響應面優(yōu)化冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶工藝

滕迎弟，王解語，唐業(yè)豪，黃莉莉，*巫永華，2，張建萍，2，劉恩岐，2

（1. 徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2. 徐州工程學院江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum） 是茯磚茶加工過程中的優(yōu)勢菌，大量繁殖后會形成一種金黃色閉囊殼結(jié)構(gòu)，俗稱“金花”，也因此稱其為金花菌[1]，該菌的自身代謝產(chǎn)物無毒害作用，具有抑制腫瘤細胞增長、降血脂等生理功能[2]。大量研究表明，接種冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵會對其活性成分、功能特性和風味產(chǎn)生影響。Xiao Y 等人[3]探討了冠突散囊菌對秋季綠茶品質(zhì)提升的作用機制。Zou M M等人[4]研究了用冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵銀杏籽粉，表明發(fā)酵銀杏籽粉的抗氧化活性明顯增強，銀杏酸含量降低44.97%。此外，發(fā)酵銀杏籽粉表現(xiàn)出更好的消化率，并具有令人愉悅的類似橙子的氣味。杜靜等人[5]研究表明，經(jīng)冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵后的葛根，部分活性成分的含量提高，且發(fā)酵后產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性，不良的中藥味得到改善。

牛蒡（Arctium lappa L.） 為菊科牛蒡?qū)賰赡晟荼局参?，是中國傳統(tǒng)藥食同源的植物[6]，由于其含有牛蒡菊糖、多酚、黃酮、木脂素、氨基酸和礦物質(zhì)等有益成分而被開發(fā)成牛蒡茶等產(chǎn)品。傳統(tǒng)上，牛蒡茶的加工包括切片、烘烤等工序[7]，制作工藝較為簡單，所得牛蒡茶口感苦澀，產(chǎn)品口感和風味不易被消費者接受；在牛蒡茶品質(zhì)改善上，于沛沛等人[8]報道了接種黑曲霉渥堆發(fā)酵制備牛蒡茶的工藝。徐艷平[9]優(yōu)化了靈芝發(fā)酵牛蒡茶的工藝，研究表明冠突散囊菌是影響茯磚茶品質(zhì)的關鍵因素，對于形成茯磚茶菌香濃郁、湯色紅濃、口感醇厚的獨特特征和風味具有重要作用[10]。通過接種冠突散囊菌，利用“散茶發(fā)花”[11]技術(shù)改善牛蒡茶的品質(zhì)，為牛蒡發(fā)酵茶的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡，購自農(nóng)貿(mào)市場；冠突散囊菌（Eurotium cri-statum），北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司提供；福林酚、沒食子酸、蘆丁、熊果酸、葡萄糖，上海葉源生物科技公司提供；苯酚、甲醇、濃硫酸、三氯化鋁，均為分析純，國藥集團上海試劑公司提供。

1.2 儀器與設備

DFY-200C 型高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產(chǎn)品；HH.B11.500S 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-18SI 型手提式高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2F 型超凈工作臺、BGZ-76 型電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；TU-1810 型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 制作流程

（1） 工藝流程。新鮮牛蒡→挑選、清洗→切片→0.1%檸檬酸浸泡護色→干制→高溫滅菌→接種冠突散囊菌→恒溫恒濕固態(tài)發(fā)酵→干燥→成品。

（2） 操作要點。取一定量的干燥牛蒡切片于250 mL燒杯中，添加一定的純水，無菌封口膜密封后，高壓蒸汽滅菌鍋滅菌15 min，放置已滅菌的無菌操作臺中冷卻至室溫，接種一定量的冠突散囊菌孢子懸液，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵，發(fā)酵完后干燥至水分含量小于10%，制成發(fā)酵牛蒡茶。

1.3.2 冠突散囊菌孢子懸液的制備

將裝有菌種的安瓿管表面消毒后在安全柜中打開，用酒精燈灼燒頂部，迅速滴上無菌水使之破裂，隨后用鑷子將其敲碎，之后吸取0.5 mL 無菌水打入凍干管，充分溶解菌粉后，用移液槍吸取200 μL 于準備好的平板中，涂布均勻，將平板置入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，待長出金黃色菌落后，用接種環(huán)將金黃色閉囊殼刮下，并置于裝有100 mL 無菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩均勻后，將其稀釋為濃度1×108個/ mL 的孢子懸液。

1.3.3 冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶的工藝優(yōu)化

（1） 基質(zhì)含水量對牛蒡發(fā)酵效果的影響。設置牛蒡片初始水分含量分別為15%，20%，25%，30%，35%，接種10%（接種量為接種菌懸液體積與牛蒡質(zhì)量比） 的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵7 d，通過感官評分確定最佳初始水分含量。

