CFU),1.2×105CFU PmR (LD50=1.0×104CFU),10 CFU PmP (LD50≈1.0 CFU),10 CFU PmQ (LD50≈1.0 CFU)進行肌肉攻毒。攻毒后每天觀察小鼠,持續(xù)1周,對瀕死小鼠實施安樂死并記入死亡數(shù)。疫苗保護率按以下公式計算:保護率=(對照組死亡率-免疫組死亡率)/對照組死亡率×100%。

表2 滅活苗免疫分組和攻毒

表3 弱毒苗免疫分組和攻毒

1.11 抗體消長規(guī)律分析雌性昆明小鼠分為2組(6只/組),組1肌肉途徑免疫ΔqseCΔluxS弱毒苗(3.3×108CFU/只),組2對照注射等體積無菌PBS液,免疫后每隔7 d,尾靜脈采血分離血清保存,連續(xù)采集12周,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測小鼠血清抗體水平。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用軟件Graphpad Prism 9.0對相關(guān)試驗數(shù)據(jù)進行分析處理。ns.P>0.05 為無顯著性差異,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001及****.P<0.000 1為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1qseC及l(fā)uxS雙基因缺失株的構(gòu)建qseC及l(fā)uxS基因為多殺性巴氏桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因。前期發(fā)現(xiàn)qseC基因缺失使菌株毒力顯著降低,并賦予菌株很強的交叉保護性,而野生株卻無相關(guān)表現(xiàn)[10]。為此思考同為群體感應(yīng)的luxS基因缺失是否能夠加強qseC基因缺失株的相關(guān)特性。因此,本研究在ΔqseC基礎(chǔ)上,通過同源重組進行了luxS基因的缺失。在基因缺失設(shè)計方面,考慮到luxS基因上、下游其他基因的距離,設(shè)計了僅缺失luxS基因的前部分(圖1A),缺失該部分片段后,使該基因不能翻譯出原有蛋白,其相關(guān)功能失活。在進行l(wèi)uxS基因缺失前,對qseC基因缺失株進行了再次驗證(圖1B),確保了菌株的準(zhǔn)確性。所構(gòu)建的雙基因缺失株也分別進行qseC基因和luxS基因的PCR驗證,其缺失部分大小均正確(圖1C),通過測序,也驗證了所缺失部分準(zhǔn)確無誤,確定了構(gòu)建菌株為qseC和luxS雙基因缺失株。因基因缺失是采用的同源重組方法,在片段發(fā)生交換后,含有交換基因片段的載體要快速清除,不然會發(fā)生回復(fù)交換。本研究中所采用的缺失載體為溫敏型載體,37℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)消除了質(zhì)粒,其后再進行體外連續(xù)傳代和體內(nèi)感染后分離細(xì)菌檢測,確保了缺失株的遺傳穩(wěn)定(圖1D,E)。

2.2 缺失株的生物學(xué)特征分析對野生型PmCQ2、ΔqseC及ΔqseCΔluxS的部分生物學(xué)特性進行了比較分析。3種菌分別涂布培養(yǎng)在馬丁固體平板上,37℃培養(yǎng)24.0 h后,ΔqseCΔluxS的菌落形態(tài)略微小于ΔqseC,明顯小于PmCQ2(圖2A),接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基中,前7.5 h ΔqseCΔluxS與ΔqseC生長一致,慢于PmCQ2,其后,ΔqseCΔluxS生長稍微快于PmCQ2及ΔqseC(圖2B)。ΔqseCΔluxS菌落雖小,但后期生長速度并未低于野生株P(guān)mCQ2及ΔqseC,其原因可能與莢膜含量的多少相關(guān),測定其莢膜發(fā)現(xiàn),ΔqseCΔluxS莢膜量顯著低于ΔqseC,ΔqseC又顯著低于PmCQ2(圖2D),液體培養(yǎng)后4℃靜置1周,ΔqseCΔluxS和ΔqseC更易于沉降(圖2C),ΔqseCΔluxS和ΔqseC雖莢膜量降低了,但菌體也沒有像有的細(xì)菌靜置后很快沉降到管底,表明其存在的莢膜多糖的水合特性仍能使其細(xì)胞維持懸浮狀。有研究表明,多殺性巴氏桿菌中莢膜多糖的生成與生物膜的生產(chǎn)成反比[19],測定ΔqseCΔluxS生物膜產(chǎn)生情況,發(fā)現(xiàn)顯著高于PmCQ2及ΔqseC(圖2E),其莢膜多糖的產(chǎn)生與生物膜也成反比。血清敏感性測定發(fā)現(xiàn),與野生型相比PmCQ2、ΔqseCΔluxS對血清處理更為敏感性,細(xì)菌細(xì)胞存活數(shù)顯著降低,與ΔqseC的血清敏感性無顯著性差異(圖2F)。進一步分析qseC和luxS雙基因缺失對菌株毒力的影響,以Reed-Muench法計算ΔqseCΔluxS的LD50為5.50×107CFU(圖2G),其毒力顯著低于野生株P(guān)mCQ2(腹腔途徑感染LD50=1.00 CFU)[20],毒力比qseC基因缺失株(LD50=5.28×107CFU)[10]有所降低。

