沙門(mén)氏菌ERA 可視化快速檢測(cè)方法的建立

楊艷歌，王 帥，2，李紅娜，李 濤，吳占文，2，孫冬梅，袁 飛*

（1 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全）北京100176 2 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 黑龍江大慶 163000）

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是環(huán)境中廣泛存在的一類(lèi)食源性致病菌，能夠引起人畜食物中毒[1]，引起腸道內(nèi)疾病，表現(xiàn)為急性發(fā)熱、腹痛、嘔吐等癥狀[2]，也可導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎的發(fā)生[3]。據(jù)報(bào)道，全球每年約有9 000 多萬(wàn)例的沙門(mén)氏菌感染事件[4]。我國(guó)現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)GB 29921-2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)包裝食品中致病菌限量》[5]中明確規(guī)定，肉制品、水產(chǎn)制品、即食蛋制品等食品中不得檢出沙門(mén)氏菌。目前沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)法[6]、免疫分析法[7]、PCR 檢測(cè)法[8]、芯片檢測(cè)法[9]、質(zhì)譜分析法[10]、光譜測(cè)定法等[11]。其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法耗時(shí)費(fèi)力，PCR 法、芯片法、質(zhì)譜光譜法等均需依賴(lài)精準(zhǔn)控溫的儀器、設(shè)備和專(zhuān)業(yè)的操作，不適合室外環(huán)境快速檢測(cè)。

酶促等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Enzymatic recombinase amplification，ERA）是我國(guó)自主研發(fā)的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，誕生時(shí)間較晚，其反應(yīng)原理與RPA技術(shù)類(lèi)似[12-13]，都是在37～42 ℃的常溫環(huán)境下，重組酶與引物DNA 緊密結(jié)合的聚合物在模板DNA上搜索到完全匹配的互補(bǔ)序列，然后在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下打開(kāi)DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，最后在DNA 聚合酶的作用下完成擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。目前關(guān)于ERA 技術(shù)的研究主要集中在病毒和臨床疾病檢測(cè)等方面。如曾宇晨等[14]建立了非洲豬瘟病毒B646L、EP402R、MGF505/360 基因ERA檢測(cè)方法，并應(yīng)用到臨床樣品的檢測(cè)。Zhang 等[15]建立了一種檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3 型的ERACRISPR/Cas12a 方法。Yang 等[16]建立了一種鑒別豬流行性腹瀉病毒PEDV 野生型的ERACRISPER/Cas12a 方法。Liu 等[17]使用ERA 試劑盒結(jié)合CRISPR 技術(shù)建立一種快速檢測(cè)癌癥細(xì)胞耐藥基因FLT3-F691L 的方法，40 min 即可獲得檢測(cè)結(jié)果。Meng 等[18]基于ERA 試劑盒結(jié)合CRISPR技術(shù)建立便捷、即時(shí)的檢測(cè)啤酒腐敗菌的方法。然而，目前未見(jiàn)該技術(shù)在食源性致病菌快速檢測(cè)中的報(bào)道。

本研究將文獻(xiàn)報(bào)道的沙門(mén)氏菌RPA 引物探針應(yīng)用到ERA 快速檢測(cè)體系，擬建立熒光法和顯色法兩種沙門(mén)氏菌ERA 可視化高效快速檢測(cè)方法，旨在為沙門(mén)氏菌可視化快速檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，購(gòu)于北京某超市。熱貼和自熱包，購(gòu)于某電商平臺(tái)。試驗(yàn)用菌，分別購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）、中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）和中國(guó)檢驗(yàn)檢疫微生物菌種保藏管理中心（Inspection and Quarantine Culture Collections，IQCC），詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)用菌株信息Table 1 Information about the strains used in this study

腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（Brain heart infusion，BHI）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（Brain heart infusion agar，BHIA），英國(guó)Oxoid 公司；PrepManTMUltra樣品制備試劑，美國(guó)Thermo Fisher 公司；基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA 法）、熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA 法），蘇州先達(dá)基因科技有限公司；酚∶氯仿∶異戊醇（體積比為25 ∶24 ∶1）、10000×SYBR Green I，北京索萊寶科技有限公司；中性紅、苯酚紅、鈣黃綠素，天津福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)；羥基萘酚藍(lán)，山東酷爾化學(xué)有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

Pico 17 離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific 公司；掌上離心機(jī)，美國(guó)SCILOGEX 公司；渦旋混合器，德國(guó)IKA 公司；拍擊式均質(zhì)器，法國(guó)Interscience 公司；高壓滅菌鍋，以色列Tuttnauer 公司；DH-420 電熱恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Memmert 公司；水浴鍋，金壇市白塔新寶儀器廠(chǎng)；BioSpec-nano 核酸蛋白分析儀，日本島津公司；便攜式迷你qPCR儀，上海翊輝生物科技有限公司；電泳儀、全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)PharosFX，美國(guó)伯樂(lè)（BIO-RAD）公司。

1.3 方法

1.3.1 引物來(lái)源 按參考文獻(xiàn)[19]～[22]合成引物及探針序列，所有引物和探針均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 引物探針序列信息Table 2 The information of primers and probes

1.3.2 沙門(mén)氏菌培養(yǎng)及基因組DNA 提取 將凍干菌粉接種到5 mL BHI 培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)20 h。取菌液，平板劃線(xiàn)接種至BHIA 培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h，挑取單菌落加入5 mL BHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。取1 mL 菌液置于1.5 mL 離心管中16 000×g 離心2 min，去上清，加入100 μL PrepManTMUltra 樣品制備試劑提取液，渦旋振蕩混勻，然后100 ℃水浴10 min，16 000×g 離心2 min，取上清液50 μL，即提取的DNA，采用核酸蛋白分析儀測(cè)其濃度后-20 ℃保存[23]。

1.3.3 反應(yīng)體系與檢測(cè)程序 ERA 熒光法反應(yīng)體系參照熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA 法）使用說(shuō)明書(shū)制備預(yù)混液，基礎(chǔ)型ERA 體系（顯色法）參照基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA）說(shuō)明書(shū)制備預(yù)混液，模板量均為1 μL。預(yù)混液混勻后取48 μL 轉(zhuǎn)移至ERA 酶粉反應(yīng)管，向管蓋滴加2 μL 激活劑，蓋緊后渦旋瞬時(shí)離心，ERA 熒光反應(yīng)體系放入便攜式迷你qPCR 儀。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?9 ℃反應(yīng)1 s；39℃反應(yīng)14 s，40 個(gè)循環(huán)。在第二反應(yīng)階段收集FAM 熒光信號(hào)，檢測(cè)閾值設(shè)為自動(dòng)。ERA 顯色法反應(yīng)程序設(shè)置為：39 ℃擴(kuò)增15 min。反應(yīng)結(jié)束，取25 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24∶1），振蕩混勻后充分離心，上清用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。其余擴(kuò)增產(chǎn)物用于后續(xù)顯色法試驗(yàn)。

