大接骨丹樹皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

伍小艷,石偉,韓忠耀

(1.桂林市衛(wèi)生學(xué)校,廣西 桂林 541006;2.廣西師范大學(xué),廣西 桂林 541006;3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,廣西 都勻 558000)

民族藥大接骨丹樹皮來源于山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的干燥樹皮,其根皮收載于貴州省地方藥、民族藥標(biāo)準(zhǔn)《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大接骨丹樹皮具有抗炎鎮(zhèn)痛活性[2]。目前,大接骨丹樹皮未被歷版《中國藥典》和地方標(biāo)準(zhǔn)收載,根據(jù)貴陽中醫(yī)學(xué)院編著《中華本草》(苗藥卷)記載和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,民族藥大接骨丹樹皮具有藥用開發(fā)價(jià)值,具有替代用藥部位根皮的潛在價(jià)值[3-4]。

據(jù)相關(guān)研究報(bào)道,大接骨丹主要含有4-羥基-3,5-二甲氧基苯甲醛[5]、Griselinoside[6]、紫丁香苷[6]、Coniferin[6]、Quercetin-3-O-glucoside[6]、Astragalin[6]、Phytol[6]、黑麥草內(nèi)酯[7]、蘋果酸甲酯[7]、griselinoside[7]等化學(xué)成分。當(dāng)前,有齒鞘柄木相關(guān)研究主要集中指紋圖譜[8-13]、工藝優(yōu)化[14]、近紅外快速分析[15-17]、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升[18-19]、生物活性[20]、含量測定[21-22]、液質(zhì)聯(lián)用成分分析研究[23-24]、譜效關(guān)系探究[25]、生藥學(xué)研究[26]等,而關(guān)于大接骨丹樹皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)擬以黔產(chǎn)大接骨丹樹皮藥材為研究對(duì)象,按照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)6批次大接骨丹樹皮藥材進(jìn)行薄層色譜定性鑒別,水分、總灰分、浸出物的含有量檢測,同時(shí),建立HPLC法測定大接骨丹樹皮藥材紫丁香苷的含量,為民族藥大接骨丹樹皮藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定與質(zhì)量控制提供參考與試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型HPLC分析儀(DAD檢測器,美國安捷倫科技有限公司);FA2125型電子天平(十萬分之一,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);SX-4-10型箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司);101-3AB型烘箱(天津市泰斯特公司);三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);DY-D2電熱恒溫水浴鍋(上海勝啟儀器儀表有限公司);JP-020超聲儀(深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司);蒸發(fā)皿;坩堝等。

1.2 試藥

紫丁香苷對(duì)照品(購自成都克洛瑪生物科技有限公司,批號(hào)為:160120);硅膠GF254薄層板(上海艾研生物科技有限公司);甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司,分析純);乙腈(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純);水為自制蒸餾水,其他試劑均為分析純。

6批大接骨丹樹皮藥材均為自采(見表1),所有自采藥材均黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥物化學(xué)與藥物分析教研室韓忠耀教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木ToricelliaAngulataOliv.var.intermedia(Harms) Hu的樹皮。

表1 大接骨丹樹皮藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[18-19],取大接骨丹樹皮藥材粉末2 g,置圓底燒瓶中,加甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,濾紙過濾,濾液置坩堝中,水浴蒸干(水浴溫度≤70 ℃),放冷至室溫,殘?jiān)靡埔簶尲尤爰状? mL,溶解,制備成供試品溶液,即得;參考文獻(xiàn)[18]方法,取適量紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品,加甲醇制成每1 mL含該成分約為1 mg的溶液,即得紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液。參照2020版《中國藥典》(四部)0502薄層色譜測定法[27]并參考文獻(xiàn)[19]方法,吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上,按照參考文獻(xiàn)[18]薄層層析展開劑條件為本試驗(yàn)展開劑,展開、晾干,紫外光燈254 nm下檢視,在供試品、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn),見圖1。噴以10%硫酸乙醇溶液,用吹風(fēng)機(jī)加熱數(shù)分鐘至斑點(diǎn)顯色清晰,在供試品、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同灰藍(lán)色斑點(diǎn),見圖2。

圖1 大接骨丹樹皮藥材TLC熒光(254 nm)結(jié)果

圖2 大接骨丹樹皮藥材TLC(10%硫酸乙醇)結(jié)果

2.2 檢查項(xiàng)及浸出物

2.2.1 水分測定

參照2020版《中國藥典》(四部)通則0832水分測定法第二法(烘干法)[27]并參考文獻(xiàn)[18-19]相關(guān)方法,進(jìn)行水分檢查,各批次平行2份,結(jié)果見表2。根據(jù)檢測結(jié)果,初步擬定大接骨丹樹皮藥材水分含有量不得超過12.0%。

表2 6批大接骨丹樹皮藥材水分含量、浸出物含量及灰分含量測定結(jié)果

2.2.2 總灰分測定

參照2020版《中國藥典》(四部)通則2302總灰分測定法[27]并參考文獻(xiàn)[18-19]相關(guān)方法,進(jìn)行總灰分檢查,各批次平行2份,結(jié)果見表2。根據(jù)檢測結(jié)果,均值為6.03%,以總灰分不超過平均值的120%為限度計(jì)算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材總灰分含有量不得超過7.23%。

2.2.3 浸出物測定

參照2020版《中國藥典》(四部)2201浸出物測定法(熱浸法)[27]并參考文獻(xiàn)[18-19]相關(guān)方法,進(jìn)行浸出物測定,溶劑為70%乙醇,各批次平行2份,結(jié)果見表2。根據(jù)檢測結(jié)果,均值為21.10%,以浸出物不少于平均值的70%為最低限度要求計(jì)算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材浸出物含有量不得少于14.77%。

