女貞子-黃芪治療轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制*

陳海群,華其榮,林 軍,周青鳥,陳 嘉,覃 菲,王 璐,吳群英**

(1.桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西桂林 541004;2.桂林醫(yī)學(xué)院智能醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,廣西桂林 541004;3.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西南寧 530021)

前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是全球男性第二常見的惡性腫瘤,也是男性因癌癥死亡的主要原因[1]。近年來,我國前列腺癌發(fā)病率明顯增加,是男性泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤[2]。雄激素剝奪療法(Androgen Deprivation Therapy,ADT)是治療晚期PCa患者的基本方法,但研究證實幾乎所有的PCa患者都會對雄激素阻斷產(chǎn)生耐藥性,發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer,CRPC)[3],發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRPC(Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer,mCRPC)患者的中位生存期僅為 16-24 個月[4],目前尚無有效治療mCRPC的藥物[5]?，F(xiàn)有用于治療mCRPC的藥物主要為雄激素受體靶向藥物,如阿比特龍及恩雜魯胺,但約20%的mCRPC患者會出現(xiàn)原發(fā)性耐藥,導(dǎo)致治療緩解期短[6],因此亟需研發(fā)治療mCRPC的新興藥物。

中醫(yī)藥能夠改善中晚期腫瘤患者的臨床癥狀,穩(wěn)定腫瘤病灶及提高患者生存質(zhì)量[7]。有研究表明,中醫(yī)藥在治療PCa及改善患者生存質(zhì)量方面具有獨特的優(yōu)勢[8]。據(jù)報道,女貞子(Ligustrumlucidum)-黃芪(Astragalusmembranaceus)在乳腺癌保乳術(shù)后調(diào)強(qiáng)放射治療及胃癌輔助治療中起重要作用,可以明顯改善患者的生活質(zhì)量,降低放療與化療的毒副作用,提高患者生存率[9,10]。但女貞子-黃芪是否可以作為治療mCRPC的潛在藥物,目前尚無相關(guān)研究報道。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對女貞子-黃芪治療mCRPC的作用靶點與潛在機(jī)制進(jìn)行探討,為mCRPC藥物研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分及作用靶點篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué) (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP) 數(shù)據(jù)庫與分析平臺,以口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和類藥性(Drug-Like,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)[11],篩選女貞子-黃芪的活性成分及作用靶點。

1.2 mCRPC相關(guān)的差異表達(dá)基因分析

從GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載芯片數(shù)據(jù)集GSE77930表達(dá)譜數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床信息,該芯片數(shù)據(jù)集包含171個樣本,其中CRPC樣本22個,mCRPC樣本149個。利用limma包對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以差異倍數(shù)的絕對值(|Fold Change,FC|)≥1.5倍,且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)[12],篩選mCRPC與CRPC之間差異表達(dá)的基因,并繪制熱圖及火山圖。

1.3 女貞子-黃芪活性成分-藥物靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對篩選得到的女貞子-黃芪作用靶點和mCRPC相關(guān)的差異表達(dá)基因取交集,獲得女貞子-黃芪治療mCRPC的潛在作用靶點,利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建女貞子-黃芪活性成分-mCRPC作用靶點網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.8.0軟件中Bisogenet和CytoNCA插件,選取HRPD、BIND、DIP、BIOGRID、INTACT和MINT 6個數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建女貞子-黃芪活性成分與mCRPC靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用 (Protein-Protein Interaction,PPI) 網(wǎng)絡(luò)。以度中心性(Degree Centrality,DC)>61,介數(shù)中心性(Betweenness Centrality,BC)>600為標(biāo)準(zhǔn)[13],篩選核心網(wǎng)絡(luò)。

1.4 核心靶點GO富集分析

將篩選得到的交集靶點導(dǎo)入clusterProfiler包,進(jìn)行GO富集分析,包括分子功能(Molecular Function,MF)、生物過程(Biological Process,BP)和細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)3個方面[14]。

