非水溶液氯硝西泮注射劑無菌檢查法的研究

王 璐 ，向 東 ，張 艷 ，劉 勤 ，黃 珊 ，徐 帆

（1）云南省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，工業(yè)和信息化部產(chǎn)業(yè)技術(shù)基礎(chǔ)公共服務(wù)平臺，云南 昆明 650106;2）浙江泰林生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051;3）聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032）

氯硝西泮臨床主要用于控制各型癲癇，尤適用于肌陣攣性失神發(fā)作、運(yùn)動(dòng)不能發(fā)作及嬰兒痙攣癥Lennox-Gastaut 綜合征[1-3]。氯硝西泮含有內(nèi)酰胺和亞胺鍵，在水溶液中易水解產(chǎn)生雜質(zhì)[4]，因此該化合物在水溶液中是不穩(wěn)定的。在《中國藥典》2015 年版生效前，氯硝西泮注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中沒有有關(guān)物質(zhì)檢測項(xiàng)[4]，當(dāng)時(shí)國內(nèi)市場的氯硝西泮注射液均為水溶液，能符合當(dāng)時(shí)藥典版本的標(biāo)準(zhǔn)要求。2020 年后，按《中國藥典》2020年版要求[4]，水溶液的氯硝西泮注射液無法滿足穩(wěn)定性要求，不能符合現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此國內(nèi)市場上沒有氯硝西泮注射液產(chǎn)品，目前屬于市場空白?，F(xiàn)國內(nèi)有藥品生產(chǎn)企業(yè)做藥品一致性評價(jià)，參考國外原研產(chǎn)品處方，注射液的輔料改用無水乙醇、冰醋酸、苯甲醇及丙二醇，注射劑規(guī)格采用用一針一水的組合，即一針氯硝西泮非水注射液加一支稀釋溶劑，臨床使用時(shí)，現(xiàn)場用氯硝西泮非水注射液和稀釋溶劑配制，這樣從根本上解決穩(wěn)定性問題。但非水溶液的注射液的無菌檢查不屬于藥典的常規(guī)檢驗(yàn)方法，研究較少，相比水溶液來說，無菌檢查方法應(yīng)該考慮有機(jī)溶劑對培養(yǎng)器濾膜及杯體材質(zhì)的影響，有的有機(jī)溶劑會(huì)與集菌培養(yǎng)器濾膜發(fā)生反應(yīng)造成膜溶解，或者與集菌培養(yǎng)器杯體材質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；有的有機(jī)溶劑會(huì)與培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)造成渾濁，以上情況與樣品有菌生長從而使培養(yǎng)基渾濁表現(xiàn)一致，容易造成誤判；有的對樣品內(nèi)微生物的會(huì)有抑制作用。為了確保氯硝西泮注射液非水溶液無菌檢查法的準(zhǔn)確性和可靠性，保證臨床用藥安全，現(xiàn)對氯硝西泮注射液中4 種有機(jī)溶劑對培養(yǎng)器不同材質(zhì)的濾膜及杯體的影響，以及樣品溶液pH 值，沖洗液的品種及數(shù)量對樣品中微生物的影響進(jìn)行研究，通過無菌檢查適用性試驗(yàn)，篩選并優(yōu)化方法，建立可行可靠的無菌檢驗(yàn)方法[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器

HPP260eco 生化培養(yǎng)箱（德國美墨爾特），STI-1800DTC 無菌隔離系統(tǒng)（浙江泰林生物技術(shù)有限公司），210-KpH 計(jì)（BETTLER TOLEDO），AC2-4S1 級A2 型生物安全柜（ESCO Airstream），全自動(dòng)過濾器膜完整性測試儀FT223（浙江泰林生物技術(shù)有限公司），集菌培養(yǎng)器（包含復(fù)合纖維素膜、聚偏二氟乙烯PVDF 膜、尼龍膜、丙烯腈-苯乙烯樹脂AS 杯體，聚對苯二甲酸類塑料PET 杯體，均為浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品）。

1.2 試劑

氯硝西泮注射液（樣品A、B、C、D、E、F 批號分別為2107F01231、2107F02231、2107F03231、2201F01231、2201F02231、2201F03231，規(guī) 格：每支裝1 mL，以上樣品均為國內(nèi)A 企業(yè)生產(chǎn)），硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTM 批號：20220405 北京三藥 科技開發(fā)公司），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB 批號：20220412 北京三藥科技開發(fā)公司），pH7.0 氯化鈉-蛋白胨液（批號：L2332Y 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），氯化鈉注射液（批號：210225-04，蚌埠豐原涂山制藥有限公司），丙二醇（批號：20211104，南京威爾藥業(yè)股份有限公司），冰醋酸（批號1803101，上海申博 化工有限公司），無水乙醇（批號：210410 1 四川西隴科學(xué)有限公司），苯甲醇（批號C-08-201201 江蘇保易制藥有限公司）。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌，批號210929［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌，批號22021［CMCC（B）44102］、生孢梭菌，批號211023［CMCC（B）64941］、枯草芽孢桿菌，批號210202［CMCC（B）63501］、白色念株菌，批號211208［CMCC（F）98001］、黑曲霉，批 號210302［ CMCC（F）98003］，以上菌珠含量均為1.0～2.0 cfu×103/顆，均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.4 研究方法