1.3.4 引物探針篩選 以表1 中5 株沙門(mén)氏菌為模板，采用表2 中編號(hào)1、2、4 的3 套引物探針進(jìn)行ERA 熒光法檢測(cè)，采用表2 中的4 組引物（編號(hào)1，2，3，4）進(jìn)行基礎(chǔ)型ERA 檢測(cè)，比較擴(kuò)增效果。對(duì)擴(kuò)增效率較好的引物和探針進(jìn)行特異性分析。以腸炎沙門(mén)氏菌為檢測(cè)對(duì)象，以表1 中編號(hào)6～17 的12 種菌為特異性分析的陰性對(duì)照菌株。通過(guò)上述試驗(yàn)，篩選擴(kuò)增效率高、特異性好的引物探針組合進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。所有DNA 樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，以無(wú)菌ddH2O 為陰性對(duì)照，做3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.5 顯色法的建立 為滿(mǎn)足基礎(chǔ)型ERA 快速的需求，需建立一種現(xiàn)場(chǎng)可視化分析方法以取代電泳法。分別配制100 μmol/L 的中性紅、羥基萘酚藍(lán)、苯酚紅、鈣黃綠素，以及1000× SYBR Green I溶液。ERA 反應(yīng)后，分別向管中添加1，1.5，2.5，2.5 μL 和3.5 μL 上述顯色液，選擇能明顯區(qū)分陽(yáng)性和陰性結(jié)果的顯色劑和劑量。所有DNA 樣品質(zhì)量濃度統(tǒng)一為10 ng/μL，以無(wú)菌ddH2O 為陰性對(duì)照，做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.6 ERA 檢測(cè)方法反應(yīng)程序優(yōu)化 為建立可視化ERA 快速檢測(cè)方法，對(duì)ERA 檢測(cè)程序進(jìn)行優(yōu)化。

1）ERA 熒光法反應(yīng)程序優(yōu)化 將1.3.3 節(jié)ERA 熒光法反應(yīng)程序中的循環(huán)數(shù)分別縮短為35，30，25 和20，以腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 的DNA（10 ng/μL）為模板，采用1.3.4 節(jié)篩選的最佳引物探針組合進(jìn)行ERA 反應(yīng)，比較擴(kuò)增結(jié)果并確定熒光型ERA 快速反應(yīng)程序。試驗(yàn)過(guò)程中以無(wú)菌ddH2O 為空白對(duì)照。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行，做重復(fù)試驗(yàn)2 次（n=4）。

2）ERA 顯色法反應(yīng)程序優(yōu)化 將1.3.3 節(jié)基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)程序的擴(kuò)增時(shí)間分別縮短到12，10，8，6 min 和4 min，以腸炎 沙門(mén)氏 菌ATCC10708 的DNA（10 ng/μL）為模板，以1.3.4 節(jié)篩選的最佳引物組合進(jìn)行ERA 反應(yīng)，比較擴(kuò)增結(jié)果并確定ERA 顯色法快速反應(yīng)程序。以無(wú)菌ddH2O 為空白對(duì)照，做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.7 不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法的建立 為滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求，對(duì)DNA 提取和ERA 檢測(cè)中需要依賴(lài)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的步驟進(jìn)行改良。以腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 為研究對(duì)象，采用自熱盒加熱的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴鍋進(jìn)行DNA 提取，同時(shí)用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)沸騰時(shí)的溫度和維持時(shí)間。采用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA 濃度和純度。使用熱帖加熱的方式代替PCR 儀或等溫?cái)U(kuò)增儀進(jìn)行ERA 檢測(cè)，同時(shí)用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)熱帖達(dá)到ERA 反應(yīng)最適溫度的時(shí)間，采用顯色法進(jìn)行結(jié)果分析，電泳法驗(yàn)證檢測(cè)效果。以上試驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.8 ERA 可視化快速檢測(cè)方法靈敏度分析 為分析建立的ERA 可視化快速檢測(cè)方法的靈敏度，將腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 的DNA 稀釋至102，101，100，10-1，10-2ng/μL，采用1.3.6 節(jié)確定的快速反應(yīng)程序進(jìn)行熒光法和顯色法ERA 反應(yīng)，分析兩種ERA 快速可視化方法的檢測(cè)靈敏度。以無(wú)菌ddH2O 為空白對(duì)照，做3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.3.9 ERA 可視化快速檢測(cè)法對(duì)人工污染樣品的檢出限分析 以雞肉為基質(zhì)，按GB 4789.4-2016[24]方法制備人工污染沙門(mén)氏菌的樣品。向均質(zhì)液中添加1 mL 濃度為103，102，101，100CFU/mL 的腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 培養(yǎng)液，37 ℃增菌培養(yǎng)0，2，4 h 后，按1.3.7 節(jié)步驟提取DNA。分析人工污染樣品的檢出限。以無(wú)菌ddH2O 為空白對(duì)照，做3次重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ERA 熒光法的建立

