基于響應(yīng)面法優(yōu)化水鬼蕉中水仙環(huán)素的提取工藝

黃 云 ，趙安楠 ，劉秋月 ，高偉民 ，李 霽

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500;2）云南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，云南 昆明 650534）

水鬼蕉（Hymenocallis littoralis）又名蜘蛛蘭，為石蒜科水鬼蕉屬植物。水鬼蕉性溫味辛，以葉及鱗莖入藥具有舒筋活血，消腫止痛的功效以及良好的抗腫瘤活性。文獻(xiàn)報(bào)道其抗腫瘤活性主要來自于生物堿，其生物堿成分繁多復(fù)雜，現(xiàn)已知的生物堿有pancratistatine（水鬼蕉堿）、narciclasine（水仙環(huán)素）、7-deoxynarciclasine、7-deoxy-transdihydronarciclasine、littoraline、haemanthamine、hippeastrine、O-methyllycorenine、lycorine、homolycorine、lycorenine、lycoramine、vittatine、demethylmaritidine、pretazettine、tazettine、5，6-dihydrobicolorine、macronine 等18 種[1]。

Patrick Dumont 等[2-3]對(duì)水鬼蕉中活性生物家水仙環(huán)素進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)水仙環(huán)素具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。該化合物能夠通過抑制FAK 信號(hào)通路抑制食管癌細(xì)胞的增殖和遷移[4]，調(diào)節(jié)組織蛋白酶B和細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶途徑抑制口腔癌轉(zhuǎn)移[5]，通過Akt/mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬介導(dǎo)的凋亡[6]。此外，水仙環(huán)素還具有較好的抗炎活性[7]。

水仙環(huán)素（圖1）具有良好的藥理活性，但其含量較低，此外，其對(duì)照品價(jià)格昂貴，并且尚無較好的合成路徑，嚴(yán)重阻礙后續(xù)系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)研究。為了得到大量高純度水仙環(huán)素，有必要對(duì)其提取、分離、制備等條件進(jìn)行優(yōu)化。提取是制備過程中的第一步，增大提取率是要解決的首要問題。

圖1 水仙環(huán)素的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of narcicycline

目前文獻(xiàn)報(bào)道的關(guān)于水鬼蕉中水仙環(huán)素的提取方法是甲醇冷浸。冷浸法簡(jiǎn)便易行，但有提取效率較低，提取物質(zhì)雜質(zhì)多，提取時(shí)間過長(zhǎng)等缺點(diǎn)[8-12]。

此外，在提取實(shí)驗(yàn)中，通常存在提取實(shí)驗(yàn)因素水平眾多，并且存在交互作用等問題，因此考察提取因素水平時(shí)，會(huì)使用正交設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面設(shè)計(jì)來輔助設(shè)計(jì)最佳提取工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)建立預(yù)測(cè)模型，并且對(duì)模型適應(yīng)性、模型顯著性、系數(shù)顯著性和失擬項(xiàng)進(jìn)行檢驗(yàn)，從而進(jìn)一步進(jìn)行方差分析、模型診斷[12-16]。與常用的正交設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)面法能針對(duì)具體范圍利用爬坡試驗(yàn)得出可代表各因素交互關(guān)系的條件組合，此法更具有直觀性、精確性。

本實(shí)驗(yàn)在考慮實(shí)驗(yàn)條件和可操作性的前提下，通過比較冷浸法、回流提取法和超聲波提取法，同時(shí)綜合考慮水仙環(huán)素提取率、提取時(shí)間等因素，并以水仙環(huán)素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取水仙環(huán)素，高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其含量，為水仙環(huán)素的單體分離制備提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（日本島津，型號(hào)LC-2050C）、電子天平（慈溪市天冬衡器場(chǎng)，型號(hào)HX1002T）、超聲清洗儀（昆明中元美生物技術(shù)公司，型號(hào)SK3200H）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司，型號(hào)BNS-14）、磁力加熱攪拌器（上海泰坦科技股份有限公司，X85-2S）。