1.5 KEGG分析及靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用R語言,根據(jù)基因富集的數(shù)量和顯著性,將富集得到信號通路結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件,根據(jù)度值(Degree)的大小進(jìn)行排序,顯示前20條通路。利用Perl 5.30.0和Cytoscape 3.8.0構(gòu)建靶點-通路網(wǎng)絡(luò)[15],進(jìn)一步分析女貞子-黃芪治療mCRPC的核心靶點與信號通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 女貞子-黃芪的活性成分及作用靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫與分析平臺中,依據(jù)OB≥30% 和DL≥0.18篩選女貞子和黃芪的活性成分及作用靶點,獲得女貞子的活性成分13個、黃芪的活性成分20個,包括槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、木犀草素(Luteolin)、異鼠李素(Isorhamnetin)、芒柄花黃素(Formononetin)、圣草酚(Eriodictyol)和女貞果苷D (Lucidumoside D)等,其中山奈酚和槲皮素是女貞子和黃芪兩種中藥共有的活性成分(表1)。女貞子作用靶點1 025個,黃芪作用靶點968個。

2.2 mCRPC相關(guān)的差異表達(dá)基因

與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的CRPC相比,在mCRPC患者中差異表達(dá)的基因一共有1 067個,其中表達(dá)上調(diào)的基因424個,表達(dá)下調(diào)的基因643個(圖1)。

表1 女貞子-黃芪活性成分

圖1 mCRPC相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.3 女貞子-黃芪活性成分-mCRPC作用靶點網(wǎng)絡(luò)

按不同靶點對應(yīng)有效成分的數(shù)目分類展示,共獲得女貞子-黃芪治療mCRPC的潛在作用靶點18個(圖2)。對應(yīng)的女貞子-黃芪有效成分11個(圖 3,其中綠色表示女貞子的有效成分,黃色表示黃芪的有效成分,紅色為女貞子-黃芪兩者共有的有效成分,藍(lán)色表示靶點基因),槲皮素的作用靶點最多,為15個;β-谷甾醇、圣草酚和女貞果苷D(苷元)的作用靶點最少,只有1個作用靶點。

圖2 女貞子-黃芪治療mCRPC的靶點韋恩圖

圖3 女貞子-黃芪的活性成分與關(guān)鍵作用靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 女貞子-黃芪治療mCRPC的作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

將女貞子-黃芪作用靶點與mCRPC相關(guān)的差異基因取交集后,利用Cytoscape 3.8.0中的Bisogenet插件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,得到一個由1 629個節(jié)點和40 875條邊組成的網(wǎng)絡(luò)(圖4)。在此網(wǎng)絡(luò)圖的基礎(chǔ)上,利用Bisogenet和CytoNCA插件,以DC>61作為初級篩選條件,獲得一個由435個節(jié)點和17 187條邊組成的網(wǎng)絡(luò)[圖5(a)中的黃色色塊,即圖5(b)]。將BC>600作為第二次篩選條件,最終得到一個由64個節(jié)點和941條邊組成的核心網(wǎng)絡(luò)[圖5(b)中的黃色色塊,即圖5(c)],主要包括雄激素受體(Androgen Receptor,AR)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)和血管細(xì)胞黏附因子(Vascular Cell Adhesion Molecule 1,VCAM1)等關(guān)鍵靶點(圖5中的紅色色塊)。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D

2.5 作用靶點GO富集分析

利用R語言對女貞子-黃芪治療mCRPC的核心靶點進(jìn)行GO富集分析,共得到GO條目82個。BP條目75個,主要參與酮體反應(yīng)(Response to ketone)、對金屬離子的反應(yīng)(Response to metal ion)、傷口愈合(Wound healing)等生物學(xué)過程[圖6(a)]。CC條目4個,主要富集在核染色體(Nuclear chromosome)、染色體區(qū)(Chromosomal region)、凝集的染色體(Condensed chromosome)和復(fù)制叉處(Replication fork)[圖6(b)]。MF條目3個,涉及氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity)和組蛋白激酶活性(Histone kinase activity)[圖6(c)],提示女貞子-黃芪可能通過調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過程發(fā)揮其治療mCRPC的功效。