2.3 交叉免疫保護性測定及比較分析前期研究發(fā)現(xiàn),ΔqseC具有較強的交叉免疫保護作用[10],那么在此基礎(chǔ)上繼續(xù)進行l(wèi)uxS基因缺失后,菌株是否在其交叉免疫保護方面有所不同,為此,在此對ΔqseCΔluxS的交叉免疫保護性進行相關(guān)測定,考慮到與ΔqseC制備疫苗進行比較分析,ΔqseCΔluxS的疫苗制備及免疫劑量與途徑也與前期研究的ΔqseC一致。以ΔqseCΔluxS制備的滅活疫苗和弱毒苗分別免疫小鼠,首免后21 d,取1組采集尾靜脈血分離血清,采用不同攻毒株細(xì)胞蛋白為抗原進行包被,ELISA測定疫苗產(chǎn)生的針對各攻毒株的抗體水平,發(fā)現(xiàn)其滅活疫苗針對各攻毒株均有較高的抗體水平,免疫個體間差異小(圖3A),而弱毒疫苗針對各攻毒株的抗體水平顯著低于滅活疫苗,免疫個體間的抗體水平差異大(圖3A,圖4A),這也表明弱毒苗導(dǎo)致各個體小鼠感染程度的不同,疫苗免疫效果差異度大。攻毒保護性測定發(fā)現(xiàn),ΔqseCΔluxS滅活疫苗對2株牛源A型多殺性巴氏桿菌(PmCQ1和PmCQ2)的保護率分別為67%和83%(圖3B,C),對牛源B型多殺性巴氏桿菌(PmB)的保護率為83%(圖3D),對兔源A型多殺性巴氏桿菌(PmR)的保護率僅為33%(圖3F),對牛源F型、豬源A型及禽源A型多殺性巴氏桿菌(PmF、PmP和PmQ)沒有保護作用(圖3E,G～H)。而ΔqseCΔluxS的弱毒苗對PmCQ1、PmCQ2、PmB及PmR感染的保護率均為100%(圖4B～D,F),對PmF的保護率為90%(圖4E),對PmP和PmQ沒有保護性(圖4G,H)。即便ΔqseCΔluxS的弱毒苗疫苗的抗體水平低于滅活疫苗,但其交叉免疫保護效果仍顯著優(yōu)于滅活疫苗,而前期研究發(fā)現(xiàn),以野毒株P(guān)mCQ2制備的滅活苗交叉免疫保護性很弱,qseC基因缺失株的交叉免疫保護效果較好[10]。

A.ΔqseCΔluxS滅活苗免疫后21 d 血清抗體水平;B～H.各菌株感染小鼠存活曲線 (PmCQ1、PmCQ2、PmB、PmF、PmR、PmP、PmQ)

A.ΔqseCΔluxS弱毒苗免疫后21 d 血清抗體水平;B～H.各菌株感染小鼠的存活曲線(PmCQ1、PmCQ2、PmB、PmF、PmR、PmP、PmQ)

本研究中ΔqseCΔluxS的交叉免疫保護性效果與以前研究中做的ΔqseC的交叉免疫保護性比較發(fā)現(xiàn)(表4),luxS基因的缺失并未整體增強原qseC缺失株的交叉免疫保護效果,但卻增強了菌株對于牛源F型多殺性巴氏桿菌感染的交叉保護性。如僅從滅活疫苗的角度來看,luxS基因缺失是顯著減弱了原qseC缺失株的交叉免疫保護效果。由此可以看出,在多殺性巴氏桿菌交叉免疫保護性方面,基因缺失的多少與保護性間無明顯相關(guān)性,但可能與缺失基因本身所調(diào)控的交叉免疫保護性抗原產(chǎn)生量有關(guān)。