水鬼蕉（采于昆明呈貢）、水仙環(huán)素對(duì)照品（成都曼思特生物科技，純度99.00%）、超純水系統(tǒng)（力康公司，NW 基礎(chǔ)系列）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水仙環(huán)素的提取方法將水鬼蕉洗凈，取其莖部陰干，粉碎后過60 目篩，備用。3 種不同的提取方法如下：A 回流提取法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于25 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇后，在70 ℃的油浴中、15 ℃的冷凝條件下回流2 h，備用。B 超聲提取法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入甲醇后，室溫下超聲30 min。C 冷浸法：精密稱取原料粉末10.00 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入甲醇后，密封保存24 h。待完成后，抽濾，濾液在45 ℃下旋蒸濃縮，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中定容，備用。

精密稱取原料粉末9 份，均分為3 組（即A 回流組、B 超聲組、C 冷浸組），每組3 份，每份10.00 g，以液料比為3∶1 (mL/g)加入甲醇，按不同的提取方法試驗(yàn)，按“1.2.2 項(xiàng)下（1）”色譜條件進(jìn)樣并測(cè)定其峰面積，考察不同提取方法的提取率。

（1）單因素實(shí)驗(yàn)考察：以回流溫度（70 ℃）、回流時(shí)間（2 h）、液料比[3∶1（mL/g）]為參考依據(jù)，確定實(shí)驗(yàn)各單因素水平?；亓鳒囟瓤疾欤壕芊Q取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流時(shí)間（2 h）、液料比[3∶1（mL/g）]，考察回流溫度為60、70、80、90、100 ℃時(shí)的水仙環(huán)素的峰面積（n=3）。回流時(shí)間考察：精密稱取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流溫度（上述實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果）、液料比[3∶1（mL/g）]，考察回流時(shí)間為1、2、3、4、5 h 的水仙環(huán)素的峰面積（n=3）。液料比考察：精密稱取原料粉末15 份，每份10.00 g，固定回流溫度（上述實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果）、回流時(shí)間（上述實(shí)驗(yàn)最優(yōu)結(jié)果），考察液料比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g）的水仙環(huán)素的峰面積（n=3）。3 個(gè)因素考察實(shí)驗(yàn)樣品回流結(jié)束后，均抽濾旋蒸，用甲醇溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，備用。

（2）響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察：變量包括溫度、時(shí)間、液料比，以水仙環(huán)素提取率為響應(yīng)值。結(jié)合Box-Behnken 法，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素及水平（表1）。

表1 因素水平Tab.1 The level of factors

1.2.2 水仙環(huán)素含量測(cè)定

（1）色譜條件的選擇：色譜柱使用Diamonsil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，柱溫25.00 ℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為254 nm，流動(dòng)相采用純水（A）-乙腈溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件見表2。

表2 高效液相色譜梯度洗脫條件Tab.2 The gradient elution condition of HPLC

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取25 mL 容量瓶，精確加入水仙環(huán)素對(duì)照品0.000 5 g，甲醇定容，備用。精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 置于10 mL 容量瓶，甲醇定容至刻度線。按“1.2.2 項(xiàng)下（1）”色譜條件進(jìn)樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在0.2～1.6 μg 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素的峰面積與濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為：y=172.14x+8.9（R2=0.999 7），其中y 表示峰面積，x 表示濃度，單位μg/mL。

（3）精密度實(shí)驗(yàn)：取“1.2.2 項(xiàng)下（2）”中的對(duì)照品溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5 次。每次進(jìn)樣量為5 μL，結(jié)果表明，水仙環(huán)素峰面積的RSD 為1.640%。

（4）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一水鬼蕉樣品細(xì)粉（10.00 g）5 份，分別置于25 mL 圓底燒瓶中，加入甲醇后，在70 ℃的油浴中、15 ℃的冷凝條件下回流2 h，按照“1.2.2 項(xiàng)下（1）”色譜條件測(cè)定峰面積。水鬼蕉樣品水仙環(huán)素提取率平均值為1.38×10-4%，RSD值為0.582%，表明該方法重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：試品溶液在室溫下分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 進(jìn)樣，記錄相應(yīng)的峰面積值。結(jié)果水仙環(huán)素峰面積的RSD 值為1.20%，表明供試樣品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（6）加樣回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱取水鬼蕉樣品，配制成0.6、0.8、1.0 μg/mL（n=3），并分別向其中加入水仙環(huán)素對(duì)照品0.2 mL（0.8 μg/mL），測(cè)定峰面積，計(jì)算平均加樣回收率為100.28%（分別為：100.30%、100.80%、99.75%）；RSD 值為0.52%。

