外泌體在牙科正畸治療中的應(yīng)用研究

姜可 王權(quán)炳 顧京柯 陳虹

正畸治療即通過各種矯正裝置來調(diào)整面部骨骼、牙齒及頜面部的神經(jīng)和肌肉之間的協(xié)調(diào)性，達(dá)到口頜系統(tǒng)平衡、穩(wěn)定和美觀的目的。正畸牙齒移動(dòng)（orthodontic tooth movement，OTM）是達(dá)到矯治目標(biāo)的重要手段，通過對(duì)牙齒施加機(jī)械力，引起牙周膜和牙槽骨發(fā)生必要的變化[1]。在正畸力的作用下，牙周膜局部血管和微環(huán)境發(fā)生變化，如炎癥因子和活性生物因子的釋放、血管變化、細(xì)胞形變等，從而引起復(fù)雜的生物學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致骨吸收和骨重塑，最終實(shí)現(xiàn)OTM。此過程中的炎癥反應(yīng)是由機(jī)械力而非細(xì)菌引起，其與組織穩(wěn)態(tài)之間的平衡對(duì)正畸治療效果至關(guān)重要。一旦失衡，炎癥可能導(dǎo)致牙根吸收和牙周疾病的發(fā)生[2]，影響正畸療效。因此如何有效和安全地加速OTM，減少治療過程中由炎癥引起的不良后果，快速實(shí)現(xiàn)良好且穩(wěn)定的治療效果，是正畸醫(yī)生工作的目標(biāo)和研究的重點(diǎn)。外泌體是一類由細(xì)胞分泌的包含復(fù)雜生物活性物質(zhì)的納米囊泡，可治療多種炎癥性疾病，并促進(jìn)骨再生。這種來源廣泛且安全性好、作用效率高的外泌體為正畸骨改建及炎癥控制提供了新的思路和方法[3]。本文就外泌體在正畸治療中的應(yīng)用、優(yōu)勢(shì)及可行性等作一綜述，以期為臨床提供參考。

1 外泌體簡介

外泌體是一類直徑為30～150 nm 具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外納米囊泡[4]。1983 年，Johnstone 等[5]在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了外泌體，并于1987 年將其命名為“exosome”。外泌體可由多種細(xì)胞分泌而來，也可從生物體液（血液、尿液、唾液等）中分離出來[6]。目前，從生物體液和體外細(xì)胞培養(yǎng)中分離純化外泌體的技術(shù)有差速離心、尺寸分離、外泌體沉淀法等，其中差速離心法是目前應(yīng)用最廣泛、最基本的分離方法[7-10]。外泌體中含有多種具有生物活性的RNA、miRNA、DNA 和蛋白質(zhì)，以旁分泌機(jī)制在細(xì)胞、組織和器官之間傳遞生物分子信息[11]，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的重要介質(zhì)[12]，介導(dǎo)了細(xì)胞間通信和大分子傳遞，從而發(fā)揮生理和病理作用；外泌體通常含有4 種跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81 和CD82）、熱休克蛋白、脂蛋白和一些轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，這些蛋白不僅可以為外泌體的鑒定提供標(biāo)記，還可以在特定的靶細(xì)胞中定位外泌體[13]。外泌體帶有親代細(xì)胞的理化性質(zhì)，又具有極高的生物相容性，同時(shí)也可以作為藥物的有效載體，如利用納米技術(shù)可將小分子或藥物裝載到外泌體中進(jìn)行疾病的靶向治療[14]，是近10 年來生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最為迅猛的研究方向之一。

