急性肺損傷兔改良肺部超聲評(píng)分與血?dú)庾兓南嚓P(guān)性

郭靜宜 柳秋月 歐幼寬 顏富強(qiáng) 曾坤章 蔡名利 黃藝君 呂國(guó)榮

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指在嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性疾病過程中，肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全，損傷到一定程度可以出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［1-2］。ALI 和ARDS具有性質(zhì)相同的病理生理改變，ALI是ARDS的早期階段，早期診斷ALI 對(duì)預(yù)防ARDS 具有重要意義［3］。ARDS 柏林定義［4］中采用氧合指數(shù)（oxygenation index，PaO2/FiO2）作為ARDS 分級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)，并將ALI 歸為輕度ARDS。既往研究［5-6］多采用床旁超聲指標(biāo)B線分布密度及范圍來評(píng)價(jià)ALI程度，但此方式對(duì)肺損傷的評(píng)估過于單一，不夠全面。改良肺部超聲評(píng)分（modified lung ultrasound score，MLUS）通過結(jié)合B 線數(shù)量、有無肺實(shí)變、胸膜線等情況及有無并發(fā)癥（Am 線、胸腔積液）對(duì)肺部進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)分，從而全面反映肺部損傷情況，相較于單純B 線評(píng)價(jià)更為全面、準(zhǔn)確［7-8］。本實(shí)驗(yàn)通過分析ALI 兔MLUS 與PaO2/FiO2、病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性，旨在為臨床早期診斷ALI提供理論基礎(chǔ)支持。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取清潔級(jí)健康新西蘭兔20 只，均為雄性，體質(zhì)量2.50～3.21 kg，平均（2.91±0.42）kg，均購自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)［許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0001，合格證編號(hào)：20170008003019］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（jjsyyys16-202205）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.ALI 動(dòng)物模型建立：20 只新西蘭雄兔造模前均行超聲檢查提示未見明顯B 線后，參考Balakrishna等［9］方法將其中15 只實(shí)驗(yàn)兔在超聲引導(dǎo)下經(jīng)氣管注入HCl 溶液建立ALI 模型，具體為：動(dòng)物禁食6 h 后稱重，沿兔耳緣靜脈緩慢推注3%戊巴比妥鈉1.25 ml/kg（美國(guó)Amresco 公司），隨后注入生理鹽水1 ml 沖管。待實(shí)驗(yàn)兔麻醉后剃除頸部、右大腿根部、前胸、外側(cè)胸部及后背部皮毛，使用20 G 留置針在超聲（邁瑞Resona 7 彩色多普勒超聲診斷儀）引導(dǎo)下向足端穿刺環(huán)甲膜進(jìn)入氣管，注入pH 值1.5、1.2、1.0 HCl 溶液（青州市圣陽化工有限公司），每組各5只，HCl溶液劑量均為2 ml/kg；對(duì)照組注入等量生理鹽水。在無氧氣通氣的條件下，PaO2/FiO2＜300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）表明ALI模型成功建立［9］。

2.血?dú)夥治觯撼曇龑?dǎo)下行右側(cè)股動(dòng)脈插管術(shù)，插入24 G 留置針后使用肝素帽封閉并固定，作為動(dòng)脈血?dú)夥治鋈⊙?。分別于造模前及造模后（從注入HCl 溶液/生理鹽水算起）1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 從股動(dòng)脈采集動(dòng)脈血2 ml，立即使用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x（GEM Premier 3500，美國(guó)儀器實(shí)驗(yàn)室公司）檢測(cè)血氧分壓（PaO2），因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程未吸入氧氣，故吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)（FiO2）為固定值0.21，計(jì)算PaO2/FiO2。

3.超聲檢查：使用邁瑞Resona 7 彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭，頻率6～15 MHz。將實(shí)驗(yàn)兔前胸壁左、右側(cè)均分為上、下兩個(gè)肺區(qū)，沿肋間隙依次行超聲掃查，盡量避免肋骨遮擋，上述4個(gè)肺區(qū)超聲評(píng)分之和為MLUS。每只實(shí)驗(yàn)兔于上述6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)按照MLUS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察和記錄［7］。MLUS標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 MLUS標(biāo)準(zhǔn)

