不同方法對蒲公英多糖脫色工藝條件優(yōu)化的研究

周 彤，閆寒汐，朱李想，張 睿，胡佳悅，吳 蕭

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

0 引言

蒲公英，又名蘇葉、野蘇、皺蘇等，屬于一年生直立草本植物，其葉、莖、根等均可入藥，是藥食兩用的60 種中藥之一[1]。蒲公英葉又叫蘇葉，含有多酚、蒲公英醛、黃酮類、色素類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗炎、治風(fēng)寒、宜肺止咳、安胎、清熱解毒等功能[2]。蒲公英葉多糖中含有許多花色素苷，包括9 種花色素苷及其順式異構(gòu)體，其中屬丙二?；压幒推压幒孔疃郲3]，使蒲公英葉多糖提取液呈黑、紅紫色，顏色較深，影響其純度，不利于多糖的研究和應(yīng)用。

對蒲公英多糖的脫色進行研究。關(guān)于多糖的脫色現(xiàn)在大多有物理和化學(xué)2 種方法。化學(xué)方法是利用物質(zhì)的強氧化性破壞色素的結(jié)構(gòu)而使其脫色，如次氯酸，但這種方法很容易破壞物質(zhì)成分。物理方法是利用吸附能力來吸附色素顆粒使其脫色[4]，其成本低、影響小。常用的吸附劑有樹脂[5-7]和活性炭[8-9]。主要用蒲公英葉多糖提取液為研究對象，以多糖提取液的脫色率和多糖損失率作為指標(biāo)，在活性炭添加量、加熱時間、加熱溫度、pH 值各單因素基礎(chǔ)下，比較粉末狀活性炭和LSA-200B 型樹脂作為吸附劑的2 種脫色方法，得出蒲公英葉多糖提取液脫色的最佳辦法。最后用響應(yīng)面法[10]優(yōu)化最佳脫色方法的工藝條件，得出對蒲公英葉多糖提取液的最優(yōu)脫色工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

蒲公英全草，北京同仁堂宿州藥店提供；粉末狀活性炭，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；LSA-200B 型大孔吸附樹脂，鄭州和成新材料科技有限公司提供。

1.2 試劑

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、濃硫酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；苯酚，麥克林有限公司提供；鹽酸，上海振企化學(xué)試劑有限公司提供；PBS 緩沖液，生工生物工程股份有限公司提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 蒲公英多糖提取液的提取及脫色工藝流程

（1） 工藝流程。

蒲公英全草→粉碎→過篩→提取→提濾→蒲公英多糖提取液→活性炭、樹脂脫色→蒲公英多糖脫色液。

（2） 操作要點。將干燥的蒲公英全草用多功能粉碎機粉碎，過80 目篩，得到蒲公英粉，在密封干燥的條件下保存?zhèn)溆?。精確稱取2.0 g 粉末，按一定比例加入蒸餾水，采取超聲波法[11]提取蒲公英多糖，保持超聲溫度為60 ℃，提取時間為2 h，抽濾得到蒲公英多糖提取液，分別添加粉末狀活性炭、LSA-200B 型樹脂進行脫色處理，得到蒲公英多糖脫色液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g 置于燒杯中，加入蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)入容量瓶中，再加蒸餾水定容至50 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0，1，2，3，4，5，6 mL 上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于7 支試管中，加蒸餾水至10 mL，分別得到質(zhì)量濃度為0，10，20，30，40，50，60 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。各取2 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液放入試管，向每只試管加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液1 mL，之后再加入濃硫酸溶液5 mL，搖勻，室溫反應(yīng)30 min。將反應(yīng)液于波長490 nm 處，用零號管作空白對照，測定溶液吸光度。每組做3 次平行試驗，取平均值。多糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合出回歸方程。

1.3.3 蒲公英葉多糖脫色率的計算

（1） 蒲公英葉多糖提取液吸收峰的檢測。將蒲公英葉多糖提取液經(jīng)全波段掃描，設(shè)置參數(shù)：中速掃描、波長間隔1.0 nm、波長范圍190.0～1 100.0 nm。結(jié)果顯示，在波長330 nm 處有吸收峰，故以該波長作為檢測波長[4]。

（2） 多糖脫色率公式。

式中：A0——脫色前吸光度；

A1——脫色后吸光度[5]。

1.3.4 蒲公英葉多糖損失率的計算

樣品多糖含量測定用苯酚- 硫酸法[12]。按下式計算多糖損失率。

式中：m0——原樣品多糖含量，g；

m1——脫色處理后多糖含量，g。

1.3.5 單因素試驗

（1） 脫色劑添加量對蒲公英多糖脫色工藝的影響。在蒲公英多糖提取液的稀釋液（調(diào)整pH 值至6.5） 中分別添加粉末狀活性炭、LSA-200B 型樹脂。其添加量分別為0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%，2.00%。置于40 ℃水浴鍋中加熱20 min。之后對其抽濾，測定吸光度，3 組平行取平均值，計算蒲公英多糖提取液的脫色率和多糖損失率。