2 結(jié)果

2.1 3 種不同提取方法的比較結(jié)果

由圖2 和表3 可知：峰面積的大小為回流組 ＞冷浸組 ＞ 超聲組，其中回流組峰面積為冷浸組2 倍，且時(shí)間遠(yuǎn)小于24 h，故排除冷浸組。在此實(shí)驗(yàn)中，雖然回流組時(shí)間（2 h）大于超聲組（30 min），但其峰面積接近超聲組峰面積的5 倍，因此，選擇回流提取繼續(xù)后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)。

表3 3 種不同提取方法峰面積Tab.3 The peak area of three different extraction methods

圖2 3 種不同提取方法典型色譜圖（n=3）Fig.2 Typical chromatogram of three different extraction methods（n=3）

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同溫度對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響固定液料比為3∶1（mL/g）、回流時(shí)間為2 h 的條件下，考察回流溫度為60、70、80、90、100 ℃時(shí)水仙環(huán)素提取率的變化，結(jié)果見圖3。隨著提取溫度的升高，水仙環(huán)素的提取率也在相應(yīng)的增加，90 ℃時(shí)達(dá)到最大值，因此選擇90 ℃進(jìn) 行后續(xù)回流時(shí)間對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同溫度對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響（n=3）Fig.3 The effect of different temperature on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.2.2 不同時(shí)間對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響在回流溫度為90 ℃、液料比為3∶1（mL/g）的條件下，考察回流時(shí)間為1、2、3、4、5 h 時(shí)水仙環(huán)素提取率的變化，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，水仙環(huán)素的提取率隨時(shí)間的增加而呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，5 h 時(shí)達(dá)到最大值，如果繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，提取率依舊會(huì)增加。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響（n=3）Fig.4 The effect of different extraction time on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.2.3 不同液料比對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響在回流溫度為90 ℃、回流時(shí)間為2 h 的條件下，考察液料比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1（mL/g）時(shí)水仙環(huán)素提取率的變化，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，隨著液料比的增加，水仙環(huán)素的提取率液也相應(yīng)的增加，但是在4∶1 時(shí)略有下降，在5∶1 時(shí)達(dá)到最大，故選擇5∶1。

圖5 不同料液比對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響（n=3）Fig.5 The effect of different ratio of solid to liquid on the extraction rate of narcicycline（n=3）

2.3 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.3.1 回歸方程的建立與分析依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取液料比（C）為響應(yīng)面自變量，根據(jù)Box-BehnkenDesign試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)考察因素及其水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中分析因子12 個(gè)、零點(diǎn)5 個(gè)，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5 次，并利用 HPLC-PDA 檢測(cè)技術(shù)對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.4 Experimental design and results of response surface method

二次多項(xiàng)式回歸模型得到擬合方程：Y=3.40+0.068A+0.13B+0.11C+0.040AC-0.027BC-0.37A2-0.51B2-0.56C2。利用ANOVA 分析不同實(shí)驗(yàn)條件下水仙環(huán)素的含量結(jié)果，有效性。模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5。模型的F 值為10.99，P為0.002 3，小于0.05，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)是為了比較模型誤差與重復(fù)測(cè)量值誤差之間的不同，用以評(píng)估二次多響應(yīng)面模型的適合性。其P值為0.756 8，表明模型顯著且適當(dāng)。所有數(shù)據(jù)表明響應(yīng)值與二次多項(xiàng)式能夠很好的吻合，所以繼續(xù)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用這個(gè)模型。方差分析顯示，校正決定系數(shù)R2=0.933 9，進(jìn)一步說明了模型的擬合度優(yōu)。因此可用該方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表5 二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析結(jié)果Tab.5 Anova result of quadratic polynomial regression model

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析采用Design Expert 8.0 對(duì)表4 數(shù)據(jù)繪制響應(yīng)面圖，可真實(shí)反映出各因素的交互作用，曲面圖的陡峭程度顯示出各因素對(duì)水仙環(huán)素提取率的影響程度，響應(yīng)面坡度越陡，說明該因素影響較大。