4.兔肺組織病理學(xué)檢查：造模后12 h 于上述檢查結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)兔，肉眼觀察肺大體組織。全肺按照劃分的4 個(gè)肺區(qū)取材并行HE 染色。光學(xué)顯微鏡（BX53，日本奧林巴斯）下每張切面取3 個(gè)不重疊視野，觀察是否有肺內(nèi)出血、毛細(xì)血管充血、肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚或透明膜形成，每個(gè)指標(biāo)的病理學(xué)評(píng)分取每張切片3個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均值。參考文獻(xiàn)［10］中病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無明顯損傷為0 分，損傷≤整個(gè)視野面積的25%為1 分，損傷占整個(gè)視野面積25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分，4 個(gè)指標(biāo)的平均值之和為該切片的病理學(xué)評(píng)分。根據(jù)Murry肺損傷評(píng)分法［11］判斷嚴(yán)重程度，即＜1.5分為輕度損傷，1.5～2.5分為中度損傷，＞2.5分為重度損傷。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

15 只ALI兔PaO2/FiO2均＜300 mm Hg，造模成功率為100%。ALI 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2變化見表2。HCl所致ALI 兔的主要超聲表現(xiàn)：超聲引導(dǎo)下經(jīng)氣管注入HCl 溶液后30 min 內(nèi)，損傷肺區(qū)均出現(xiàn)B 線，隨著HCl 溶液pH 值減小（即濃度增大）及時(shí)間的推移，B 線數(shù)量增加，并出現(xiàn)融合，部分損傷肺區(qū)胸膜線增厚、模糊不清，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)胸膜線呈不連續(xù)碎片狀。損傷嚴(yán)重的肺區(qū)可見少量胸腔積液及實(shí)變影。經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)pH 值1.5、1.2、1.0 HCl 溶液建立模型對(duì)應(yīng)ALI 輕、中、重度組，每組各5 只。ALI 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)肺超聲圖見圖1～3。

圖1 ALI輕度組一實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)肺超聲圖

圖2 ALI中度組一實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)肺超聲圖

表2 ALI各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2變化mm Hg

一、各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)MLUS 及PaO2/FiO2比較

1.各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)MLUS 比較：各組實(shí)驗(yàn)兔造模前MLUS 均為0 分；其中對(duì)照組造模前后MLUS無明顯變化（P=0.278）。造模后隨著時(shí)間的推移，ALI各組MLUS 逐漸增高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；且ALI 輕度組造模后12 h MLUS與造模后1 h、2 h、4 h 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），ALI 中、重度組造模后12 h MLUS 與造模后1 h、2 h 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖1～3和表3。

表3 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)MLUS比較（）分

表3 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)MLUS比較（）分

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ALI輕度組比較，#P＜0.05；與ALI中度組比較，$P＜0.05；與同組造模前比較，aP＜0.05；與同組造模后1 h比較，bP＜0.05；與同組造模后2 h比較，cP＜0.05；與同組造模后4 h比較，dP＜0.05

?

2.各組不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2比較：對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2無明顯變化（P=0.473）。造模后隨著時(shí)間的推移，PaO2/FiO2逐漸降低；ALI 輕、中、重度組造模后不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2均低于對(duì)照組，且重度組造模后12 h時(shí)降低幅度最大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；ALI 輕度組造模后4 h、8 h、12 h，ALI 中度組造模后2 h、4 h、8 h、12 h，ALI重度組造模后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h PaO2/FiO2均低于造模前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表4。

表4 各組實(shí)驗(yàn)兔不同時(shí)間點(diǎn)PaO2/FiO2比較（）mm Hg

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與ALI輕度組比較，#P＜0.05；與ALI中度組比較，$P＜0.05；與同組造模前比較，aP＜0.05；與同組造模后1 h比較，bP＜0.05；與同組造模后2 h 比較，cP＜0.05；與同組造模后4 h比較，dP＜0.05。1 mm Hg=0.133 kPa

?