2 外泌體在正畸治療中的作用

2.1 外泌體在OTM 中的骨改建作用 OTM 與生理性牙齒移動(dòng)機(jī)制不同，主要指在正畸力作用下牙周組織發(fā)生一系列生物學(xué)改建，并導(dǎo)致牙周膜和牙槽骨的重塑[15]。當(dāng)正畸力加載到牙齒上時(shí)，牙周膜內(nèi)的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等受到力的刺激導(dǎo)致促炎介質(zhì)（如IL-6、IL-8、TNF-α 等）的釋放，這些介質(zhì)在壓力和張力部位引起骨吸收和沉積，進(jìn)而發(fā)生OTM[16]。正畸治療正是利用體內(nèi)牙槽骨改建的動(dòng)態(tài)平衡移動(dòng)牙齒，進(jìn)而糾正錯(cuò)（牙合）畸形。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是參與OTM 的主要成員，其中破骨細(xì)胞是一種特殊的終末分化細(xì)胞，主要功能是降解骨量和吸收骨基質(zhì)，它與成骨細(xì)胞在功能上相互對(duì)應(yīng)，協(xié)同作用，并維持骨再生平衡。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞比例失調(diào)時(shí)，若破骨細(xì)胞相對(duì)活躍則容易造成骨質(zhì)損失，反之骨量會(huì)增多[17]。Atsawasuwan 等[18]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生牙齒移動(dòng)時(shí)，齦溝液外泌體中miRNA-29 的表達(dá)水平改變，這可能與牙齒運(yùn)動(dòng)期間破骨細(xì)胞的分化有關(guān)。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞來源外泌體中的miR-214 具有破壞并抑制成骨細(xì)胞的功能，并可利用促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶受體相互作用蛋白A2（Eph family receptor interacting protein A2，ephrinA2）/促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶A2（ery-thropoietin producing hepatocyte kinases A2，EphA2）的特點(diǎn)將miR-214/miR-214-3p 精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移至成骨細(xì)胞中，達(dá)到降低成骨細(xì)胞分化、抑制成骨細(xì)胞活性并減少骨形成的作用。這種骨平衡的破壞則加速了正畸過程中牙齒的移動(dòng)[20]。Huang 等[21]將牙周膜干細(xì)胞來源外泌體注射到小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠牙周膜中的破骨細(xì)胞比例增加，并促進(jìn)機(jī)械力誘導(dǎo)下牙齒的移動(dòng)。由此可見，外泌體具有加快OTM、促進(jìn)OTM 后骨改建的作用，為臨床醫(yī)生提供了新的正畸輔助手段。

2.2 外泌體在快速擴(kuò)弓中的應(yīng)用 快速擴(kuò)弓（rapid maxillary expansion，RME）技術(shù)最早于1860 年由Angell提出并將其應(yīng)用于臨床[22]，如今已被廣泛應(yīng)用于上牙弓狹窄、上頜橫向發(fā)育不足、上頜牙列擁擠、后牙反合等錯(cuò)（牙合）畸形中。在進(jìn)行RME 時(shí)，機(jī)械力刺激了腭中縫骨組織的重塑，促進(jìn)了腭中縫區(qū)的成骨活動(dòng)。但是擴(kuò)張力解除后，腭中縫組織重塑恢復(fù)到正常水平[23]，同時(shí)口腔周圍神經(jīng)肌肉功能不穩(wěn)定，腭骨水平板向腭中線聚集的力量增加，致使一部分新形成的骨組織受到壓力而發(fā)生吸收，造成復(fù)發(fā)[24]。目前臨床上主要通過矯形過度擴(kuò)張和長期佩戴保持器等治療擴(kuò)弓后的復(fù)發(fā)，但治療效果不理想并增加患者不適感。Saito等[25]報(bào)道，腭中縫骨再生不足是復(fù)發(fā)的主要原因。Oztürk 等[26]研究發(fā)現(xiàn)雙磷酸鹽可抑制骨吸收，在快速上頜擴(kuò)弓后注射雙磷酸鹽，輔助機(jī)械保持可減少擴(kuò)弓后的復(fù)發(fā)，但過大劑量的雙磷酸鹽反而對(duì)頜骨的礦化產(chǎn)生一定的障礙。劉青等[27]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠促進(jìn)大鼠上頜RME 時(shí)腭中縫骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 的表達(dá)，加速新骨形成并促進(jìn)骨質(zhì)沉積鈣化，進(jìn)而防止擴(kuò)弓后復(fù)發(fā)，但槲皮素大量攝入后會(huì)引起胃腸道反應(yīng)、關(guān)節(jié)疼痛和僵硬、體內(nèi)荷爾蒙水平異常變化等不良反應(yīng)。Zhao 等[28]將可注射的介孔生物活性玻璃/纖維蛋白膠復(fù)合水凝膠使用于快速上頜擴(kuò)張中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)減少且成骨加速。Ekizer 等[29]對(duì)模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組，單次局部注射干細(xì)胞治療增加了腭中縫區(qū)域的成骨細(xì)胞和血管數(shù)量，可以在上頜擴(kuò)張后更快地成骨。隨著外泌體相關(guān)研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞來源外泌體具有優(yōu)異的誘導(dǎo)成骨性能。如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體可利用miR-196a 正向調(diào)節(jié)成骨基因表達(dá)和成骨細(xì)胞分化[30]。Zhai 等[31]研究發(fā)現(xiàn)將干細(xì)胞外泌體與3D 打印的鈦合金支架結(jié)合可有效治療骨缺損，RNA測(cè)序表明干細(xì)胞外泌體主要通過上調(diào)的成骨miRNA（Hsa-miR-146a-5p、Hsa-miR-503-5p、Hsa-miR-483-3p 和Hsa-miR-129-5p）或下調(diào)的抗成骨miRNA（HsamiR-32-5p、Hsa-miR-133a-3p 和Hsa-miR-204-5p）誘導(dǎo)成骨分化，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B 通路（protein kinase B，Akt）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路以促進(jìn)成骨。Li等[32]發(fā)現(xiàn)從M2 型巨噬細(xì)胞中分離的外泌體可以通過miR-690/胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）/具有盤狀同源區(qū)域結(jié)合序列的轉(zhuǎn)錄共活化因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ）信號(hào)通路促進(jìn)成骨。據(jù)此推測(cè)，通過外泌體增加成骨、增強(qiáng)骨再生并促進(jìn)新的骨質(zhì)鈣化來增加上頜骨擴(kuò)張穩(wěn)定性[33-35]，減少正畸RME 后的復(fù)發(fā)可能是一種臨床應(yīng)用前景較好的潛在方法。