圖6 核心靶點GO富集分析

2.6 KEGG信號通路與核心靶點互作網(wǎng)絡(luò)

KEGG分析結(jié)果表明,女貞子-黃芪治療mCRPC的作用靶點主要涉及乙型肝炎(Hepatitis B)、前列腺癌、細(xì)胞周期(Cell cycle)、Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)信號通路(VEGF signaling pathway)和細(xì)胞衰老(Cellular senescence)等通路(圖7)。對獲得的信號通路和作用靶點構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò),結(jié)果發(fā)現(xiàn),PRKCA、E2F1、E2F2和PPP3CA等核心靶點與多條信號通路密切相關(guān),分別涉及了14、12、11及7個信號通路(圖8),提示女貞子-黃芪可能通過多種有效成分作用于多個靶點,通過多個信號通路發(fā)揮其治療mCRPC的作用。

圖7 靶點的KEGG分析

圖8 KEGG信號通路與核心靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和大數(shù)據(jù)分析,通過構(gòu)建藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò),探索藥物發(fā)揮作用的機(jī)制,為中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究提供了新途徑和新依據(jù)[16]。本研究將GEO芯片數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合,探討女貞子-黃芪治療mCRPC的作用靶點及潛在作用機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)女貞子-黃芪的有效成分包括槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素和芒柄花黃素等,其中槲皮素在拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)中的度值較大,作用靶點最多。有研究報道,槲皮素在體外可抑制前列腺癌、宮頸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌以及食管癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]。因此,槲皮素可能是女貞子-黃芪治療mCRPC的核心成分。

通過構(gòu)建蛋白互作拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)圖,可知女貞子-黃芪治療mCRPC的18個潛在作用靶點中 ,在PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用的靶點為AR、PCNA和VCAM1。Qiu等[18]研究證實,AR在PCa的發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。PCNA是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物,其表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)[19]。Juríková等[20]研究報道,PCNA高表達(dá)增加乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲的危險性。Huang等[21]發(fā)現(xiàn),VCAM1高表達(dá)與高級別漿液性卵巢癌的發(fā)生和預(yù)后不良密切相關(guān)。Ding等[22]發(fā)現(xiàn)VCAM1與腫瘤血管生成密切相關(guān),胃癌中 VCAM1陽性組織的微血管密度高于 VCAM1陰性組織。Zhang等[23]報道,VCAM1高表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果證實,AR、PCNA、VCAM1與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān),表明女貞子-黃芪可能通過靶向mCRPC關(guān)鍵基因發(fā)揮治療作用。

對女貞子-黃芪治療mCRPC的作用靶點進(jìn)行KEGG分析發(fā)現(xiàn),作用靶點主要富集在乙型肝炎、前列腺癌、細(xì)胞周期、VEGF信號通路和細(xì)胞衰老等通路。Krystyna等[24]研究報道,有肝炎的男性患前列腺癌風(fēng)險顯著增加。Sarkar等[25]發(fā)現(xiàn),乙型肝炎病毒感染與前列腺癌的發(fā)展有密切的關(guān)系,乙型肝炎病毒能促進(jìn)AR信號傳遞。閆浩等[26]發(fā)現(xiàn),前列腺癌信號通路激活能夠促進(jìn)AR靶基因的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Ghafouri-Fard等[27]認(rèn)為,槲皮素通過調(diào)節(jié)p21 CDK抑制劑和抑制pRb磷酸化,抑制細(xì)胞增殖。另外,槲皮素可通過靶向VEGFR-2 介導(dǎo)的血管生成途徑,抑制下游調(diào)節(jié)因子AKT的表達(dá),從而抑制腫瘤生長[28,29]。這些研究提示女貞子-黃芪可能通過調(diào)控以上信號通路發(fā)揮其治療mCRPC的作用,表明女貞子-黃芪在治療mCRPC方面極具潛力,但結(jié)果仍需進(jìn)一步的實驗驗證。

4 結(jié)論

槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素和芒柄花黃素等成分可能是女貞子-黃芪治療mCRPC的重要藥效物質(zhì)。女貞子-黃芪可能通過影響與mCRPC相關(guān)的多個信號通路發(fā)揮其治療mCRPC的作用。本研究利用GEO芯片數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法系統(tǒng)探討女貞子-黃芪治療mCRPC的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供了一定的依據(jù),但本研究中只納入一個mCRPC數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,研究結(jié)果還有待進(jìn)一步證實。