（2） 接種量對牛蒡發(fā)酵效果的影響。取一定質(zhì)量的牛蒡片，加無菌水至初始水分含量為25%，分別接種2%，3%，4%，5%，6%的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵7 d，通過感官評分確定接種量。

（3） 發(fā)酵時間對牛蒡發(fā)酵效果的影響。取一定質(zhì)量的牛蒡片，加無菌水至初始水分含量為25%，接種10%的冠突散囊菌孢子懸液，用無菌透氣封口膜封口，于溫度28 ℃，濕度80%的恒溫恒濕箱中發(fā)酵5，7，9，11，13 d，通過感官評分確定最佳發(fā)酵時間。

（4） 響應面優(yōu)化試驗設計?；趩我蛩卦囼灲Y(jié)果，以發(fā)酵牛蒡茶感官評價評分為響應值進行三因素三水平響應面試驗優(yōu)化發(fā)酵牛蒡茶的生產(chǎn)工。

響應面設計因素編碼及水平見表1。

表1 響應面設計因素編碼及水平

1.3.4 牛蒡茶的泡制與感官評價

（1） 牛蒡茶的泡制。以GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》為依據(jù)，取各試驗組的發(fā)酵牛蒡茶3 g 放入審評杯里，杯中倒入150 mL 沸水，蓋上杯蓋靜置2 min，將茶水倒進品評杯，再泡第2 次，靜置5 min，倒出茶水。

（2） 感官評定。邀請10 名已經(jīng)修完“感官評價”課程的學生首先對第1 次沖泡茶湯的湯色、茶底的香氣、茶水的滋味進行評價，對第2 次沖泡茶湯的香氣、底色、湯色、滋味繼續(xù)進行評定。參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》，并稍作修改，通過30%滋味+ 30%香氣+ 20%外形+ 20%湯色作為計算基準得出具體分數(shù)。評價前先按表2 中的評分依據(jù)進行說明。

表2 感官評價標準

感官評價標準見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶的工藝確定

2.1.1 基質(zhì)含水量對發(fā)酵茶感官評分的影響

基質(zhì)含水量對發(fā)酵茶感官評分的影響見圖1。

圖1 基質(zhì)含水量對發(fā)酵茶感官評分的影響

基質(zhì)含水量會影響冠突散囊菌的生長情況，也會對基質(zhì)的活性成分產(chǎn)生影響。由圖1 可知，隨著基質(zhì)含水量的提高，發(fā)酵牛蒡茶的感官評分先升后降，當基質(zhì)含水量為25%時，感官評分最高為87.29 分，此時牛蒡茶表面被金黃色菌花所覆蓋，具有“金花菌”的香味，無不良的風味，說明冠突散囊菌在此含水量下生長狀況優(yōu)良。水分含量過低或者偏高時，感官評分較低，可能是較低和較高的水分含量都會抑制突散囊菌的生長，影響菌對基質(zhì)的利用，從而影響發(fā)酵茶的感官質(zhì)量。張波[12]研究表明，20%的含水量是冠突散囊菌發(fā)酵葛根時所需的水分條件，與試驗結(jié)果相近。因此，選擇25%左右進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.2 接種量對發(fā)酵茶感官評分的影響

接種量對發(fā)酵茶感官評分的影響見圖2。

圖2 接種量對發(fā)酵茶感官評分的影響

較大的接種量可有效地縮短發(fā)酵時間，也能防止雜菌污染，試驗中發(fā)現(xiàn)隨著接種量的增加，冠突散囊菌在牛蒡切片上的菌絲覆蓋率越高，色澤由淺黃變金黃，“金花菌”的香氣越發(fā)濃郁。由圖2 可知，接種量低于5%時，在7 d 發(fā)酵區(qū)間內(nèi)，牛蒡切片生長正常且沒有達到飽和狀態(tài)，而接種數(shù)量越多，其感官評分也就越高；當接種量大于5%時，感官評分開始降低，可能是過大的接種量會導致菌株生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)不足，影響產(chǎn)物合成，代謝廢物積累過多，從而致使冠突散囊菌覆蓋不均勻，菌絲覆蓋程度下降，影響了發(fā)酵茶的風味和色澤，降低感官評分。因此，選擇5%左右的接種量進行后續(xù)優(yōu)化試驗。

2.1.3 發(fā)酵時間對發(fā)酵茶感官評分的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵茶感官評分的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對發(fā)酵茶感官評分的影響