表4 ΔqseC和ΔqseCΔluxS相關(guān)疫苗的保護性 %

2.4 抗體消長規(guī)律為進一步了解ΔqseCΔluxS弱毒疫苗免疫后抗體產(chǎn)生的動態(tài)變化,免疫后每周采血分離血清測定其針對PmCQ2和PmB的抗體水平。首免14 d,就能檢測到較高的針對PmCQ2抗體水平,并持續(xù)超9周(圖5A)?？筆mB抗體在21 d時也達(dá)到較高的水平,56 d時達(dá)到最高,抗體高水平維持超過8周(圖5B)。由于僅監(jiān)測了11周,但從其動態(tài)趨勢來看,其高抗體水平應(yīng)可維持更長時間。

A．弱毒苗免疫后抗PmCQ2的抗體水平變化;B.弱毒苗免疫后抗PmB的抗體水平變化

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一種人畜共患性細(xì)菌病原,可感染人及多種動物,目前發(fā)現(xiàn)一些水生動物如海獅[21]也可感染多殺性巴氏桿菌,但其危害最大的仍是家畜家禽,給養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟損失。多殺性巴氏桿菌對人的感染主要因?qū)櫸镓?、犬抓?可導(dǎo)致局部和全身系統(tǒng)性感染[1],隨著寵物飼養(yǎng)量增大,相關(guān)感染案例呈現(xiàn)上升趨勢,現(xiàn)還未發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌在人群中傳播的案例,但多殺性巴氏桿菌感染還是存在潛在的公共安全風(fēng)險。目前,多殺性巴氏桿菌疫苗種類偏少,僅有少數(shù)幾種,又由于多殺性巴氏桿菌血清型多,還有部分血清型菌株間的基因水平轉(zhuǎn)移交換更增加了菌株多樣性,而各莢膜血清型間的交叉保護性弱,并存在部分動物源血清型的跨種間感染情況,導(dǎo)致了傳統(tǒng)疫苗防控的效果并不好,防控仍依靠抗生素,但伴隨而來的問題是其相關(guān)耐藥性增加,這無形中又增大了該病原感染的防控難度。因此,疫苗防控仍應(yīng)是多殺性巴氏桿菌疫病防控的最有利手段,基于當(dāng)前多殺性巴氏桿菌疫苗現(xiàn)狀,研發(fā)通用型疫苗是當(dāng)前多殺性巴氏桿菌防控最緊迫的任務(wù)和關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn),群體感應(yīng)qseC基因缺失賦予了多殺性巴氏桿菌具有很強的交叉免疫保護作用[10],具有作為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗候選菌株的潛力,但該缺失株的滅活疫苗還存在一定不足,其針對其他血清型多殺性巴氏桿菌感染的保護性未達(dá)到理想效果,同時作為滅活疫苗來看,其毒力稍微偏大了些,因此思考,如果繼續(xù)缺失相關(guān)群體感應(yīng)基因,是否能夠使其毒力下降得更多,作為疫苗得保護性效果更好。因此,本研究中在qseC基因缺失株的基礎(chǔ)上繼續(xù)進行群體感應(yīng)luxS基因的缺失,但從本研究的結(jié)果來看,qseC與luxS雙基因的缺失,對菌株的交叉免疫保護性并沒有疊加效應(yīng),反而導(dǎo)致缺失株對部分多殺性巴氏桿菌血清型菌株感染的保護性顯著降低,從這個角度來看,缺失的基因數(shù)量多少可能與菌株的交叉免疫保護性效果沒有線性正相關(guān),但與缺失哪些基因有關(guān),本研究也發(fā)現(xiàn)有些基因的缺失并未賦予菌株交叉免疫保護特性。

