西洋參總皂苷通過Nrf2-ARE通路對(duì)壓力性尿失禁的治療作用

楊丹丹, 唐紅英, 張 蝶, 魏國斌, 張靖雪, 李南希

(四川省廣安市人民醫(yī)院婦科, 四川 廣安 638000)

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)是指在咳嗽、噴嚏等腹壓增加時(shí),尿液不自主的從尿道口流出的現(xiàn)象[1]。調(diào)查顯示[2-3],我國SUI成年女性患病率約為20%,嚴(yán)重影響女性的身心健康和生活質(zhì)量。近年來研究發(fā)現(xiàn),盆底組織氧化應(yīng)激可能是SUI防治研究的有效靶點(diǎn)[4]。核因子E2相關(guān)因子(Nuclear-factor-E2-related factor,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)信號(hào)是機(jī)體內(nèi)可防御氧化應(yīng)激損傷的通路之一,其可介導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展,包括腫瘤、炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等[5]。目前已有研究證實(shí),Nrf2/ARE信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織抗損傷能力,并對(duì)損傷修復(fù)和組織重建等過程發(fā)揮促進(jìn)作用[6]。因此猜測Nrf2/ARE信號(hào)通路可能對(duì)SUI盆底組織損傷發(fā)揮保護(hù)作用。西洋參又稱為花旗參,其性寒,以養(yǎng)陰生津作用為主[7]。西洋參總皂苷(PQS)是西洋參主要有效活性成分之一,現(xiàn)代藥理研究表明,其具有提高機(jī)體免疫力、抗心肌缺血、抗腫瘤、降血糖和血脂、改善認(rèn)知等多種藥理學(xué)作用[8]。近年來有研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rb1對(duì)壓力性尿失禁尿道組織損傷可發(fā)揮促進(jìn)作用,但目前關(guān)于西洋參總皂苷對(duì)SUI的作用報(bào)道較少[9]。因此本研究旨探究西洋參總皂苷通過Nrf2/ARE通路對(duì)壓力性尿失禁的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只雌性未育SD大鼠均購自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(粵)2021-0059。大鼠體質(zhì)量為200g～220g,將大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)在動(dòng)物房內(nèi),溫度為23～25℃,空氣相對(duì)濕度為50%,光照12h/12h晝夜交替,自由飲水?dāng)z食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2試劑和儀器:西洋參總皂苷(純度≥98%,陜西昂煦生物科技有限公司);Nrf2特異性抑制劑ML385(美國MedChem Express公司);Nrf2抗體、醌氧化還原酶1(HO-1)抗體、血紅素加氧酶1(NOQ1)抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司);烏拉坦(上海山浦化工頭有限公司);蘇木素-伊紅染色液(美國Sigma公司);中性樹膠(武漢塞維爾生物科技有限公司);qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);6-Fr弗萊氏尿管(大連庫利艾特醫(yī)療制品有限公司);尿動(dòng)力學(xué)檢測儀(Nidoc 970A,成都維信電子科大新技術(shù)有限公司)。

1.3分組及模型制備:將60只大鼠隨機(jī)分為Control組、SUI組、PQSL組、PQSM組、PQSH組和PQSH+ML385組,每組10只。Control組大鼠不做任何處理,其余各組根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]制備SUI大鼠模型,膀胱內(nèi)插入導(dǎo)管排空尿液,后在腹部的正中位切開1cm的小口,剝離雙側(cè)卵巢組織后縫合,將導(dǎo)管置于陰道處,將3mL的無菌生理鹽水用氣囊注入陰道,讓陰道充分的擴(kuò)張,4h后將尿?qū)Ч艹返?當(dāng)陰道氣囊擴(kuò)張2周后完全摘除卵巢組織后縫合。通過噴嚏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型制備是否成功。造模成功后,PQSL組、PQSM組、PQSH組大鼠分別灌胃50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的西洋參總皂苷;PQSH+ML385組大鼠灌胃200mg/kg的西洋參總皂苷,同時(shí)經(jīng)尿道壁注射10μL的Nrf2特異性抑制劑ML385;Control組和SUI組大鼠灌胃等量的生理鹽水。每組大鼠每天灌胃1次,共計(jì)灌胃6周。