二、各組實(shí)驗(yàn)兔大體圖肉眼觀察、病理學(xué)檢查及肺病理學(xué)評(píng)分比較

1.大體圖肉眼觀察：對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔肺形狀良好，質(zhì)輕而柔軟，富有彈性，呈淡粉紅色，擠壓后無明顯滲出；ALI各組實(shí)驗(yàn)兔肺飽滿，病變部位有大量的出血和淤血，擠壓后有血性液體滲出。見圖4。

2.病理學(xué)檢查：對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔肺泡大小均勻，結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無明顯滲出物，肺泡間隔無明顯異常，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ALI 輕、中、重度組實(shí)驗(yàn)兔肺泡腔內(nèi)滲出液增多，并出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡壁增厚或透明膜形成等改變。見圖5。

圖5 各組實(shí)驗(yàn)兔肺組織病理圖（HE染色，×200）

3.各組實(shí)驗(yàn)兔病理學(xué)評(píng)分比較：對(duì)照組病理學(xué)評(píng)分為0.0（0.0，1.0），處于低水平；ALI 輕、中、重度組病理學(xué)評(píng)分分別為12.0（12.0，16.0）分、19.0（18.0，19.0）分、26.0（25.0，27.0）分，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.756，P＜0.001）；ALI中、重度組病理學(xué)評(píng)分均較對(duì)照組增加，ALI 重度組較輕度組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.001）；對(duì)照組與輕度組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、MLUS 與PaO2/FiO2 及病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性分析

MLUS 與PaO2/FiO2、病理學(xué)評(píng)分均呈強(qiáng)相關(guān)（r=-0.802、0.963，均P＜0.05）。見圖6，7。

圖6 MLUS與PaO2/FiO2的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖7 MLUS與病理學(xué)評(píng)分的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

討論

ALI/ARDS 的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，多數(shù)認(rèn)為與炎癥失控和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，早期病變主要有炎性滲出、肺泡內(nèi)出血、水腫、實(shí)變等，通過治療可以逆轉(zhuǎn)［13-14］，因此對(duì)于ARDS的早期診斷尤為重要。2012年ARDS 柏林定義指出PaO2/FiO2＜300 mm Hg 可作為ALI 的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一［4］。經(jīng)氣管注入HCl 溶液可引起ALI，本實(shí)驗(yàn)利用不同pH 值HCl 溶液建立不同程度ALI 動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)過程中ALI 各組實(shí)驗(yàn)兔PaO2/FiO2均＜300 mm Hg，且隨著pH 值減小（即濃度增加），肺部發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺水腫、肺出血、肺泡壁增厚或透明膜形成的病理學(xué)表現(xiàn)依次加重，成功建立了不同病理程度ALI 動(dòng)物模型，證實(shí)pH 值1.5、1.2、1.0 HCl 溶液建立模型對(duì)應(yīng)ALI輕、中、重度組，每組各5只，造模成功率為100%。

近年來，超聲在肺部疾病方面的應(yīng)用越來越成熟，但其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)存在諸多爭(zhēng)議。既往研究［15］中肺部超聲的聚焦點(diǎn)在B 線分布密布和范圍，但這種評(píng)價(jià)并不全面。當(dāng)發(fā)生ALI 時(shí)，炎癥因子釋放而導(dǎo)致肺毛細(xì)血管及肺泡上皮細(xì)胞損傷，從而引起毛細(xì)血管通透性增加，肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡滲出液增多，引起肺水腫、肺泡萎陷、肺組織含氣減少。肺水腫的肺部超聲表現(xiàn)為B 線征，而滲出液增多使液體積聚在胸膜腔內(nèi)可出現(xiàn)胸腔積液，肺組織含氣減少易引起肺實(shí)變。趙偉英等［16］研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)ALI的損傷程度，胸膜線可模糊或消失。因此本實(shí)驗(yàn)采用團(tuán)隊(duì)提出的MLUS標(biāo)準(zhǔn)［8］，將B 線、胸膜線、胸腔積液、肺實(shí)變等納入，對(duì)B 線和胸膜線的變化進(jìn)行了更為詳細(xì)的分級(jí)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移及肺部病理損傷程度的增加，MLUS 越來越高，ALI 兔各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），表明MLUS 標(biāo)準(zhǔn)可以評(píng)估不同程度ALI。另外本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ALI輕度組造模后12 h MLUS 與造模后1 h、2 h、4 h 比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），ALI 中、重度組造模后12 h MLUS 與造模后1 h、2 h比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），ALI 中、重度組后期MLUS 增高不顯著，可能是由于ALI 的嚴(yán)重程度不同所致，ALI 中、重度組在造模后迅速出現(xiàn)明顯的肺部超聲表現(xiàn)，而輕度組則隨著時(shí)間的推移，損傷程度逐步加重，MLUS逐漸升高。