從適應(yīng)性的角度來看,大多數(shù)臨床分離病原株均具有一定的宿主偏好性,這是適應(yīng)進化的結(jié)果,這也就導(dǎo)致了病原疫苗株的選擇難度增大,同一病原疫苗菌株差異,其保護性效果差異很大。從理論的角度來看,基因突變可能會在一定程度上改變菌株原有的宿主偏好性,打破菌株宿主偏好性壁壘,其代表種群共性的相關(guān)基因表達(dá)更高,這樣就導(dǎo)致菌株具有通用性疫苗的可能。多殺性巴氏桿菌野毒株P(guān)mCQ2交叉免疫保護性很弱,而其部分基因的缺失如qseC及hyaD基因的缺失,都賦予了菌株較強的交叉免疫保護作用[10,22],這也證明了以上觀點。多殺性巴氏桿菌中,這種基因缺失而導(dǎo)致菌株的交叉免疫保護特性,其內(nèi)在原因可能主要還是其相關(guān)交叉保護性抗原表達(dá)的上調(diào),對實驗室多株具有交叉免疫保護作用的多殺性巴氏桿菌基因缺失株滅活苗進行了細(xì)胞免疫差異進行了比較分析,其結(jié)果是這些缺失株與野生株疫苗的細(xì)胞免疫無顯著性差異。同時,對這些菌株可能的交叉保護性抗原進行比較分析,并進行了大量克隆表達(dá)及保護性測定,但結(jié)果并未令人滿意,多數(shù)蛋白抗原的保護性都不高(相關(guān)數(shù)據(jù)未發(fā)表),由此得出,這種基因缺失導(dǎo)致的交叉保護特性應(yīng)是多抗原共同體現(xiàn)的結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn),即便是同一基因缺失,對不同多殺性巴氏桿菌菌株交叉保護特性的影響差異顯著,這也與本研究要進行疫苗株選擇的道理是一樣,菌株本身就表現(xiàn)出不同差異。

本研究中,qseC及l(fā)uxS雙基因缺失株從整體上來看,其菌株毒力、莢膜產(chǎn)生及抗逆性顯著下調(diào),表明群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因與其環(huán)境生存能力密切相關(guān),不同群體感應(yīng)系統(tǒng)都起到一定的作用,效果具有疊加效應(yīng)。但從交叉免疫保護性方面來看,沒有疊加效應(yīng)。這可能與其莢膜產(chǎn)生量有一定關(guān)系,qseC單基因缺失和qseC及l(fā)uxS雙基因缺失均可導(dǎo)致菌株莢膜生成量的顯著下調(diào),但雙基因缺失明顯下調(diào)更多,莢膜是多殺性巴氏桿菌一個非常重要的毒力因子,作為疫苗菌株,莢膜缺失導(dǎo)致無相關(guān)針對莢膜的相關(guān)抗體產(chǎn)生,但同時,如果疫苗株中莢膜含量過多,可能也會影響到其他交叉保護性抗原的暴露,從而影響到交叉免疫保護性抗體的產(chǎn)生量,因此,從這個方面來看,作為多殺性巴氏桿菌,含適度莢膜可能更有利于菌株產(chǎn)生交叉免疫保護作用。PETRUZZI等[19]研究發(fā)現(xiàn)A型多殺性巴氏桿菌中生物膜的形成與其莢膜的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān),本研究結(jié)果也與之一致,生物膜生成能力與莢膜含量通常與細(xì)菌致病性密切相關(guān),ΔqseCΔluxS的莢膜生成量降低,生物膜表達(dá)量升高,但其致病性顯著降低,表明在A型多殺性巴氏桿菌中莢膜對于毒力的貢獻(xiàn)度更大一些,即便有生物膜表達(dá)量升高對致病力增強為補充,莢膜減低仍會導(dǎo)致菌株毒力的顯著下調(diào)。生物膜表達(dá)量的增加,可能更易于A型多殺性巴氏桿菌在呼吸道黏膜上定殖及組織中的慢性感染,A型多殺性巴氏桿菌中莢膜與生物膜表達(dá)量的比率可能與其導(dǎo)致的疾病類型密切相關(guān)。關(guān)于這種莢膜產(chǎn)生降低,而生物膜生成量升高的情況,在多殺性巴氏桿菌的其他血清型菌株中,是否也同樣存在還不得而知。

綜上來看,多殺性巴氏桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控菌株毒力,不同群體感應(yīng)系統(tǒng)間相互協(xié)調(diào)補充,其相關(guān)基因的缺失可能會賦予菌株較強的交叉免疫保護性,可作為多殺性巴氏桿菌通用型疫苗研發(fā)的參考。