miR-148a-3p 靶向SMURF2 調(diào)節(jié)牙髓干細(xì)胞和口腔上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系成骨分化及牙釉質(zhì)發(fā)育的作用機(jī)制

徐 倩，崔玉梅，馬思明，林云紅，熊依菁，宋子珺，李旭東

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科，云南 昆明 650106）

在牙科相關(guān)疾病中，牙齒的缺損或缺失已經(jīng)成為全國(guó)主要的公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題之一，組織工程體外牙再生技術(shù)有望解決這一問(wèn)題[1]。以膠原蛋白凝膠為載體，成骨細(xì)胞與上皮細(xì)胞相互作用激活特定信號(hào)通路，通過(guò)使牙源性的間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞相互作用可能實(shí)現(xiàn)體外牙齒誘導(dǎo)發(fā)生。發(fā)育過(guò)程中任何信號(hào)的干擾和突變都可能導(dǎo)致牙釉質(zhì)形成的障礙，如釉質(zhì)發(fā)育不全（amelogenesis imperfecta，AI）。牙釉質(zhì)是羥磷灰石晶體按照一定的順序相互排列形成堅(jiān)硬的礦化組織，牙釉質(zhì)保障了患者牙齒咬合功能[2]。除此之外，基層的成釉因子的分泌和晶體礦化能力，也一定程度上影響了牙釉質(zhì)的形成[3]。目前有研究通過(guò)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞與上皮細(xì)胞三維共培養(yǎng)，形成早期牙齒上皮內(nèi)陷樣結(jié)構(gòu)[4]，但是牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞與上皮細(xì)胞相互作用機(jī)制還未闡明。因此尋找牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)發(fā)育的基因靶點(diǎn)、探討牙釉質(zhì)發(fā)育的分子機(jī)制對(duì)提高牙釉質(zhì)發(fā)育狀況密切相關(guān)。有研究表明，微小RNA（miRNA）存在于成骨細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，作為非編碼小分子，不但參與干細(xì)胞分裂、成骨細(xì)胞的分化與破骨細(xì)胞凋亡，而且影響著牙釉質(zhì)生成和恢復(fù)的過(guò)程[5-6]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a-3p 存在于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中[7]，但是對(duì)于成骨分化的作用有爭(zhēng)議[8-9]，在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用也還不清楚。為探究miR-148a-3p 在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)發(fā)育中的作用及可能涉及靶向機(jī)制，觀察過(guò)表達(dá)和抑制miR-148a-3p 對(duì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)發(fā)育的影響，闡明其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

人牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞選擇牙髓干細(xì)胞，從健康受試者的第三磨牙牙髓獲得；人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞從健康受試者的牙齦組織獲得。DMEM/F12 培養(yǎng)液、ASAP、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均采自Gbico 公司；Matrigel 基質(zhì)凝膠購(gòu)自康寧公司；TRIzol 試劑、Lipofectamine 2000 來(lái)自Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒，購(gòu)自Ta Ka Ra 公司；miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p 抑制劑和miR-NC購(gòu)自賽默飛公司；MTT 細(xì)胞增值檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma 公司；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)，購(gòu)自Promega 公 司；RUNX2、E-cadherin、SMURF2、β-actin 抗體、HRP、標(biāo)記的羊抗兔或鼠IgG 二抗來(lái)自Abcam 公司。本研究簽署患者知情同意并經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（KYKQ2020MECO20）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

在DMEM/F12 培養(yǎng)液中，加入20%牛胎血清、100 kU/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素，在37 ℃和5%CO2條件下培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到60%時(shí)，按照脂質(zhì)體TM 2000 的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分成3 組，即miR-148a-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics）、miR-148a-3p 抑制劑（轉(zhuǎn)染miR-148a-3p inhibitor）和NC 組（轉(zhuǎn)染miR-NC），每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.3 三維共培養(yǎng)體系建立

將牙髓干細(xì)胞以1×106cells/mL 的密度接種到Matrigel 基質(zhì)凝膠上，培養(yǎng)24 h，將口腔上皮細(xì)胞以5×105cells/mL 的密度接種到牙髓干細(xì)胞表面，培養(yǎng)1 d 后更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)4 d后，將共培養(yǎng)轉(zhuǎn)為氣液界面培養(yǎng)，即將培養(yǎng)基減量到不覆蓋細(xì)胞層。繼續(xù)氣液界面培養(yǎng)，1 周后采用 Corning Dispase 收獲細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.4 qPCR 法檢測(cè)細(xì)胞中miR-148a-3p 表達(dá)水平