1.4.1 菌液制備首先將菌珠平衡至室溫，將2 mL 復(fù)溶液加入菌珠西林瓶中，蓋好瓶蓋，混旋10 s 使其溶解，吸取1 mL 已完全溶解的菌液，加入9 mL 的氯化鈉注射液中，混勻，即為含菌量＜100 cfu/mL 的菌液[6]。

1.4.2 集菌培養(yǎng)器濾膜及杯體選擇實(shí)驗(yàn)取樣品A60 支，按薄膜過濾法處理，分別通過復(fù)合纖維素膜、尼龍膜、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜材質(zhì)的培養(yǎng)器，培養(yǎng)器杯體材質(zhì)均為丙烯腈-苯乙烯樹脂（acrylonitrile-styrene resin，AS），每10 支通過1 個(gè)濾筒，每種膜分別加入硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（thioglycolate fluid medium，F(xiàn)TM）和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（trypticase soy broth，TSB）。取不含氯硝西泮的空白溶劑60 mL，按上述方法處理，每10 mL 通過1 個(gè)濾筒。分別取輔料無水乙醇、丙二醇、苯甲醇、冰醋酸10 倍稀釋液60 mL，按上述方法處理，每10 mL通過1 個(gè)濾筒。陰性對照取上述培養(yǎng)器直接加入FTM 和TSB 培養(yǎng)基。

1.4.3 樣品溶液pH 范圍考察取樣品A20 支，稀釋至200 mL 的氯化鈉注射液中，選用尼龍膜，杯體材質(zhì)為聚對苯二甲酸類塑料（PET）的培養(yǎng)器，濾膜用至少20 mL 氯化鈉注射液潤濕，上述供試液通過2 個(gè)濾筒，然后用氯化鈉注射液溶液沖洗，每膜每次100 mL，共3 次，分別加入FTM 和TSB 培養(yǎng)基。取樣品A20 支，稀釋液及沖洗液使用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液，同上法操作。取樣品B、D 同上法操作。

1.4.4 無菌檢查方法學(xué)適用性試驗(yàn)[7]取樣品A60 支，稀釋至600 mL 的pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液中，選用尼龍膜，杯體材質(zhì)為PET 的培養(yǎng)器，濾膜用至少20 mL pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液潤濕，每100 mL 通過1 個(gè)濾筒，然后用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液洗，每膜每次100 mL，共3 次，在最后1 次沖洗液中加入小于100 cfu 的菌液，在其中3 個(gè)濾筒內(nèi)加入FTM 培養(yǎng)基（接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌的），在其余3 個(gè)濾筒加入TSB 培養(yǎng)基（接種枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的）。取樣品BCDEF 同上操作。陽性對照不加供試品，其余操作如上，逐日觀察。

1.4.5 無菌檢查非水溶液氯硝西泮注射無菌檢查方法：取本品，選用濾膜為尼龍膜，杯體材質(zhì)為PET 的集菌培養(yǎng)器，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液稀釋（不少于10 倍），按薄膜過濾法處理，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液沖洗（每膜不少于 300 mL），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（《中國藥典》2020 年版四部通則1101）。

2 結(jié)果

2.1 集菌培養(yǎng)器濾膜及杯體選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

氯硝西泮注射液及空白溶劑直接過濾引起培養(yǎng)基渾濁，且渾濁程度基本一致，說明渾濁原因不是因?yàn)槁认跷縻龀?，?yīng)是有機(jī)溶劑造成。將4 種輔料拆分實(shí)驗(yàn)，可以看到過濾丙二醇加入培養(yǎng)基后顯渾濁，將培養(yǎng)器做膜通透性分析，顯示膜完整，渾濁原因應(yīng)是丙二醇可能與AS 杯體反應(yīng)故呈渾濁。無水乙醇、苯甲醇及10 倍稀釋的冰醋酸過濾加入培養(yǎng)基顯渾濁，將培養(yǎng)器做膜通透性分析，顯示部分膜溶解，復(fù)合纖維素膜的溶解程度大于PVDF 膜及尼龍膜，渾濁原因應(yīng)是膜溶解后引起培養(yǎng)基渾濁，見表1、圖1，無水乙醇及冰醋酸造成膜溶解，培養(yǎng)基漏出，故沒有照片。

圖1 集菌培養(yǎng)器濾膜及杯體選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of the selection experiment of filter membrane and cup of the incubator