郭雪芹等［15］研究指出，肺部超聲顯示胸部彌漫性B 線分布密度和范圍可反映肺組織病理損傷程度，PaO2的下降晚于B 線的出現(xiàn)。Gargani 等［17］誘導(dǎo)豬肺損傷時(shí)發(fā)現(xiàn)肺損傷的超聲表現(xiàn)早于血?dú)庵笜?biāo)的改變。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)氣管注入HCl 溶液后，其受損傷肺區(qū)迅速出現(xiàn)B 線，隨著HCl 溶液pH 值減?。礉舛仍黾樱┘皶r(shí)間的推移，B 線數(shù)量增加且出現(xiàn)胸膜線模糊、胸腔積液及肺實(shí)變等表現(xiàn)，ALI 肺部超聲表現(xiàn)在MLUS 標(biāo)準(zhǔn)中充分體現(xiàn)。ALI 各組實(shí)驗(yàn)兔造模后1 h MLUS 均較造模前增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而ALI輕度組造模后4 h、8 h、12 h，ALI中度組造模后2 h、4 h、8 h、12 h，ALI 重度組造模后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h PaO2/FiO2均低于造模前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），可見PaO2/FiO2下降晚于ALI 肺部超聲改變，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。薛鈺奇［18］應(yīng)用超聲評(píng)估沖擊傷致山羊肺損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造模后9 h Rouby 超聲評(píng)分與PaO2/FiO2呈負(fù)相關(guān)（r=-0.658，P＜0.05）。與MLUS 標(biāo)準(zhǔn)相比，Rouby 超聲評(píng)分法僅以B 線征及肺實(shí)變?yōu)橐罁?jù)進(jìn)行肺損傷的超聲評(píng)價(jià)，未將胸腔積液及胸膜線情況納入，且評(píng)分細(xì)則少，未進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)。因此，MLUS 標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)更為全面，評(píng)價(jià)結(jié)果分級(jí)更為精準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MLUS與PaO2/FiO2呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（r=-0.802，P＜0.05），與薛鈺奇［18］研究結(jié)果相同，表明MLUS 與診斷ALI 的重要指標(biāo)PaO2/FiO2在判斷ALI 程度方面具有一致性，可用于ALI 的診斷及病情進(jìn)展的評(píng)價(jià)。且由于超聲操作便攜，可對(duì)ALI的病情發(fā)展進(jìn)行及時(shí)評(píng)估并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，因此，MLUS 標(biāo)準(zhǔn)是一種早期、無創(chuàng)、簡(jiǎn)便的肺損傷檢測(cè)方法。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)MLUS 與病理學(xué)評(píng)分呈強(qiáng)正相關(guān)（r=0.963，P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)MLUS 標(biāo)準(zhǔn)可用于評(píng)估ALI程度。

綜上所述，ALI 兔MLUS 與PaO2/FiO2相關(guān)；MLUS標(biāo)準(zhǔn)可以半定量評(píng)估ALI 程度。但本實(shí)驗(yàn)樣本量偏小，且采用HCl溶液注入建立ALI 兔模型，臨床上吸入性肺損傷不僅有HCl 溶液吸入，還有其他一些致病物質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論仍需在更接近臨床實(shí)際情況的動(dòng)物模型中進(jìn)一步驗(yàn)證。