用TRIzol 試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的指令進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用qPCR 裝置進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：95°預(yù)變性15 s，95°10 s，60°20 s，72°30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算各組組織和細(xì)胞中miR-148a-3p 的表達(dá)水平。

1.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

三維共培養(yǎng)細(xì)胞收獲后將各組細(xì)胞接種到96孔板上，分3 組：正常對(duì)照組（Con），miR-148a-3p 抑制劑和NC 組，每個(gè)孔設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基，每隔 24 h、48 h、72 h和96 h 后，更換新鮮培養(yǎng)器，在每個(gè)孔中加入20 μL 的MTT 試劑，在培養(yǎng)器中再培養(yǎng)4 h，然后丟棄MTT 液。加入150 μL DMSO，充分溶解后，檢測(cè)490 nm 波長(zhǎng)的光密度（D）。將D 值（縱坐標(biāo)）和時(shí)間（橫坐標(biāo)）繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將SMURF2 3＇ UTR 中含有預(yù)測(cè)的miR-148a-3p 潛在結(jié)合位點(diǎn)的部分片段構(gòu)建到psiCHECK-2載體中（SMURF2-wt reporter）。此外，構(gòu)建含有miR-148a-3p 結(jié)合位點(diǎn)突變的SMURF2-mut 報(bào)告基因載體。轉(zhuǎn)染前1 d 將牙髓干細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24 孔板中。使用Lipofectamine 2000 將相應(yīng)的報(bào)告基因載體和miR-148a-3p 模擬物共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞。按照制造商的說(shuō)明，使用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染后48 h分別測(cè)量Renilla 和Firefly 的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 WB 法檢測(cè)細(xì)胞中成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)發(fā)育相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的PBS 溶液室溫封閉1 h。加入稀釋比例均為1∶1 000 的RUNX2，E-cadherin及β-actin 一抗，4℃過(guò)夜。次日，洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔或鼠Ig G 二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，于暗室中用ECL 發(fā)光，并采用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參照β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析。各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)條件間采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p 調(diào)控牙髓干細(xì)胞增殖

牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-148a-3p 抑制劑后，三維共培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行MTT 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞MTT 活力檢測(cè)Fig.1 MTT Detection of cell viability與Con 比較，*P＜0.05。

2.2 miR-148a-3p 上調(diào)成骨細(xì)胞分化（RUNX2）和牙釉質(zhì)發(fā)育標(biāo)志物（E-cadherin）蛋白表達(dá)水平

牙髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics，RTPCR 檢測(cè)miR-148a-3p 表達(dá)水平變化。相比NC 組，miR-148a-3p mimics 組的miR-148a-3p表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。

圖2 Western blotting 法檢測(cè)miR-148a-3p 對(duì)RUNX2 和N-cadherin 蛋白表達(dá)水平的影響Fig.2 The effects of miR-148a-3p on the expression levels of RUNX2 and N-cadherin proteins were detected by Western blotting

聯(lián)合口腔上皮細(xì)胞進(jìn)行三維共培養(yǎng)之后，Western blotting 法檢測(cè)成骨細(xì)胞分化（RUNX2）和牙釉質(zhì)發(fā)育標(biāo)志物（E-cadherin）蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果表明，相比NC 組，miR-148a-3p 組的RUNX2表達(dá)水平和N-cadherin 表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

2.3 miR-148a-3p 結(jié)合SMURF2 3＇-UTR

Targetscan 預(yù)測(cè)表明，SMURF2 mRNA 的3＇-UTR 有miR-148a-3p 的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。筆者構(gòu)建了SMURF2 3＇-UTR 的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染牙髓干細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，miR-148a-3p mimics 抑制野生型載體的熒光素酶活性（圖3B，P＜0.05），但是對(duì)突變型載體的熒光素酶活性沒(méi)有影響（P＞ 0.05）。同時(shí)Western blot 結(jié)果顯示（圖3C），miR-148a-3p mimics 下調(diào)SMURF2 的表達(dá)（P＜0.05），說(shuō)明SMURF2 是miR-148a-3p 的潛在的靶基因。

圖3 miR-148a-3p 通過(guò)結(jié)合SMURF2 3＇-UTR 調(diào)節(jié)SMURF2 表達(dá)水平Fig.3 miR-148a-3p regulates SMURF2 expression by binding to SMURF2 3-’ UTR