2.1.1 ERA 熒光法檢測(cè)引物探針的篩選結(jié)果 采用表2 中3 組引物探針（編號(hào)1#、2#和4#）進(jìn)行ERA 擴(kuò)增效果分析，發(fā)現(xiàn)1#引物探針不僅能同時(shí)擴(kuò)增5 種沙門(mén)氏菌，而且擴(kuò)增效率比2#和4#的效果好（圖1a～1c）。為進(jìn)一步分析該引物探針組合在ERA 熒光法反應(yīng)體系中的特異性，以腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)食品中常見(jiàn)的食源性致病菌，如枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等12 種陰性對(duì)照菌，使用1#引物探針進(jìn)行ERA 特異性分析。結(jié)果顯示，1#引物探針僅能特異性擴(kuò)增腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等12 種非沙門(mén)氏菌的食源性致病菌均未擴(kuò)增（圖1d），表明該引物探針在ERA 反應(yīng)體系中對(duì)沙門(mén)氏菌特異，可用于ERA 熒光法快速檢測(cè)體系的建立。

圖1 沙門(mén)氏菌引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Results of Salmonella primer probe screening

2.1.2 ERA 熒光法快速反應(yīng)程序的建立 為縮短檢測(cè)時(shí)間，以腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 為模板，依托便攜式迷你qPCR 儀，對(duì)ERA 熒光法的檢測(cè)程序進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增結(jié)果顯示，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)設(shè)為40 時(shí)，ERA 結(jié)果的重復(fù)性最好，擴(kuò)增效率最高，此時(shí)檢測(cè)時(shí)間為17 min（圖2a）。隨著反應(yīng)時(shí)間的縮短，ERA 結(jié)果重復(fù)性雖有所降低，但起峰時(shí)間和熒光值變化不大，擴(kuò)增效率仍較好（圖2b～2d）。當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)降到20 時(shí)，反應(yīng)時(shí)間雖僅需9 min，但擴(kuò)增曲線(xiàn)的重復(fù)性較差，熒光值也降低較多（圖2e），說(shuō)明該程序?qū)U(kuò)增效果有影響。從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，在保證檢測(cè)效率的情況下，ERA 熒光法快速反應(yīng)程序設(shè)定為：39 ℃反應(yīng)1 s；39 ℃反應(yīng)14 s，25 個(gè)循環(huán)。此時(shí)，檢測(cè)時(shí)間僅需11 min。

圖2 ERA 熒光法快速反應(yīng)程序優(yōu)化Fig.2 Optimization of rapid reaction procedure for ERA fluorescence method

2.1.3 ERA 熒光法檢測(cè)的靈敏度分析 分析建立的ERA 熒光法對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度，分別以DNA 質(zhì)量濃度為102，101，100，10-1，10-2ng/μL的腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 為模板，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)DNA 質(zhì)量濃度為10-2ng/μL 時(shí)仍被檢出，擴(kuò)增效果良好。最終確定本研究建立的ERA 熒光法檢測(cè)沙門(mén)氏菌的最低靈敏度為10-2ng/μL。

圖3 建立的ERA 熒光法的靈敏度分析結(jié)果Fig.3 Sensitivity analysis results of fluorescent ERA reaction

2.2 ERA 顯色法的建立

2.2.1 基礎(chǔ)型ERA 引物篩選 采用表2 中4 組沙門(mén)氏菌PRA 引物進(jìn)行ERA 反應(yīng)，擴(kuò)增效果如圖4a 所示。1F1R 和3F3R 的擴(kuò)增效果較好。對(duì)這兩組引物的特異性以及對(duì)5 種沙門(mén)氏菌的覆蓋性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：1F1R 對(duì)5 種鼠傷寒沙門(mén)氏菌的擴(kuò)增效果較好，且其它12 種非沙門(mén)氏菌的食源性致病菌均無(wú)擴(kuò)增。引物3F3R 雖也對(duì)沙門(mén)氏菌特異，但對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028 的擴(kuò)增效果較差（圖4b）。后續(xù)試驗(yàn)以1F1R 為沙門(mén)氏菌基礎(chǔ)型ERA 檢測(cè)的引物。