（2） 加熱時間對蒲公英多糖脫色工藝的影響。粉末狀活性炭、LSA-200B 型樹脂添加量為0.75%。分別在40 ℃水浴鍋中加熱5，10，15，20，25，30 min。其余步驟同1.3.5（1）。

（3） 溫度對蒲公英多糖脫色工藝的影響。粉末狀活性炭、LSA-200B 型樹脂添加量為0.75%。分別于30，40，50，60，70，80 ℃水浴鍋中加熱20 min。其余步驟同1.3.5（1）。

（4） pH 值對蒲公英多糖脫色工藝的影響。用緩沖液調(diào)整蒲公英多糖提取液的pH 值分別為5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，粉末狀活性炭、LSA-200B型樹脂添加量為0.75%。分別于40 ℃水浴鍋中加熱20 min。其余步驟同1.3.5（1）。

1.3.6 響應(yīng)面分析

根據(jù)上述在活性炭添加量、加熱時間、加熱溫度、pH 值各單因素試驗下，比較粉末狀活性炭和LSA-200B 型樹脂作為吸附劑的2 種脫色方法，得出粉末狀活性炭對多糖進行脫色是蒲公英多糖提取液的最佳脫色方法，用響應(yīng)面法[10]進一步優(yōu)化粉末狀活性炭脫色方法的工藝條件。

響應(yīng)面因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定結(jié)果

按照上述1.3.2 方法，測出試驗數(shù)據(jù)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=0.011 2X-0.073（相關(guān)系數(shù)R2=0.994 9）。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 脫色劑添加量對蒲公英多糖脫色工藝的影響

脫色劑添加量對蒲公英多糖脫色率和損失率的影響。根據(jù)上述1.3.5（1） 方法，測出其吸光度，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪出曲線。

脫色劑添加量對蒲公英葉多糖脫色率的影響見圖2，脫色劑添加量對蒲公英多糖的多糖損失率的影響見圖3。

圖2 脫色劑添加量對蒲公英葉多糖脫色率的影響

圖3 脫色劑添加量對蒲公英多糖的多糖損失率的影響

由圖2 可知，當(dāng)活性炭添加量達到0.75%時，其脫色率最大，達到了86.7%。在相同的條件下，樹脂的脫色率最高僅為40%。

由圖3 可知，當(dāng)活性炭添加量為0.75%時多糖損失率最低，僅為18%。在相同的條件下，樹脂的多糖損失率總體要比活性炭中損失的小。

綜合圖2，圖3 來看，相同條件下，活性炭對蒲公英多糖脫色效果比樹脂好。當(dāng)活性炭添加量為0.75%時，多糖脫色率為86.2%，多糖損失率僅為18%，此時活性炭脫色效果最佳。

2.2.2 加熱時間對蒲公英多糖脫色工藝的影響

加熱時間對蒲公英多糖脫色率和損失率的影響。根據(jù)上述1.3.5（2） 方法，測出其吸光度，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪出曲線。

加熱時間對蒲公英葉多糖脫色率的影響見圖4，加熱時間對蒲公英葉多糖損失率的影響見圖5。

圖4 加熱時間對蒲公英葉多糖脫色率的影響

圖5 加熱時間對蒲公英葉多糖損失率的影響

由圖4 可知，當(dāng)加熱20 min 時，活性炭脫色率最好，為93.3%。在相同的條件下，樹脂的脫色率最高為12.7%。

由圖5 可知，當(dāng)加熱20 min 時，多糖損失率最小，僅為18.6%。在相同的條件下，樹脂的多糖損失率總體比在活性炭中損失的小。

綜合圖4，圖5 來看，相同條件下，活性炭對蒲公英葉多糖脫色效果比樹脂好。當(dāng)加熱時間為20 min時，多糖脫色率為93.3%，多糖損失率僅為18.6%，此時活性炭脫色效果最佳。

2.2.3 加熱溫度對蒲公英多糖脫色工藝的影響結(jié)果

加熱溫度對蒲公英多糖脫色率和損失率的影響。根據(jù)上述1.3.5（3） 方法，測出其吸光度，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪出曲線。