3 討論

牙釉質(zhì)是羥磷灰石晶體按照一定的順序相互排列形成堅(jiān)硬的礦化組織，釉柱與釉間柱有序組合使釉質(zhì)在具備硬度的同時(shí)兼具一定彈性。目前研究證實(shí)，多種干細(xì)胞包括牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)可以分化出骨細(xì)胞及牙釉質(zhì)，形成牙體[10]。牙髓干細(xì)胞來(lái)源于牙髓組織，具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能，在組織工程中具有巨大的應(yīng)用潛力。研究已證明牙髓干細(xì)胞與上皮細(xì)胞三維共培養(yǎng)，可以形成早期牙齒上皮內(nèi)陷樣結(jié)構(gòu)（早期牙齒發(fā)育的關(guān)鍵特征）[4]。但是牙髓干細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的相互作用機(jī)制尚未闡明。目前大量文獻(xiàn)表明[11-12]，miRNA 作為遺傳信息的載體，通過(guò)參與體內(nèi)蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程。當(dāng)miRNA 調(diào)節(jié)功能失調(diào)將會(huì)引起細(xì)胞功能失調(diào)從而出現(xiàn)癌變。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室通過(guò)多種手段，觀察分析小鼠牙胚組織發(fā)育過(guò)程中miRNAs 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，可見(jiàn)miRNA 與牙胚的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)。因此測(cè)定特定miRNA 表達(dá)變化在干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)發(fā)育中過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，揭示其分子作用機(jī)制，具有較高的學(xué)術(shù)研究和指導(dǎo)價(jià)值。

miR-148a-3p 是一種多功能的調(diào)節(jié)因子，可以抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化[13]，可能參與脂肪細(xì)胞分化[14]。Tian 的研究顯示miR-148a-3p 通過(guò)靶向賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶6b 抑制成骨細(xì)胞分化[8]，但是Sheng[9]研究表明miR-148a-3p 也可以通過(guò)激活Wnt 通路和靶向DKK1 促進(jìn)強(qiáng)直性脊柱炎成纖維細(xì)胞的成骨分化。miR-148a-3p 在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用，以及是否參與牙釉質(zhì)的發(fā)育還不清楚。

筆者利用miR-148a-3p 抑制劑下調(diào)牙髓干細(xì)胞中miR-148a-3p 的水平，然后對(duì)三維共培養(yǎng)得到的混合細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖受到抑制，提示miR-148a-3p 參與了牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)行為和相關(guān)作用。最近研究表明[15]，過(guò)表達(dá)miR-148a-3p 可以促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖，牙髓干細(xì)胞是否存在相同機(jī)制還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

筆者利用miR-148a-3p mimics 上調(diào)牙髓干細(xì)胞中miR-148a-3p 水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三維共培養(yǎng)的細(xì)胞中，RUNX2 和E-cadherin 表達(dá)水平明顯上調(diào)。RUNX2 是骨發(fā)育和骨再生過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與骨骼發(fā)育過(guò)程調(diào)節(jié)[16]；E-cadherin 參與牙胚的發(fā)育，E-cadherin 在成釉前細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在牙齒形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化，尤其是在牙體形成過(guò)程中起重要作用[17-18]。因此推斷，miR-148a-3p 可能調(diào)控牙發(fā)育過(guò)程中的成骨分化和牙釉質(zhì)發(fā)育。

研究進(jìn)一步通過(guò) TargetScan 軟件預(yù)測(cè)SMURF2（SMAD 特異性 E3 泛素蛋白連接酶2）3＇-UTR 存在miR-148a-3p 結(jié)合位點(diǎn)。作為 E3 連接酶，SMURF2 具有調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要功能，從而維持細(xì)胞遷移、增殖和凋亡等生理過(guò)程[19]。Schminke 等[20]研究發(fā)現(xiàn)SMURF2 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中RUNX2 降解，SMURF2 的缺乏增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的分化。Zhao 等[21]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SMURF2抑制表達(dá)腎近端小管上皮（HK-2）細(xì)胞中Ecadherin 的表達(dá)。所以筆者推測(cè)miR-148a-3p 在牙髓干細(xì)胞中可能通過(guò)靶向SMURF2 上調(diào)RUNX2水平，促進(jìn)成骨分化并可能通過(guò)細(xì)胞間相互作用，比如外泌體等靶向上皮細(xì)胞中SMURF2，調(diào)節(jié)Ecadherin 水平。

綜上所述，miR-148a-3p 可能通過(guò)靶向SMURF2 調(diào)節(jié)成骨分化及牙釉質(zhì)發(fā)育，在牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞共同誘導(dǎo)的體外牙齒發(fā)生中發(fā)揮作用，提示miR-148a-3p 可作為牙齒修復(fù)和治療的潛在靶標(biāo)之一。