2.3 外泌體在正畸過程中的牙周炎癥控制作用 作為正畸治療的補(bǔ)充，牙周治療通常在正畸治療開始前3～6 個(gè)月完成，從而減少在正畸治療期間牙周炎癥致牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)等風(fēng)險(xiǎn)。然而，在固定矯治過程中口腔內(nèi)通常存在托槽、橡皮鏈、弓絲等正畸材料，治療周期較長，食物殘?jiān)灰浊鍧?，增加了牙石和菌斑堆積的風(fēng)險(xiǎn)，降低牙齦健康程度以及口腔衛(wèi)生程度[36]，導(dǎo)致口腔微生物群落結(jié)構(gòu)惡化，進(jìn)而引起齦炎，表現(xiàn)為牙齦紅腫、出血等癥狀[37-38]。而長期的齦炎得不到改善將形成牙周炎，影響正畸的效果。因此在正畸治療過程中，牙周炎癥的控制尤為重要。Liu 等[39]研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體可能參與骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）-NF-κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）-NF-κB 受體活化因子（receptor activator of nuclear factor kappa B，RANK）信號(hào)通路并抑制破骨細(xì)胞的功能，通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化來調(diào)控炎癥免疫反應(yīng)，從而抑制牙周炎的進(jìn)一步發(fā)展和免疫損傷。籍辰等[40]研究發(fā)現(xiàn)在慢性牙周炎小鼠模型中，M1 型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，提示慢性牙周炎的炎癥反應(yīng)和組織損傷中有M1 型巨噬細(xì)胞參與；而牙齦干細(xì)胞來源外泌體能夠促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞向M2 型極化，減輕炎癥反應(yīng)[41]。使用外泌體配合牙周炎基礎(chǔ)治療有利于接受正畸治療的牙周炎患者牙槽骨吸收，為牙周炎患者正畸治療提供了思路。朱斌等[42]發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體能顯著促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞增殖、克隆及成骨。Chew 等[43]利用牙周膜干細(xì)胞來源外泌體實(shí)現(xiàn)了大鼠缺損牙周組織的牙槽骨再生及功能性牙周膜纖維再生，為牙周組織的再生提供了新的無細(xì)胞方法，并可能對(duì)因正畸引起的牙齦萎縮起到改善作用。同樣，Li 等[44]研究表明牙周膜干細(xì)胞來源的外泌體可通過PI3K/Akt 信號(hào)通路促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的活性，促進(jìn)正畸誘導(dǎo)炎癥性牙根吸收的修復(fù)?？梢娫谡^程中協(xié)同使用干細(xì)胞來源外泌體治療牙周炎，可達(dá)到減輕牙周組織炎癥、抑制牙周組織吸收、促進(jìn)牙周組織再生的作用[45]。