1.4噴嚏實(shí)驗(yàn):藥物干預(yù)結(jié)束后,仰臥位固定大鼠,將尿道口將硬膜外導(dǎo)管一端插入到膀胱,另一端和微量泵鏈接,將生理鹽水注入到膀胱中,注射速度10mL/h,當(dāng)尿道口有液體溢出時(shí)停止注入,計(jì)算注入量。再次將大鼠的膀胱排空,將前次1/2的生理鹽水注入到膀胱中,用鼠須刺激大鼠的鼻孔,當(dāng)大鼠噴嚏發(fā)生時(shí)尿道口有液體流出時(shí)則視為噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性,如尿道口沒有液體流出則視為陰性,最后統(tǒng)計(jì)30min內(nèi)各組大鼠噴嚏陽性率=噴嚏陽性數(shù)量/噴嚏總數(shù)量×100%。

1.5尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測:排空大鼠膀胱液體,生理鹽水以每分鐘100μL的速度注入到膀胱中,當(dāng)觀察大鼠尿道口出現(xiàn)的第一滴尿液時(shí),統(tǒng)計(jì)大鼠的膀胱最大容積(maximum bladder capacity,MBC)和漏尿點(diǎn)壓力(leak point pressure,LPP)。再次排空大鼠膀胱,上述同樣的方法注入生理鹽水,后用手指緩慢的按壓大鼠的腹部,直至尿道口有液體排除時(shí)停止腹部按壓,記錄腹壓漏尿點(diǎn)壓(abdominal leakage pressure point,ALPP)。

1.6膀胱內(nèi)壓測定:消毒三通管,在大鼠左側(cè)靜脈內(nèi)置入三通管中的一根作為給藥途徑,縫合并固定。取另外一根導(dǎo)管和壓力檢測器相連接,測定各組大鼠膀胱內(nèi)壓力。最后一根導(dǎo)管持續(xù)注入生理鹽水誘導(dǎo)大鼠膀胱收縮排尿,收集各組大鼠的尿液,計(jì)算大鼠的排尿量、殘余尿量及排尿效率。

1.7Masson染色:取上述組織切片固定Bouin's溶液中,56℃烤箱烘烤1h,后取出切片,將組織切片上殘留的Bouin's溶液用流水沖洗干凈,蘇木素染色10min,后蒸餾水沖洗切片;用Biebrich Scarlet酸性品紅液中染色10min,后蒸餾水再次沖洗。將組織切片置于鉬鎢酸溶液分色10～15min,當(dāng)觀察到膠原的紅色褪去后終止染色。后于苯胺藍(lán)染液染色5min,于1%醋酸中分色3min,乙醇脫水后封片。

1.8尿道組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測:取尿道組織充分研磨,制成10%組織均漿液。常溫3000r/min離心10min,收集上清液,用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和可見光分光光度計(jì)測定各組大鼠尿道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo),MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.9蛋白質(zhì)印跡檢測腦組織中Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白表達(dá):收集尿道組織,提取組織中總蛋白,用DAB法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液終濃度配制為2μg/mL,將蛋白溶液置于熱水中煮沸10min,后保存在-20℃冰箱中。將30μg的蛋白樣品用200V電壓電泳,轉(zhuǎn)移蛋白樣品與PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h,將一抗Nrf2、HO-1、NOQ1(1∶1000)加入到PVDF膜上,孵育一抗在在4℃環(huán)境中過夜;流水沖洗PVDF膜,將二抗(1∶1000)加入到PVDF膜上,室溫孵育2h。ECL放光液加入到細(xì)胞中,曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1噴嚏實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較:Control組大鼠噴嚏實(shí)驗(yàn)均為陰性。造模50只大鼠均出現(xiàn)了噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性,本研究壓力性模型大鼠制備成功。藥物干預(yù)6周后,PQSL組、PQSM組、PQSH組噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性率分別為60%(6/10)、40%(4/10)、20%(2/10),PQSH+ML385組大鼠噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性率為70%(7/10),SUI組大鼠噴嚏實(shí)驗(yàn)陽性率為80%(8/10)。