圖4 沙門(mén)氏菌基礎(chǔ)型ERA 引物篩選Fig.4 Primers screening of basic ERA method for Salmonella

2.2.2 顯色劑的篩選 對(duì)基礎(chǔ)型ERA 檢測(cè)結(jié)果的傳統(tǒng)分析需采用電泳檢測(cè)和凝膠呈像。為滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求，本研究欲建立一種現(xiàn)場(chǎng)顯色法以取代電泳法。常見(jiàn)的顯色劑包括：中性紅、羥基萘酚藍(lán)、苯酚紅、鈣黃綠素和1000×SYBR Green I等。本試驗(yàn)比較基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)后采用上述顯色劑的檢測(cè)效果，結(jié)果如圖5a 所示。添加中性紅、苯酚紅酸堿指示劑，以及羥基萘酚藍(lán)、鈣黃綠素離子檢測(cè)劑時(shí)無(wú)法區(qū)分陽(yáng)性樣品和空白對(duì)照。若加入核酸染料SYBR Green I，則陽(yáng)性樣品呈綠色，空白對(duì)照顯橙色，兩者形成明顯對(duì)照，并可通過(guò)肉眼觀察結(jié)果。后續(xù)選擇1000×SYBR Green I 作為基礎(chǔ)型ERA 反應(yīng)的顯色劑。

為分析顯色劑添加量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的區(qū)分效果，對(duì)1000×SYBR Green I 的添加量進(jìn)行分析。分別向ERA 反應(yīng)后的產(chǎn)物中添加1，1.5，2.5，2.5，3.5 μL 的1000×SYBR Green I，顛倒混勻后觀察顏色變化，結(jié)果如圖5b 所示。可以看出，當(dāng)添加量為1～2.5 μL 時(shí)，均能區(qū)分陽(yáng)性結(jié)果與空白對(duì)照，其中添加量為2 μL 時(shí)，區(qū)分效果最明顯。而當(dāng)添加量增到3 μL 時(shí)，陽(yáng)性樣品與空白的顏色差距不大，基本呈現(xiàn)1000×SYBR Green I 染料的顏色，無(wú)法區(qū)分二者。最終確定后續(xù)ERA 顯色法試驗(yàn)1000×SYBR Green I 的添加量為2 μL/25 mL 反應(yīng)產(chǎn)物。

2.2.3 ERA 顯色法快速檢測(cè)反應(yīng)程序優(yōu)化 為縮短ERA 顯色法檢測(cè)的時(shí)間，以腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 為模板，對(duì)基礎(chǔ)型ERA 的擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，分別用電泳法和顯色法觀察結(jié)果。如圖6所示，擴(kuò)增時(shí)間從原始擴(kuò)增程序的15 min 降到4 min 的過(guò)程中均可明顯區(qū)分陽(yáng)性結(jié)果與空白對(duì)照，即ERA 顯色法只需4 min 即可進(jìn)行結(jié)果分析。從節(jié)約時(shí)間的角度，在滿(mǎn)足檢測(cè)要求的情況下，后續(xù)基礎(chǔ)型快速檢測(cè)的反應(yīng)程序設(shè)定為：39 ℃等溫?cái)U(kuò)增4 min。

圖6 ERA 顯色法反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Reaction time optimization results of ERA chromogenic method