微生物發(fā)酵過程中，合適的發(fā)酵時間使得菌株充分利用底物進行生物轉(zhuǎn)化，獲得較佳的發(fā)酵產(chǎn)品。由圖3 可知，牛蒡茶的感官評分隨著發(fā)酵時間增加有上升后下降的趨勢，當發(fā)酵到9 d 時，感官評分最高；發(fā)酵時間少于9 d 時，感官評分一直處于上升階段，說明冠突散囊菌快速增長，慢慢覆蓋牛蒡片，并在生物代謝作用下，底物分解聚合轉(zhuǎn)化成小分子化合物，“金花菌”的香氣快速增加，發(fā)酵茶的品質(zhì)自然提升；發(fā)酵時間超過9 d 后，感官評分開始下降，可能過長的發(fā)酵時間，導致菌株衰退和產(chǎn)生不良的風味。因此，試驗控制發(fā)酵時間在9 d 左右。

2.1.4 響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝試驗結(jié)果

響應面試驗結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗結(jié)果

建立冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶工藝參數(shù)的回歸模型，得到感官評分Y 的響應值對自變量A，B，C 的二次多項式回歸方程：

響應面回歸模型方差分析見表4。

由表4 可知，回歸模型F=471.70，p＜0.000 1，表明該模型極顯著，失擬項p 值為0.312 2＞0.050 0，為不顯著，說明此回歸方程是可信的；回歸系數(shù)R2=0.977 3，表明該方程具有較好的擬合性，可以用來表示各參數(shù)對響應值的影響。R2Adj=0.948 0 表明該模型可以對94.80%的感官評分變化作出合理的解釋?？傮w而言，該結(jié)果具有較好的可靠性，且誤差較低，符合實際，可用來對冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶試驗的分析和預測。一次項C 對感官評分影響顯著（p＜0.05），二次項A2，B2，C2對發(fā)酵茶感官評分影響都為極顯著（p＜0.01），交互項BC 對感官評分影響顯著（p＜0.05）。由圖4 可知，發(fā)酵時間的曲線最陡峭、等高線最密集，結(jié)合表4 中p 值可看出，3 個因素對發(fā)酵牛蒡茶感官評分影響的順序為發(fā)酵時間＞接種量＞基質(zhì)含水量，而發(fā)酵時間和接種量的交互作用對結(jié)果影響最大。

圖4 B，C 交互作用對發(fā)酵牛蒡茶感官評分影響的等高線圖和曲面圖

根據(jù)響應面試驗模型預測的冠突散囊菌發(fā)酵牛蒡茶的最佳發(fā)酵工藝條件為基質(zhì)含水量25.09%（以牛蒡切片質(zhì)量為基準），接種量4.87%，發(fā)酵時間9.27 d，此條件下感官評分為預測為91.51 分。為便于實際操作，調(diào)整為基質(zhì)含水量25.00%，接種量4.87%，發(fā)酵時間9.5 d，并在此條件下再進行3 次平行驗證試驗，所得產(chǎn)品的感官評分為92.13 分，與模型預測得分接近，說明該模型預測具有一定的可靠性，優(yōu)化條件較為合理。

B，C 交互作用對發(fā)酵牛蒡茶感官評分影響的等高線圖和曲面圖見圖4。

2.2 牛蒡切片與發(fā)酵牛蒡茶感官評價結(jié)果

根據(jù)外形、氣味、滋味、湯色4 項指標對牛蒡切片和冠突散囊菌發(fā)酵的牛蒡茶成品進行比較。

牛蒡切片與發(fā)酵牛蒡茶對比見圖5，發(fā)酵前后牛蒡感官評定見表5。

圖5 牛蒡切片與發(fā)酵牛蒡茶對比

表5 發(fā)酵前后牛蒡感官評定

在外形方面，牛蒡切片為白褐色，表面較粗糙且顆粒感強，發(fā)酵牛蒡茶成品表面均勻覆蓋金黃色的菌絲；在香氣方面，牛蒡茶成品有青絲味，而發(fā)酵牛蒡茶后則帶有清新的花果香和烘焙的焦香。經(jīng)過熱水沖泡3 min 后，牛蒡切片呈淺黃色、有苦澀感和草藥味、入口清淡，發(fā)酵牛蒡茶茶湯金黃澄清、無苦澀味、富有“金花菌”的風味、甘甜醇厚。由于冠突散囊菌在增長繁殖過程中，牛蒡活性成分的氧化、降解和生物轉(zhuǎn)化，使得發(fā)酵牛蒡茶茶湯滋味醇厚，而水溶性褐色素的分泌又增進了茶湯的色澤[13]。

3 結(jié)論

通過響應面優(yōu)化試驗得到冠突散囊菌發(fā)酵制備牛蒡發(fā)酵茶的最佳工藝為牛蒡基質(zhì)含水量25.00%，接種量4.87%，發(fā)酵時間9.5 d，在此條件所得產(chǎn)品茶湯金黃澄清、無苦澀味，富有“金花菌”的風味、甘甜醇厚，感官評分達到91.51 分。發(fā)酵后牛蒡茶的品質(zhì)得到改善，具體的變化規(guī)律和機制需要進一步進行研究。