2.2各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較:和Control組相比,SUI組大鼠MBC(1.36±0.12)、LPP(9.86±0.95)、ALPP(10.23±1.08)水平明顯降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組(2.18±0.20)(15.31±0.15)(17.62±1.56)、PQSM組(4.11±0.35)(21.36±1.89)(25.33±2.16)、PQSH組(6.11±0.54)(34.26±3.17)(33.74±3.29)大鼠MBC、LPP、ALPP水平均明顯增加,且呈濃度依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠MBC(1.42±0.14)、LPP(10.01±1.02)、ALPP(11.23±1.12)水平明顯降低(P<0.05),見圖1。

圖1 各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

2.3各組大鼠膀胱內(nèi)壓相關(guān)指標(biāo)比較:和Control組相比,SUI組大鼠排尿量(128.69±10.51)和殘余尿量(4.12±1.06)增多,排尿效率(28.61±2.35)降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(67.38±6.12)(1.13±0.28)(82.34±5.61)大鼠排尿量和殘余尿量均減少,排尿效率增加,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠排尿量(105.16±10.23)和殘余尿量(4.05±1.02)增多,排尿效率(29.47±2.41)降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠膀胱內(nèi)壓相關(guān)指標(biāo)比較

2.4各組大鼠尿道組織膠原纖維病理學(xué)變化比較:Control組大鼠尿道與陰道壁之間包裹著連續(xù)而密集的膠原纖維;和Control組相比,SUI組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維明顯減少,膠原纖維有明顯的溶解和疏松;和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維量明顯增加,纖維排列逐漸整齊且緊密,呈劑量依賴;和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維量減少,且大量膠原纖維溶解(圖3)。

2.5各組大鼠氧化應(yīng)激水平比較:SUI組大鼠尿道組織中MDA含量(5.97±1.23)高于Control組,GSH-Px含量(21.07±1.82)和SOD活性(41.08±2.25)低于Control組(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(2.18±0.65)(31.68±2.02)(74.21±3.26)大鼠尿道組織中MDA含量增加,GSH-Px含量和SOD活性明顯增加,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組尿道組織中MDA含量(5.91±1.20)增加,GSH-Px含量(37.28±2.16)和SOD活性(42.14±2.30)明顯降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.6各組大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)比較:和Control組相比,SUI組大鼠尿道組織中Nrf2(0.23±0.03)、HO-1(0.40±0.04)、NQO1(0.31±0.04)蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(0.81±0.09)(0.90±0.09)(0.76±0.08)大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)均明顯升高,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠尿道組織中Nrf2(0.28±0.03)、HO-1(0.31±0.03)、NQO1(0.33±0.04)蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,壓力性尿失禁是尿道對(duì)尿液失去調(diào)控作用的功能性障礙疾病[11]。SUI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),SUI主要由妊娠、陰道分娩等因素導(dǎo)致的盆底組織松弛、陰道結(jié)締組織支撐減少及尿道內(nèi)括約肌功能障礙密切相關(guān)[12]。SUI在臨床上主要的病理表現(xiàn)為尿頻尿急、急迫性尿失禁等不自主漏尿現(xiàn)象[13]。美國泌尿?qū)W會(huì)研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)治療雖然對(duì)多數(shù)SUI患者長期有效,但極易術(shù)后創(chuàng)傷、尿急、尿困難等并發(fā)癥,因此非手術(shù)療法是輕、中度SUI患者治療的首選[14]。但目前臨床上α1腎上腺素受體激動(dòng)劑米多君等藥物治療SUI,其不僅費(fèi)用高昂且不良反應(yīng)較多,使其治療在臨床受到一定限制[15]。幾千年來,中藥在預(yù)防和治療疾病中發(fā)揮了中藥作用。中醫(yī)將SUI歸為歸屬為“小便不禁”、“遺尿”等范圍,多為腎氣虛弱,膀胱不固等因素所致,治療時(shí)應(yīng)當(dāng)補(bǔ)腎固攝。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為盆腔器官脫落為“陰挺”,主要發(fā)病機(jī)制為氣虛下陷,治療時(shí)應(yīng)當(dāng)提升益氣,補(bǔ)中固脫。產(chǎn)婦生產(chǎn)后一般氣血虧虛,腎氣不固,膀胱失約,進(jìn)而導(dǎo)致遺尿的發(fā)生,治療遺尿應(yīng)在于培補(bǔ)腎氣、固攝膀胱。西洋參是人參屬多年生草本植物,含人參皂苷、多糖、酚類、類黃酮、維生素等,中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn),西洋參具有補(bǔ)腎益精的作用。西洋參總皂苷對(duì)SUI大鼠的具體作用機(jī)制尚不明確,因此本研究通過制備壓力性尿失禁大鼠模型探究西洋參總皂苷對(duì)大鼠的作用機(jī)制。