表1 濾膜通透性檢測Tab.1 Filter membrane permeability test results

2.2 樣品溶液pH 范圍考察

沖洗后2 種培養(yǎng)基pH 范圍在5.99～7.16 之間，該pH 范圍符合絕大多數(shù)微生物生長，見表2。

2.3 無菌檢查方法學(xué)適用性試驗(yàn)

供試品各培養(yǎng)器中試驗(yàn)菌均生長良好，與陽性對照管一致，見表3，無菌檢查方法適用性試驗(yàn)通過。

表3 無菌檢查方法學(xué)適用性試驗(yàn)Tab.3 Test results of the suitability of sterility test methodology

2.4 無菌檢查

對氯硝西泮注射液6 個(gè)批號樣品分別進(jìn)行無菌檢查，培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)期間逐日觀察，結(jié)果供試品管均澄清，無菌生長，符合規(guī)定。陽性對照菌24 h 生長良好，陰性對照各管在培養(yǎng)期間無菌生長，見表4，說明此無菌檢查方法適用于該制劑。

表4 樣品無菌檢查結(jié)果Tab.4 Results of sample sterility test

3 討論

集菌培養(yǎng)器濾膜及杯體的選擇，將4 種輔料拆分實(shí)驗(yàn)，可以看到過濾丙二醇加入培養(yǎng)基后顯渾濁，將培養(yǎng)器做膜通透性分析，顯示膜完整，渾濁原因應(yīng)是丙二醇可能與AS 杯體反應(yīng)故呈渾濁。無水乙醇、苯甲醇及10 倍稀釋的冰醋酸過濾加入培養(yǎng)基顯渾濁，將培養(yǎng)器做膜通透性分析，顯示部分膜溶解，復(fù)合纖維素膜的溶解程度大于PVDF 膜及尼龍膜，渾濁原因應(yīng)是膜溶解后引起培養(yǎng)基渾濁，另外苯甲醇不溶于水，也可能殘留于杯體及濾膜的苯甲醇不溶于水性培養(yǎng)基引起渾濁[8]，考慮到尼龍膜比復(fù)合纖維素膜耐受性更好，而且可用于抑菌成分，吸附性低，帶支撐層，耐得住沖洗，PVDF 膜雖然兼容性也比較好，但成本過于昂貴，杯體材質(zhì)PET 比AS 對酸堿及有機(jī)溶劑耐受性更好[9]，故正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇濾膜為尼龍膜，杯體材質(zhì)為PET，同時(shí)將樣品稀釋，并及時(shí)進(jìn)行沖洗，盡量降低有機(jī)溶劑與膜或者杯體接觸的時(shí)間和濃度。

不同沖洗液沖洗后兩種培養(yǎng)基pH 范圍在5.99～7.16 之間，該pH 范圍符合絕大多數(shù)微生物生長[10]，考慮到該樣品本身的pH 值為4.0 左右，pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液更適合偏堿或偏酸的樣品，故選擇pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液為稀釋液及沖洗液[11]。

本研究結(jié)果顯示，非水溶液的注射劑在進(jìn)行無菌檢查時(shí)需考慮的因素較多。如溶劑為有機(jī)相，應(yīng)考慮有機(jī)相對集菌培養(yǎng)器的濾膜和杯體的材質(zhì)的影響，還需考慮非水溶液的pH 值，如pH 改變時(shí)會(huì)不會(huì)造成樣品析出；非水溶液中溶劑與水性培養(yǎng)基是否互溶，會(huì)不會(huì)影響培養(yǎng)基的靈敏度[12]。還需考慮溶劑存不存在抑菌作用，如無水乙醇等存在較強(qiáng)抑菌作用，必須消除其抑菌作用才能進(jìn)行無菌檢查[13]。沖洗液的選擇不得影響樣品中微生物的生長[14]，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究采用薄膜過濾法，對氯硝西泮注射液的4 種有機(jī)溶劑分別進(jìn)行探索研究，對培養(yǎng)器濾膜及杯體的材質(zhì)，沖洗液的選擇及用量等條件進(jìn)行了篩選[15-16]?？紤]樣品的pH 值影響因素，有機(jī)溶劑的抑菌效應(yīng)，經(jīng)過條件優(yōu)化，最終建立了非水溶液氯硝西泮注射液的無菌檢查方法：取本品，選用濾膜為尼龍膜，杯體材質(zhì)為PET 的集菌培養(yǎng)器，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液稀釋（不少于10 倍），按薄膜過濾法處理，用pH 為7.0 氯化鈉蛋白胨溶液沖洗（每膜不少于 300 mL），以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查（《中國藥典》2020 年版四部通則 1 101）[6]，應(yīng)符合規(guī)定，通過方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)證明，該方法可行、結(jié)果可靠，本研究同時(shí)給非水溶液的其他注射劑的無菌檢查提供了參考。