2.2.4 不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法的建立 無(wú)論是采用煮沸法提取致病菌的DNA，還是ERA 檢測(cè)都需要加熱設(shè)備，如水浴鍋、PCR 儀或等溫?cái)U(kuò)增儀等。為擺脫現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)對(duì)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備的依賴(lài)，以自熱盒取代水浴鍋，提供DNA 提取所需溫度環(huán)境。結(jié)果顯示：自熱盒1 min 30 s 開(kāi)始出現(xiàn)氣泡（84 ℃，圖7a 左），20 min 內(nèi)保持80～84 ℃。提取的DNA 質(zhì)量濃度（285.44±2.13）ng/μL 與傳統(tǒng)煮沸法（315.65 ± 10.99）ng/μL 差異不大，純度平均值幾乎相同，可滿(mǎn)足后續(xù)ERA 反應(yīng)的要求。然后，使用熱帖代替PCR 儀或等溫?cái)U(kuò)增儀，以提供現(xiàn)場(chǎng)ERA 反應(yīng)所需溫度。撕開(kāi)熱帖包裝5 min 后溫度可達(dá)37 ℃（圖7a 右），即ERA 反應(yīng)要求的溫度下限；20 min 后可達(dá)42 ℃，即ERA 反應(yīng)的上限溫度。采用此法進(jìn)行ERA 快速檢測(cè)，顯色結(jié)果如圖7b 所示，陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)明顯的綠色，而空白為橙色，區(qū)分效果良好。電泳結(jié)果也顯示良好的擴(kuò)增條帶，證實(shí)建立的不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法可行。

圖7 不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of ERA chromogenic method without instruments

2.2.5 不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法靈敏度分析 為分析上述建立的不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法的檢測(cè)靈敏度，分別以模板質(zhì)量濃度為102，101，100，10-1，10-2ng/μL 的腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖8。當(dāng)模板質(zhì)量濃度低至10-2ng/μL 時(shí)顯色仍為綠色，與空白對(duì)照區(qū)分明顯，對(duì)應(yīng)的電泳結(jié)果有清晰的目的條帶。最終確定建立的不依賴(lài)儀器的ERA 顯色法對(duì)沙門(mén)氏菌的檢測(cè)靈敏度低至10-2ng/μL。

圖8 ERA 顯色法靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Sensitivity for Salmonella of ERA chromogenic method

2.3 人工污染試驗(yàn)

對(duì)人工污染腸炎沙門(mén)氏菌ATCC10708 的污染量分別為103，102，101，100的樣品增菌0～4 h，并提取DNA，分析建立的2 種ERA 可視化快速檢測(cè)方法的實(shí)際檢出限。結(jié)果顯示：前增菌2 h，兩種方法最低可檢出濃度為100 CFU/mL 的沙門(mén)氏菌，前增菌4 h 最低可檢出1 CFU/mL 的沙門(mén)氏菌（表3）。圖9 顯示增菌4 h 的檢測(cè)結(jié)果。隨著污染量的降低，熒光法的擴(kuò)增效率逐漸降低（圖9a）。顯色法結(jié)果顯示試驗(yàn)組均有綠色熒光，與空白對(duì)照差別明顯，對(duì)應(yīng)的電泳條帶亮度逐漸下降。最終確定本研究建立的兩種ERA 可視化快速檢測(cè)方法前增菌4 h 的檢出限均為1 CFU/mL。

表3 人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Test results of artificially contaminated samples

