青蒿素調(diào)控ENO2 介導(dǎo)的腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞有氧糖酵解的機(jī)制

王英寶 ，李曉云 ，譚 瑩 ，楊 萌 ，史云強(qiáng) ，平秦榕 ，胡禮炳 ，楊 洋 ，王春暉

（1）昆明市延安醫(yī)院泌尿外科，云南 昆明 650051;2）青島市第八人民醫(yī)院教育科，山東 青島 266041;3）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，云南 昆明 650032）

腎細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是腎細(xì)胞癌的主要亞型，每年約有9 萬例患者死于ccRCC[2]。大多數(shù)患者在早期被確診，但約30%的患者在初始診斷時(shí)即出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，晚期患者的5 a 生存率僅為32%。近來，診療技術(shù)的發(fā)展在延長(zhǎng)了患者對(duì)的生存期，但腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥仍是ccRCC 患者預(yù)后的主要限制因素。因此，探索新的治療靶點(diǎn)和策略以抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程是ccRCC 治療迫切需要解決的問題。

Warburg 效應(yīng)是指在氧氣充足的條件下，腫瘤細(xì)胞通過有氧糖酵解和減少線粒體氧化磷酸化來促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)攝取和吸收，進(jìn)而快速生長(zhǎng)和增殖。有氧糖酵解是癌癥發(fā)展的核心因素之一，其可滿足癌細(xì)胞的能量需求，用于癌癥生物質(zhì)合成的糖酵解中間體，并營(yíng)造微酸性環(huán)境[3]。因此。確定調(diào)節(jié)有氧糖酵解的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。

青蒿素（Artemisinin）是一種含過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)脂，主要來源于青蒿，是治療惡性瘧疾的一線藥物。隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素除了具有抗瘧疾作用外，還具有抗腫瘤、抗炎等生物學(xué)作用[4]。然而，目前關(guān)于青蒿素對(duì)ccRCC 糖酵解的作用機(jī)制尚不清楚。烯醇化酶2（Enolase 2，ENO2）是烯醇化酶家族的重要成員，其催化磷酸烯醇式丙酮酸的合成以介導(dǎo)糖酵解和糖異生[5]。Chen等[6]報(bào)道，ENO2 在ccRCC 中表達(dá)升高。目前，關(guān)于ENO2 在ccRCC 中的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究將探討青蒿素調(diào)控ENO2 對(duì)ccRCC 糖酵解的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞HK2 和ccRCC細(xì)胞系OSRC2 和ACHN 購(gòu)自武漢普諾賽。si-NC和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 由上海Genepharma 合成。CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海碧云天。葡萄糖測(cè)試盒和乳酸測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Takara。一抗、二抗和ECL 化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自北京博奧森。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HK2 和ACHN 細(xì)胞分別在MEM 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含NEAA，10%胎牛血清和1%雙抗。OSRC2 細(xì)胞在DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%雙抗，細(xì)胞培養(yǎng)基置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37 ℃，含5% CO2。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)試劑盒說明書，利用Lipofectamine 3000分別將si-NC 和si-ENO2#1、si-ENO2#2、si-ENO2#3 轉(zhuǎn)染至OSRC2 和ACHN 細(xì)胞系中。在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

1.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率

CCK-8 試劑盒用于評(píng)估細(xì)胞存活率。OSRC2和ACHN 細(xì)胞分別接種至96 孔板中，密度為6×103/孔，并將細(xì)胞暴露在0、10、20、30、40 μmol/L青蒿素環(huán)境中或轉(zhuǎn)染si-NC 和si-ENO2。細(xì)胞置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)加入20 μL CCK-8溶液與細(xì)胞共同孵育2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的光密度值。

1.5 試劑盒檢測(cè)葡萄糖消耗和乳酸生成

葡萄糖測(cè)試盒和乳酸測(cè)試盒用于測(cè)定細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成量。將各組細(xì)胞接種至96孔板中37 ℃孵育過夜。收集細(xì)胞，充分裂解后分別用于葡萄糖消耗和乳酸生成檢測(cè)。

1.6 總RNA 提取和RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)

使用TRIzol 試劑提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH 作為內(nèi)參，cDNA 為模板，使用SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 50 s 進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法用于計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Western blot

