肉桂醛熏蒸對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)生物大分子的影響

段雪娟，黃煜強(qiáng)，張 潼，韓雅莉，吳克剛*，黃庶識(shí)

（1 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院 廣州510006 2 廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院 廣州510006 3 廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南寧 530007）

金黃色葡萄球菌是一種常見的食源性致病菌[1]，在自然界廣泛分布，它不僅引起食品污染，還對(duì)人類健康造成威脅，是人畜共患病原微生物[2-3]。在中國，細(xì)菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占較大比例[4]，因此殺滅金黃色葡萄球菌這一類致病菌成為防控食品中毒和空氣致病菌的重要途徑。

我國肉桂資源豐富，傳統(tǒng)上作為抗菌防腐材料使用，其中主要是肉桂精油起作用。而肉桂醛是肉桂精油的主要成分[5]，具有獨(dú)特的肉桂香味和風(fēng)味，它也是一種廣譜抗菌劑，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌等均有很好的抑制作用[6-8]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）中將肉桂醛批準(zhǔn)為可在食品中使用的天然防腐劑[9]。美國食品藥品管理局也將肉桂醛認(rèn)定為一種安全的添加劑[6]。將肉桂醛用于食品和空氣中來抑制、殺滅金黃色葡萄球菌，對(duì)食品等行業(yè)具有重要意義。

大多數(shù)抗菌研究是關(guān)于接觸抑菌[10]。有研究證實(shí)[11]與接觸抑菌相比，精油的氣相抗菌效果更強(qiáng)。在相對(duì)較低的濃度下，氣相精油可以抑制常見的致病菌，從而對(duì)食品的感官特性[10]及環(huán)境影響最小，還可以節(jié)約成本。對(duì)于抑菌機(jī)理的研究大多是對(duì)菌落群體抑菌機(jī)理的研究，很少針對(duì)單個(gè)菌體進(jìn)行研究。激光鑷子拉曼光譜（Laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS）技術(shù)是一種將激光捕獲和共聚焦拉曼光譜結(jié)合在一起，同時(shí)實(shí)現(xiàn)在懸浮液中對(duì)單細(xì)胞的捕獲和拉曼測(cè)量的技術(shù)[12]。LTRS 技術(shù)最早于2002 年由黎永青教授用于生命科學(xué)的研究[13]，目前它的應(yīng)用主要集中在紅細(xì)胞[14]、酵母細(xì)胞[15-16]、癌細(xì)胞[17]，以及產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化[18]等方面研究，而LTRS 應(yīng)用于精油抑菌機(jī)理的研究幾乎沒有。

本文用肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行氣相抗菌研究，用透射電鏡觀測(cè)單個(gè)菌體形態(tài)變化，對(duì)菌體進(jìn)行激光鑷子拉曼光譜檢測(cè)，研究肉桂醛處理后菌體內(nèi)生物大分子的動(dòng)態(tài)變化。研究結(jié)果是基于單個(gè)細(xì)菌分子的平均數(shù)據(jù)，而非細(xì)菌群體數(shù)據(jù)。本研究同時(shí)為精油的抗菌機(jī)理提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌ATCC 6538（Staphylococcus aureus），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；肉桂醛，廣州日化化工有限公司；Percoll 母液，Sigma 公司；Tris緩沖溶液，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50G 立式壓力蒸汽高壓滅菌機(jī)，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)，蘇州智凈精華設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)（帶角式轉(zhuǎn)頭），德國Hettich 科學(xué)儀器有限公司；激光鑷子拉曼光譜系統(tǒng)，如文獻(xiàn)[19]所述，由半導(dǎo)體激光器（SACHER，775～790 nm，500 mW）、倒置生物顯微鏡（TE2000U，Nikon）、拉曼光譜儀（SpectraPro2300i，Acton）、電荷耦 合器件（Spec-10，Princeton Instruments）、干涉陷波濾波器、攝照像機(jī)系統(tǒng)、臺(tái)式電腦、系列透鏡及監(jiān)視顯示器組成。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化與等滲液制備 取金黃色葡萄球菌接種于固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，劃線培養(yǎng)使得單個(gè)菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上分離，挑取單個(gè)菌落配制成0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU/mL）的菌懸液。

Percoll 母液與1.5 mol/L 無菌NaCl 溶液按9∶1（體積比）配制成Percoll 等滲貯備液，備用。

1.3.2 肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的氣相熏蒸處理

將50 μL 金黃色葡萄球菌菌懸液加入冷卻凝固的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻，然后將培養(yǎng)基放入37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h，此時(shí)，平板長滿菌落，吸取0.40 mL 不同濃度的肉桂醛（1，2-丙二醇稀釋）滴加到培養(yǎng)皿的皿蓋中央，使肉桂醛在培養(yǎng)皿中達(dá)到不同的空間濃度，培養(yǎng)皿用封口膜密封，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)不同時(shí)間后，用Tris 緩沖溶液收集分離菌體并做后續(xù)檢測(cè)，空白對(duì)比用1，2-丙二醇代替肉桂醛。