3 討論

在我國(guó)，每年都有因食源性致病菌導(dǎo)致的中毒事件發(fā)生。目前，食源性致病菌的檢測(cè)主要采用GB 4789 規(guī)定的培養(yǎng)法，檢測(cè)周期4～6 d，時(shí)間長(zhǎng)、流程復(fù)雜且需經(jīng)驗(yàn)豐富的檢測(cè)人員。面對(duì)當(dāng)今生鮮農(nóng)產(chǎn)品快速流通的現(xiàn)狀，這種耗時(shí)較長(zhǎng)的檢測(cè)手段無(wú)法滿(mǎn)足市場(chǎng)快速篩查的需求。近年，已報(bào)道許多食源性致病菌快速檢測(cè)方法。例如，魏瑩等[25]根據(jù)CepA 基因設(shè)計(jì)了針對(duì)A 族乙型溶血性鏈球菌的RPA 引物和探針，在39 ℃恒溫下，20 min 內(nèi)可檢 出10 copies/μL 的 目的基 因。Yang等[26]綜述LAMP 在沙門(mén)氏菌檢測(cè)方面的研究進(jìn)展，并分析其在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用前景。陳佳平等[27]通過(guò)rfbE 基因設(shè)計(jì)RPA 引物及探針，能夠快速、準(zhǔn)確區(qū)分大腸桿菌O157 血清型與非O157 血清型的菌株。Jiang 等[28]針對(duì)副溶血弧菌設(shè)計(jì)RPA 引物探針，將其應(yīng)用到生蠔中副溶血弧菌的檢測(cè)，針對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)靈敏度達(dá)2 CFU/g。劉立兵等[29]基于RPA 技術(shù)建立了一種產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測(cè)方法，僅需3～13 min 即可檢出人工污染樣品中的陽(yáng)性樣品，檢出限為1×102CFU/mL。王妙姝等[30]建立了一種通過(guò)可視化單引物等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)發(fā)酵乳制品中沙門(mén)氏菌的方法，對(duì)純培養(yǎng)物的檢出限為3.2×101CFU/mL。

ERA 技術(shù)誕生時(shí)間較晚，目前研究主要集中在病毒和臨床疾病檢測(cè)等方面，在食源性致病菌快速檢測(cè)方面缺乏報(bào)道。本研究創(chuàng)新性地將文獻(xiàn)報(bào)道的RPA 引物探針應(yīng)用至ERA 檢測(cè)體系，首次建立沙門(mén)氏菌ERA 可視化快速檢測(cè)方法，為食源性病原菌的快速檢測(cè)提供了新思路和新方法。研究過(guò)程中，首先依托國(guó)產(chǎn)便攜式迷你qPCR 儀建立ERA 熒光法，檢測(cè)時(shí)間僅需11 min。該儀器僅A4 紙大小，可攜帶至現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，且具有無(wú)運(yùn)動(dòng)光學(xué)部件，移動(dòng)運(yùn)輸無(wú)需校準(zhǔn)維護(hù)。目前已集成一個(gè)從DNA 提取到ERA 可視化快速檢測(cè)為一體的便攜式快速檢測(cè)箱，可為口岸、野外等應(yīng)用場(chǎng)景的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供良好的技術(shù)裝備。其次，篩選基礎(chǔ)型ERA 檢測(cè)的顯色劑，建立ERA 顯色法，并且創(chuàng)新性地使用自熱包和熱帖進(jìn)行DNA 提取和ERA 反應(yīng)，集成了不依賴(lài)儀器的現(xiàn)場(chǎng)可視化快速檢測(cè)裝備，從而擺脫了對(duì)傳統(tǒng)設(shè)備如水浴鍋、PCR儀、等溫?cái)U(kuò)增儀等的依賴(lài)，不僅降低了檢測(cè)成本，而且自熱包的升溫速度更快，能夠顯著縮短DNA提取所需時(shí)間，從DNA 提取到可視化檢測(cè)整個(gè)流程僅需10 min 左右。本研究建立的沙門(mén)氏菌ERA可視化快速檢測(cè)方法特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉、不依賴(lài)設(shè)備，十分適合在現(xiàn)場(chǎng)和基層檢測(cè)中應(yīng)用推廣，可為我國(guó)食品安全監(jiān)管和口岸食品查驗(yàn)提供技術(shù)支持。采用的ERA 檢測(cè)試劑和集成的便攜式現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)裝備均為我國(guó)自主研發(fā)，對(duì)打破國(guó)外試劑裝備壟斷，突破國(guó)外“卡脖子”技術(shù)具有重要的意義。