加熱溫度對蒲公英葉多糖脫色率的影響見圖6，加熱溫度對蒲公英葉多糖損失率的影響見圖7。

圖6 加熱溫度對蒲公英多糖脫色率的影響

圖7 加熱溫度對蒲公英葉多糖的多糖損失率的影響

由圖6 可知，當(dāng)加熱溫度為60 ℃時，活性炭脫色率最高，達到94.3%。在相同的條件下，樹脂的脫色率最高只達到了8.7%。

由圖7 可知，當(dāng)加熱溫度在60 ℃時，活性炭的多糖損失率最小，僅為20.4%。在相同的條件下，樹脂的多糖損失率總體比在活性炭中損失的小。

綜合圖6，圖7 來看，相同條件下，活性炭對蒲公英葉多糖脫色效果比樹脂好。當(dāng)加熱溫度為60 ℃時，多糖脫色率為94.3%，多糖損失率僅到20.4%，此時活性炭脫色效果最佳。

2.2.4 pH 值對蒲公英多糖脫色工藝的影響

pH 值對蒲公英多糖脫色率和損失率的影響。根據(jù)上述1.3.5（3） 方法，測出其吸光度，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)繪出曲線。

pH 值對蒲公英多糖脫色率的影響見圖8，pH 值對蒲公英多糖損失率的影響見圖9。

圖8 pH 值對蒲公英多糖脫色率的影響

圖9 pH 值對蒲公英多糖損失率的影響

由圖8 可知，當(dāng)pH 值為5 時，活性炭脫色率最高，達到87.1%。在相同的條件下，樹脂的脫色率最高只達到了14.3%。

由圖9 可知，當(dāng)pH 值為5.5 時，活性炭多糖損失率最小，僅為20.5%。在相同的條件下，樹脂最小多糖損失率為26.7%。

綜合圖8，圖9 來看，相同條件下，活性炭對蒲公英葉多糖脫色效果比樹脂好。當(dāng)pH 值為5.5 時，多糖脫色率為85.6%，多糖損失率僅到20.5%，此時活性炭脫色效果最佳。

綜合加熱時間、活性炭添加量、加熱溫度、pH值4 個單因素下蒲公英多糖脫色率和多糖損失率來看，用活性炭脫色比用樹脂脫色的效果好。因此，采用響應(yīng)面法對活性炭脫色的方法做進一步的條件優(yōu)化的研究。

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析[14-16]

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

以活性炭添加量、加熱時間、加熱溫度、pH 值4 個因素進行單因素響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析。

響應(yīng)面設(shè)計與分析見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與分析

2.3.2 模型回歸的擬合

多元回歸分析后，得到的二次多項方程式分別為：

由方程可知，加熱溫度與pH 值之間的交互效果對多糖脫色率的作用最大，活性炭添加量與加熱溫度之間的交互效果對多糖脫色率的作用最??；加熱時間與pH 值之間的交互效果對多糖損失率的作用最大，活性炭添加量與pH 值之間的交互效果對多糖損失率的作用最小。

2.3.3 模型有效性的檢驗

為檢驗?zāi)Ｐ偷挠行?，對響?yīng)面法模型進行方差分析。

蒲公英葉多糖提取液脫色率的回歸模型方差分析與系數(shù)顯著性檢驗見表3，蒲公英葉多糖提取液的多糖損失率的回歸模型方差分析與系數(shù)顯著性檢驗見表4。

表3 蒲公英葉多糖提取液脫色率的回歸模型方差分析與系數(shù)顯著性檢驗

由表3 可知，模型顯著性p＜0.000 1，模型極顯著，則該模型有效；并且失擬差p=0.615 7＞0.05，即不顯著，所以回歸方程模型與真實的試驗數(shù)值差別較小。相關(guān)系數(shù)為R2=0.933 6，表明該回歸方程模型的擬合度良好，該試驗誤差少，模型可用于分析每個影響因素對蒲公英葉多糖提取液的脫色率的影響情況。

由表4 可知，回歸方程的模型顯著性p＜0.000 1，模型極顯著，則該模型有意義；并且失擬差p=0.215 9＞0.05，即不顯著，所以回歸方程模型與實際的試驗數(shù)值差異較小。相關(guān)系數(shù)為R2=0.939 6，說明該回歸方程模型有良好的擬合程度，試驗誤差少，此模型可用于分析每個影響因素對蒲公英葉多糖提取液的多糖損失率的影響情況。

2.3.4 響應(yīng)面分析

活性炭添加量和加熱時間對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖10，活性炭添加量和加熱溫度對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖11，活性炭添加量和pH 值對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖12，加熱時間和加熱溫度對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖13，加熱時間和pH 值對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖14，加熱溫度和pH 值對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用見圖15。