2.3 紫丁香苷含量測定

2.3.1 色譜條件

參照《中華人民共和國藥典》(2020年版,四部,0512高效液相色譜法測定)[27]及文獻(xiàn)按照文獻(xiàn)[19,21]相關(guān)方法,紫丁香苷HPLC檢測條件:Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),檢測波長210 nm,進(jìn)樣量5 μL,柱溫35 ℃,體積流量為1.0 mL·min-1,流動(dòng)相為0.5%-磷酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫條件,見表3。

表3 接骨丹樹皮藥材HPLC梯度洗脫程序

在此條件下,紫丁香苷理論塔板數(shù)大于4 000,與相鄰成分色譜峰的分離度大于1.5,色譜圖見圖3。

圖3 對(duì)照品(A)與供試品(B)的 HPLC圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],取紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量,精密稱定,置于25 mL白量瓶中,加入甲醇,搖勻,即得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(每1 mL含1.235 3 mg的紫丁香苷)。

2.3.3 供試品溶液的制備

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],精密稱取藥材粉末(過50目篩孔孔徑0.282 mm藥典篩)約0.5 g,精密稱定,記錄稱樣量,置于具塞錐形瓶中,加入甲醇50 mL,水浴回流提取60 min,過濾于50 mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],精密量取“2.3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分別置于5 mL量瓶中,用分析純甲醇稀釋至刻度,搖勻,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件和表3流動(dòng)相梯度洗脫方法,以紫丁香苷峰面積為縱坐標(biāo)(Y),溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸方程,得到紫丁香苷線性回歸方程為Y=2 927.4X-17.227(r=0.999 9),線性范圍為0.123 5～1.235 3 mg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],精密吸取“2.3.4”項(xiàng)同一質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液(3號(hào)線性紫丁香苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液),按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件和表3流動(dòng)相梯度洗脫方法,連續(xù)進(jìn)樣6次,測得紫丁香苷色譜峰面積RSD為1.88%(n=6),結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],取S1供試品藥材粉末共6份,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0,2,6,10,12,24 h,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件和表3流動(dòng)相梯度洗脫方法進(jìn)樣,測得紫丁香苷含量RSD為2.15%,說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],取S1供試品藥材粉末共6份,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件和表3流動(dòng)相梯度洗脫方法,連續(xù)進(jìn)樣6次,測得紫丁香苷含量RSD為1.96%,表明該方法重復(fù)性符合要求。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],取紫丁香苷對(duì)照品適量,精密稱定,置50 mL量瓶中,搖勻,即得每1 mL含1.023 3 mg。取S1供試品藥材粉末共6份,每份約0.1 g,精密稱定,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,濾液分別精密加入5.0 mL紫丁香苷對(duì)照品溶液,用甲醇稀釋至刻度,用0.45 μm微孔濾膜過濾,續(xù)濾液分別置于液相小瓶中,測得其平均加樣回收率為102.33%,RSD為2.52%。表明該方法回收率較好。

2.3.9 含量測定

按照文獻(xiàn)相關(guān)方法[19,21],精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件和表3流動(dòng)相梯度洗脫方法進(jìn)樣分析,含量測定結(jié)果見表4。根據(jù)檢測結(jié)果,以紫丁香苷含量不低于平均值的70%為最低限度要求計(jì)算,初步擬定大接骨丹樹皮藥材紫丁香苷含量不得低于19.39 mg·g-1。

表4 大接骨丹樹皮藥材含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 薄層色譜條件系統(tǒng)考察

薄層色譜鑒別研究過程中,篩選了提取方法、不同提取溶劑對(duì)大接骨丹樹皮藥材提取效果的影響,結(jié)合薄層層析效果,選定本試驗(yàn)研究對(duì)象TLC定性分析的提取溶劑與提取方法。同時(shí),重點(diǎn)考察了不同展開溶劑對(duì)大接骨丹樹皮藥材定性鑒別的效果,研究發(fā)現(xiàn)以本課題組前期研究基礎(chǔ)的三氯甲烷-甲醇-水(體積比15∶4∶0.2)為展開劑[18],TLC定性鑒別效果較佳。

3.2 含量測定檢測波長的選擇

采用Agilent 1260型高效液相色譜儀DAD檢測器,多波長篩選紫丁香苷檢測波長,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)檢測波長為210 nm時(shí),大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷分離度高、峰型較好,因此,確定大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷含量測定的檢測波長為210 nm。

3.3 檢查項(xiàng)及浸出物

參考文獻(xiàn)[18-19],并依據(jù)該藥材所含成分的理化性質(zhì),最終確定水分測定法采用烘干法,浸出物測定采用熱浸法且以70%乙醇為溶劑,灰分檢測總灰分。

本試驗(yàn)對(duì)大接骨丹樹皮藥材薄層色譜定性鑒別、水分含有量、總灰分含有量、浸出物含有量、紫丁香苷含量測定方法,進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,結(jié)果顯示:大接骨丹樹皮藥材中紫丁香苷在0.123 5～1.235 3 mg/mL范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r值為0.999 9,紫丁香苷平均加樣回收率為102.33%,RSD為2.52%;6批大接骨丹樹皮藥材水分、總灰分、浸出物含有量分別為8.28%～10.53%,4.84%～7.16%,15.63%～22.45%。試驗(yàn)可為大接骨丹樹皮藥材的臨床用藥、藥材的質(zhì)量控制以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定,提供數(shù)據(jù)參考。