圖6 為液料比為5∶1 mL/g 條件下，提取溫度與時(shí)間的交互作用與水仙環(huán)素提取率間關(guān)系的三維曲面圖與等高圖。由圖6 可以看出，在回流溫度處于80 ℃～90 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著溫度的升高而增加，在回流溫度處于90 ℃～100 ℃范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)回流時(shí)間在3～4 h 之間時(shí)，水仙環(huán)素提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷的上升，隨著回流時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，水仙環(huán)素提取率略有下降。當(dāng)回流時(shí)間一定時(shí)，繼續(xù)增加回流溫度，不一定會(huì)提高提取率，從而繼續(xù)升溫的意義不大。

圖6 溫度和時(shí)間對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖Fig.6 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of temperature and time on extraction rate

圖7 為回流時(shí)間為4 h 條件下，回流溫度與液料比的交互作用與水仙環(huán)素提取率間關(guān)系的三維曲面圖與等高圖，由圖7 可知，在回流溫度處于80 ℃～90 ℃范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著溫度的升高而增加，在回流溫度處于90 ℃～100 ℃范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著溫度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著液料比的增加而提高，在液料比處于5∶1～6∶1 mL/g 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著液料比的增加而趨于平穩(wěn)。

圖7 溫度和液料比對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖Fig.7 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of temperature and liquid-solid ratio on extraction rate

圖8 為回流溫度在90 ℃條件下，提取時(shí)間與液料比的交互作用與水仙環(huán)素提取率間關(guān)系的三維曲面圖和等高線，由圖8 可知，當(dāng)回流時(shí)間在3～4 h 之間時(shí)，水仙環(huán)素提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷的上升，隨著回流時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，水仙環(huán)素提取率略有下降。在液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著液料比的增加而提高，在液料比處于5∶1～6∶1 mL/g 范圍內(nèi)，水仙環(huán)素提取率隨著液料比的增加而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)回流時(shí)間處于3～4 h 之間，液料比處于4∶1～5∶1 mL/g 之間時(shí)，響應(yīng)面達(dá)到最高點(diǎn)。

圖8 時(shí)間和液料比對(duì)提取率交互影響的三維曲面圖Fig.8 Three-dimensional surface diagram of interaction effect of time and liquid-solid ratio on extraction rate

響應(yīng)值通過下述經(jīng)驗(yàn)公式算得：

其中，y為響應(yīng)值；k為變量/因素?cái)?shù)；b0為截距參數(shù)；bi，bij，bii分別為線性回歸參數(shù)、相互作用參數(shù)和二次項(xiàng)因子。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以昆明呈貢產(chǎn)水鬼蕉為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過比較回流提取法、超聲波提取法、冷浸法得出回流提取法的提取率最優(yōu)。并且采用Design-Export8.0 軟件，對(duì)回流提取法提取進(jìn)行工藝優(yōu)化。響應(yīng)面設(shè)計(jì)能夠通過更為直觀的圖形、精密度較高的數(shù)學(xué)模型獲得最佳工藝，與正交試驗(yàn)法相比，數(shù)據(jù)處理能力更高的有點(diǎn)，此外還能反映各個(gè)因素之間交互作用。

本實(shí)驗(yàn)得到響應(yīng)面法優(yōu)化回流提取法提取水仙環(huán)素的最佳工藝為液料比5.09 ∶1 mL/g、提取溫度為90.97 ℃，提取時(shí)間為4.13 h。結(jié)合實(shí)際操作條件，調(diào)整選用回流溫度91 ℃，回流時(shí)間4 h，液料比為5∶1 mL/g，在此條件下重復(fù)3 次試驗(yàn)，水仙環(huán)素提取率分別為3.40×10-4%，3.38×10-4%，3.36×10-4%，平均值為3.38×10-4%，與理論預(yù)測(cè)值基本一致，說明該模型準(zhǔn)確可靠。通過比較，擇優(yōu)選取的提取工藝提取率相比較而言更高，可為進(jìn)一步開發(fā)利用水鬼蕉中的水仙環(huán)素提供科學(xué)合理的理論和試驗(yàn)依據(jù)。