圖10 活性炭用量和加熱時間對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用

圖11 活性炭用量和加熱溫度對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用

圖12 活性炭添加量和pH 值對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用

圖13 加熱時間和加熱溫度對蒲公英葉多糖脫色效果的交互作用

由圖10（a） 可知，蒲公英葉多糖提取液的脫色率隨活性炭添加量的增加先緩慢上升然后趨于穩(wěn)定；蒲公英葉多糖提取液的脫色率隨加熱時間的增加明顯增加，曲線變化較為陡峭，說明加熱時間對多糖提取液的脫色率作用十分明顯。觀察等高線圖得出兩者的交互效果極顯著，說明脫色率主要受活性炭添加量和加熱時間的共同影響。由圖10（b） 可知，活性炭添加量對蒲公英葉多糖提取液的多糖損失率的作用明顯，而多糖損失率伴隨加熱時間的增加先增大后降低，說明對多糖損失率的影響也顯著。但是，觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明多糖損失率主要受用量影響。

由圖11（a） 可知，活性炭添加量的變化對多糖提取液的脫色率作用明顯，而脫色率隨著加熱時間的增加沒有顯著的變化。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明脫色率主要受用量影響。由圖11（b） 可知，活性炭添加量和加熱溫度對多糖損失率的作用顯著，且觀察等高線圖得出兩者的交互效果顯著。說明多糖損失率主要受用量和溫度的共同影響。

由圖12（a） 可知，活性炭添加量的升高和pH 值的上升都使脫色率有所提高。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明脫色率主要受單因素影響。由圖12（b） 可知，活性炭添加量的增加和pH 值的上升使得多糖損失率的作用顯著。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明多糖損失率主要受活性炭添加量影響。

由圖13（a） 可知，加熱時間的上升使脫色率明顯提高，而加熱溫度對脫色率的影響不明顯。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明脫色率主要受時間影響。由圖13（b） 可知，活性炭添加量的增加與pH 值的增加都使多糖損失率的變化顯著。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明多糖損失率主要受時間影響。

由圖14（a） 可知，加熱時間的增加使蒲公英葉多糖提取液的脫色率顯著提高，但是pH 值對脫色率的作用不突出。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明脫色率主要受加熱時間影響。由圖14（b） 可知，加熱時間的增加和pH 值的增加都使蒲公英葉多糖提取液的多糖損失率的變化明顯，且觀察等高線圖得出兩者的交互效果顯著，說明多糖損失率主要受加熱時間和pH 值的共同影響。

由圖15（a） 可知，加熱溫度和pH 值的增加使得脫色率顯著升高。觀察等高線圖得出兩者的交互效果顯著，說明脫色率主要受加熱溫度和pH 值的共同影響。由圖15（b） 可知，加熱溫度的增加和pH 值的增加都使多糖損失率有所增加。觀察等高線圖得出兩者的交互效果不顯著，說明多糖損失率主要受加熱溫度影響。

2.3.5 驗證試驗

試驗得出蒲公英葉多糖的最佳脫色工藝參數(shù)為活性炭添加量0.50%，加熱時間25 min，加熱溫度70 ℃，pH 值5.0，此時蒲公英葉多糖脫色率為99.39%，蒲公英葉多糖損失率僅達到8.05%。在此最佳脫色工藝條件下進行試驗驗證，做3 次平行試驗，取其平均值。得出蒲公英葉多糖脫色率為98.86%，多糖損失率僅達到8.63%，與模型預(yù)測值差別不大。

3 結(jié)論

在單因素試驗的前提下，比較得出粉末狀活性炭對蒲公英葉多糖提取液的脫色效果比樹脂有效很多，具備高脫色率、低多糖損失的特征，而且操作方便、節(jié)省費用，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化粉末狀活性炭對蒲公英葉多糖提取液脫色的工藝條件。結(jié)果表明，蒲公英葉多糖脫色的最優(yōu)工藝條件為活性炭添加量0.50%，加熱時間25 min，加熱溫度70 ℃，pH 值5.0，此時蒲公英葉多糖脫色率為99.39%，蒲公英葉多糖損失率僅達到8.05%。對最優(yōu)脫色條件進行試驗驗證，得到蒲公英葉多糖脫色率為98.86%，多糖損失率僅達到8.63%，與響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果相差無幾。

蒲公英葉多糖提取液因為含有花色素苷，使其顏色較深，極大地阻礙了對蒲公英多糖功效的開發(fā)研究。因此，對蒲公英葉多糖進行脫色方面的研究價值較大，得出了蒲公英葉多糖的最優(yōu)脫色條件，提高了多糖的純度與質(zhì)量，更有利于對蒲公英葉多糖更深層次的研究。