細(xì)胞用RIPA 試劑裂解，10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。在室溫中用5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后與稀釋后的一抗（HK2：1∶500，LDHA：1∶500，GAPDH：1∶5 000，ENO2：1∶1 000）4 ℃過夜孵育。次日，漂洗PVDF 膜并與稀釋后的二抗在室溫中孵育2 h。TBST 漂洗，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液至膜上，凝膠成像儀顯影。上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GraphPad Prism 8.0 軟件用于分析數(shù)據(jù)和圖片繪制，數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ± SD）。2 組間數(shù)據(jù)比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用Tukey’s 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素抑制ccRCC 細(xì)胞存活和糖酵解

CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞存活率，見圖1A 和圖1B。隨著青蒿素濃度的增加，細(xì)胞存活率降低，OSRC2 細(xì)胞的IC50為25.47 μmol/L，ACHN 細(xì) 胞的IC50為26.31 μmol/L，后續(xù)選擇25 μmol/L 青蒿素處理細(xì)胞。隨后，探索25 μmol/L 青蒿素處理細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)OSRC2 和ACHN 細(xì)胞存活率的影響，見圖1C 和圖1D。青蒿素處理時(shí)間增加細(xì)胞存活率降低，且呈時(shí)間依賴性。試劑盒分別檢測(cè)癌細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成水平，見圖1E、圖1F，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25 μmol/L 青蒿素處理后細(xì)胞的葡萄糖消耗（P＜0.01）和乳酸生成量（均P＜0.05）低于NC 組。Western blot 結(jié)果表明，青蒿素處理組中HK2 和LDHA 表達(dá)低于NC 組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1G-I。綜上表明，青蒿素可抑制OSRC2 和ACHN 細(xì)胞存活率和糖酵解。

圖1 青蒿素抑制ccRCC 細(xì)胞存活率和糖酵解Fig.1 Artemisinin repressed the survival rate and glycolysis of ccRCC cells

2.2 青蒿素下調(diào)ENO2 在癌細(xì)胞中的表達(dá)

ENO2 被報(bào)道通過激活和增強(qiáng)糖酵解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7]。然而，目前關(guān)于ENO2 對(duì)ccRCC細(xì)胞糖酵解的作用尚不清楚。RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)表明，OSRC2 和ACHN 細(xì)胞中ENO2 mRNA（圖2A）和蛋白（圖2B 和圖2C）水平高于HK2細(xì)胞（P＜0.01）。經(jīng)青蒿素處理的OSRC2 和ACHN細(xì)胞中，ENO2 mRNA（圖2D，P＜0.05）和蛋白（圖2E 和圖2F，P＜0.001）水平明顯低于NC 組。綜上表明，青蒿素下調(diào)ENO2 在OSRC2 和ACHN細(xì)胞中的表達(dá)。

圖2 青蒿素下調(diào)ENO2 在癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Artemisinin inhibited the expression of ENO2 in ccRCC cells

2.3 青蒿素通過下調(diào)ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 的存活率和糖酵解

隨后，探討青蒿素通過調(diào)控ENO2 的表達(dá)對(duì)ccRCC 細(xì)胞活力和糖酵解的作用。將si-NC 和si-ENO2 分別轉(zhuǎn)染至OSRC2 和ACHN 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染si-ENO2#2 和si-ENO2#3 可降低ENO2 在癌細(xì)胞中的表達(dá)（P＜0.001），見圖3A～3B。轉(zhuǎn)染si-ENO2同時(shí)經(jīng)青蒿素處理組中ENO2 的表達(dá)低于僅轉(zhuǎn)染si-ENO2 組（P＜0.05），見圖3C～3D。CCK-8 和試劑盒檢測(cè)表明，敲降ENO2 可降低OSRC2 和ACHN 細(xì)胞存活率（圖3E，P＜0.01）以及葡萄糖消耗量（圖4A，P＜0.05）和乳酸產(chǎn)生（圖4B，P＜0.05）。同時(shí)經(jīng)青蒿素處理且敲降ENO2 組中細(xì)胞的存活率低于僅敲降ENO2 組（P＜0.001），葡萄糖消耗（P＜0.05）和乳酸生成（均P＜0.05）較敲降ENO2 組減少。Western blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲降ENO2明顯降低HK2 和LDHA 在OSRC2 和ACHN 細(xì) 胞中的表達(dá)（P＜0.05），見圖4C～4E，經(jīng)青蒿素處理進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞中HK2 和LDHA 的表達(dá)（均P＜0.05）。綜上表明，青蒿素通過下調(diào)ENO2 在OSRC2 和ACHN 細(xì)胞中的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的活力和糖酵解。