2.4 外泌體在正畸保持階段的應(yīng)用 在OTM 期間，移動(dòng)牙齒根部（張力側(cè)）新形成的骨骼可作為防止復(fù)發(fā)的初始屏障。如果沒有足夠長的保留期，剛重塑的牙槽骨因沒有完全礦化，無法抵抗間隔纖維引起的復(fù)發(fā)力，會(huì)發(fā)生正畸后的復(fù)發(fā)[46]。因此，促進(jìn)正畸牙根張力側(cè)新骨的生成及礦化是抑制正畸復(fù)發(fā)的重點(diǎn)。外泌體誘導(dǎo)鈣質(zhì)沉積、促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的性能使其在正畸后的保持階段依然發(fā)揮不容忽視的輔助治療作用。費(fèi)棟棟[47]研究表明，牙周膜干細(xì)胞來源的外泌體可能通過攜帶更多的組蛋白賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶6A（lysine acetyltransferase 6A，KAT6A）mRNA，介導(dǎo)靶細(xì)胞-牙周膜干細(xì)胞KAT6A 的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而影響其組蛋白乙?；?，達(dá)到促進(jìn)靶細(xì)胞成骨分化的作用。Xiong 等[48]發(fā)現(xiàn)miR-5106 在M2 型巨噬細(xì)胞中高度富集，并且通過靶向鹽誘導(dǎo)激酶（salt-inducible kinases，SIK）2 和SIK3 基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化。劉先博[49]研究發(fā)現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞來源的外泌體可以攜帶miR-100-5p 通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）調(diào)控OTM 局部牙槽骨改建，抑制正畸后的牙齒移動(dòng)，降低患者正畸后的復(fù)發(fā)率。Liu 等[50]使用辛伐他汀和牙周膜干細(xì)胞來源的外泌體在體外獲得裝載辛伐他汀的外泌體，并將其應(yīng)用于OTM 大鼠模型；在復(fù)發(fā)期間于大鼠的局部牙槽骨注射裝載辛伐他汀的外泌體，結(jié)果表明外泌體可增加辛伐他汀在患處局部的溶解度，抑制了OTM 大鼠模型正畸后的復(fù)發(fā)。亦有文獻(xiàn)報(bào)道來自成熟破骨細(xì)胞的外泌體可抑制破骨細(xì)胞的形成[51]，從而維持正畸的治療效果。目前矯正結(jié)束后，單純通過保持器進(jìn)行正畸術(shù)后的保持，大多依賴患者的依從性，而在正畸結(jié)束后使用外泌體治療可加速成骨和骨質(zhì)成熟，輔助保持器作用，達(dá)到減少正畸后復(fù)發(fā)的效果。

3 小結(jié)

隨著正畸技術(shù)的不斷發(fā)展，正畸學(xué)開始使用細(xì)胞和生化信號(hào)，不斷豐富理論基礎(chǔ)，并進(jìn)行新的臨床應(yīng)用嘗試。正畸過程中牙齒的移動(dòng)、擴(kuò)弓后及正畸后的保持不能僅依靠于單純的機(jī)械力，外泌體的應(yīng)用為正畸治療提供了一種安全、創(chuàng)新、無細(xì)胞的輔助手段，這為臨床醫(yī)生提供了新的思路，但外泌體的臨床適用性仍然受到限制。因此，需要更多的研究來闡明外泌體在正畸過程中的具體作用、分子機(jī)制以及如何將其量化，從而更有效地增強(qiáng)正畸治療、優(yōu)化正畸力強(qiáng)度和預(yù)防正畸治療導(dǎo)致的牙周組織損傷等。