尿道括約肌是泌尿系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)與功能單位,異常的尿道括約肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能和壓力性尿失禁的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示,當(dāng)尿道括約肌細(xì)胞凋亡大量凋亡、且肌小節(jié)結(jié)構(gòu)與功能異常時(shí),會(huì)通過減少具有收縮功能的肌細(xì)胞及減弱單位肌纖維收縮能力而降低尿道括約肌功能及控尿能力。本研究結(jié)果顯示,SUI組大鼠MBC、LPP、ALPP水平和排尿效率降低,排尿量和殘余尿量增多,且膠原纖維減少;西洋參總皂苷干預(yù)后發(fā)現(xiàn)大鼠MBC、LPP、ALPP水平和排尿效率增加,排尿量和殘余尿量減少,膠原纖維增加,提示西洋參總皂苷可改善SUI大鼠膀胱排尿功能,減輕尿道組織損傷。張凱敏等研究證實(shí),西洋參總皂苷可抑制SUI大鼠尿道損傷并對(duì)排尿功能可發(fā)揮改善作用。

衰老和機(jī)械應(yīng)激均可引起成纖維細(xì)胞活性氧大量生成而導(dǎo)致氧化應(yīng)激,也是引起功能障礙性疾病的重要致病因素,包括壓力性尿失禁。有研究發(fā)現(xiàn),和正常小鼠相比,SUI小鼠陰道前臂組織氧化損傷產(chǎn)物水平明顯升高。機(jī)械刺激也可引起細(xì)胞ROS生成增加,ROS的過量積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致組織和細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。提示,SUI患者陰道組織存在氧化應(yīng)激,由此猜測氧化應(yīng)激可能與SUI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,SUI組大鼠尿道組織中MDA含量增加,GSH-Px含量和SOD活性降低,提示SUI大鼠存在氧化應(yīng)激損傷,和上述研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn),Nrf2/ARE通路可通過促進(jìn)一系列抗氧化劑因的表達(dá)而增強(qiáng)細(xì)胞的ROS清除能力。Nrf2在正常情況下會(huì)結(jié)合Keap1,以二聚體的形式存在于胞漿中,保持細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激損傷時(shí),Nrf2與Keap1解離進(jìn)入到細(xì)胞核,通過與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合啟動(dòng)NQO1、HO-1等抗氧化基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮抗氧化損傷的作用。本研究結(jié)果顯示,SUI組大鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)均降低,進(jìn)一步證實(shí)SUI大鼠存在氧化應(yīng)激損傷。本研究通過藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn),西洋參總皂苷可能通過改善SUI大鼠氧化應(yīng)激損傷而抑制尿道損傷,改善排尿功能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一猜想,本研究同時(shí)給予SUI大鼠高劑量的西洋參總皂苷和Nrf2特異性抑制劑ML385干預(yù),結(jié)果顯示,ML385可減弱西洋參總皂苷抑制SUI大鼠尿道損傷、改善氧化應(yīng)損傷和排尿功能的作用。因此提示西洋參總皂苷可能通過激活Nrf2/ARE信號(hào)減輕SUI大鼠尿道氧化應(yīng)激損傷,改善排尿功能。

綜上所述,西洋參總皂苷可通過激活Nrf2/ARE信號(hào)通路改善壓力性尿失禁排尿功能,從而對(duì)壓力性尿失禁達(dá)到治療作用。