圖3 青蒿素通過下調(diào)ENO2 抑制癌細(xì)胞活力Fig.3 Artemisinin repressed cancer cell viability by downregulating ENO2 expression

圖4 青蒿素通過下調(diào)ENO2 抑制癌細(xì)胞糖酵解Fig.4 Artemisinin repressed cancer cell glycolysis by downregulating ENO2 expression

3 討論

ccRCC 具有較高的發(fā)病率和死亡率，是最致命的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。然而，即使患者即使接受了手術(shù)切除和放療，仍有30%的患者發(fā)展為轉(zhuǎn)移期[8]。了解ccRCC 的病理機(jī)制和探索新的治療策略十分重要。本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可通過調(diào)控ENO2 抑制OSRC2 和ACHN 細(xì)胞的存活率并抑制癌細(xì)胞的糖酵解過程，表明青蒿素具有良好的抗癌功能。

青蒿素的抗腫瘤作用是近來研究的熱點(diǎn)，不僅可以單獨(dú)作用于腫瘤細(xì)胞，還可與其他藥物聯(lián)合使用。在食管癌細(xì)胞中，青蒿素通過靶向抑制HIF-1α 抑制癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和糖酵解，抑制食管癌的發(fā)展[9]。青蒿素通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路的激活，進(jìn)而誘導(dǎo)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞線粒體膜電位喪失，抑制癌細(xì)胞的遷移和侵襲[10]。青蒿素衍生物雙氫青蒿素激活抗存活未折疊蛋白反應(yīng)并上調(diào)CHAC1 的表達(dá)，誘導(dǎo)原代肝細(xì)胞的鐵死亡[11]。雙氫青蒿素可提高ROS 水平和損害血紅素代謝，降低EGFR 突變型非小細(xì)胞肺癌對(duì)奧希替尼的耐藥性[12]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素可降低ccRCC 細(xì)胞系的存活率并抑制細(xì)胞的糖酵解，抑制ccRCC 的進(jìn)程。此外，Yu 等[13]報(bào)道青蒿素和AKT 抑制劑的聯(lián)合使用可增強(qiáng)對(duì)ccRCC 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。

糖酵解是腫瘤細(xì)胞發(fā)育過程中常見的代謝途徑，增殖細(xì)胞中的糖酵解活性增加，抑制糖酵解可抑制癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程。敲降circME1 通過下調(diào)ME1 的表達(dá)，抑制ccRCC 的有氧糖酵解[14]。PGK1 通過激活CXCR4/ERK 信號(hào)通路并加速糖酵解，促進(jìn)ccRCC 的腫瘤發(fā)生和索拉非尼耐藥性[15]。PFKFB3 敲降抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的糖酵解、增殖率和細(xì)胞周期G1/S 期轉(zhuǎn)化[16]。Trim21 通過泛素化介導(dǎo)的HIF-1α 降解抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的糖酵解，并抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的增殖、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素或敲降ENO2 可抑制OSRC2 和ACHN 細(xì)胞的活力及糖酵解過程。

ENO2 是糖酵解中的一種限速酶，促進(jìn)2-磷酸甘油酸酯轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇丙酮酸。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，ENO2 也是包括頭頸鱗狀細(xì)胞癌[18]、肺癌[19]、乳腺癌[20]等腫瘤的成熟生物標(biāo)志物，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。例如：ENO2 過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]；敲降ENO2 可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解[21]；上調(diào)ENO2 的表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的放療抵抗[22]；ENO2 可促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖、糖酵解和糖皮質(zhì)激素抵抗[23]。Pan 等[24]報(bào)道，ENO2 高水平的患者在腫瘤微環(huán)境中可能有較高的M2 巨噬細(xì)胞和較低的 γβT細(xì)胞，可能與ccRCC 患者預(yù)后較差有關(guān)。ENO2 可促進(jìn)ccRCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[6]。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，ENO2 在ccRCC 細(xì)胞系OSRC2 和ACHN 細(xì)胞中表達(dá)升高，青蒿素可下調(diào)ENO2 在癌細(xì)胞中的表達(dá)，敲降ENO2 降低OSRC2 和ACHN 細(xì)胞活力和糖酵解。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素通過下調(diào)ENO2在OSRC2 和ACHN 細(xì)胞中的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的存活率并抑制糖酵解過程，進(jìn)而抑制ccRCC 的發(fā)展。