1.3.3 肉桂醛氣相熏蒸金黃色葡萄球菌活性的測(cè)定 利用1.3.2 節(jié)方法并參考文獻(xiàn)[20]，通過平板涂布方法和菌塊測(cè)定肉桂醛氣相作用于金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）與最低殺菌濃度（Minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.4 肉桂醛氣相熏蒸金黃色葡萄球菌透射電鏡（TEM）試驗(yàn) 金黃色葡萄球菌經(jīng)過肉桂醛熏蒸后，參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行處理，利用TEM 對(duì)金黃色葡萄球菌的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.5 菌液收集與細(xì)胞分離 利用改良的Percoll連續(xù)密度梯度離心方法分離同步化金黃色葡萄球菌[16]，首先以Percoll 等貯備液為100%原液，在Percoll 等滲液中分別加入Tris 溶液（pH 7.5，50 mmol/L），配成90%，80%，70%，60%，50%，40%，30%，20%的系列梯度Percoll 溶液作為分離介質(zhì)，測(cè)試結(jié)果表明，在90%的Percoll 溶液中能夠得到金黃色葡萄球菌有效的分層細(xì)菌。吸取100 μL 收集的菌液緩慢平鋪到90%的Percoll 分離介質(zhì)上，400×g 下離心30 min。離心后Percoll 溶液分為上、下兩層，用注射器插入離心管下端，緩慢吸取Percoll 溶液的下層溶液至2 mL 離心管中，加入Tris溶液，20 ℃下12 000 r/min 離心3 min，倒掉上清液，保留沉淀，重新加入Tris 溶液混勻，重復(fù)上述離心洗滌過程3 次，最終加入Tris 溶液懸浮，并放4 ℃冰箱保存，作為同步化的待測(cè)菌體。

1.3.6 拉曼信號(hào)的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[16]的方法，打開激光拉曼系統(tǒng)，吸取一定樣品到載玻片上，并將樣品放入載物臺(tái)。拉曼光譜系統(tǒng)以15 mW 的激發(fā)功率和780 nm 的波長激發(fā)，激光經(jīng)過濾波后進(jìn)入顯微鏡，在100 倍物鏡下進(jìn)行拉曼光譜測(cè)量。在系統(tǒng)沒有抓取任何顆粒的狀態(tài)下，收集5 個(gè)背景光譜，并計(jì)算背景的平均光譜曲線。再移動(dòng)載物臺(tái)在樣品池內(nèi)抓取細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，每個(gè)細(xì)胞的掃描時(shí)間為60 s，每組收集30 個(gè)同步細(xì)胞的拉曼光譜，計(jì)算平均拉曼光譜，此時(shí)的光譜曲線減去背景平均光譜曲線即為該細(xì)胞的拉曼光譜曲線。

1.3.7 拉曼光譜圖的數(shù)據(jù)處理 用激光鑷子拉曼系統(tǒng)自帶軟件WinSpec32 將測(cè)量得到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為ASCII 數(shù)據(jù)并導(dǎo)出。用Matlab 自編程序和Raman Baseline 程序?qū)?shù)據(jù)基線進(jìn)行校正，將校正后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 2018 處理并繪制菌體平均光譜曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌氣相抗菌活性的研究

根據(jù)試驗(yàn)方法，平板長菌情況如表1 所示。

表1 肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的氣相抑制作用Table 1 Gas-phase inhibitory effect of cinnamaldehyde on S.aureus

由表1 可知，肉桂醛氣相熏蒸金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）為0.25 μL/mL。根據(jù)試驗(yàn)方法，采用菌塊轉(zhuǎn)移法得到肉桂醛濃度為0.25 μL/mL 對(duì)應(yīng)的菌塊菌斑為6.5 mm，而肉桂醛濃度為0.5 μL/mL 及以上濃度對(duì)應(yīng)的菌塊菌斑依然是6 mm，由此可知，肉桂醛氣相熏蒸金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度（MBC）為0.5 μL/mL。這與張赟彬等[21]的研究結(jié)果一致。

2.2 肉桂醛氣相熏蒸金黃色葡萄球菌透射電鏡（TEM）分析

由圖1 可知，圖1a 為未經(jīng)處理的金黃色葡萄球菌透鏡圖，圖中清晰可見未經(jīng)肉桂醛處理的菌體胞膜光滑，細(xì)胞飽滿，內(nèi)容物均勻致密。圖1b、1c 分別是經(jīng)過1MIC、2MBC 的肉桂醛熏蒸處理的金黃色葡萄球菌透射電鏡圖，圖中可見部分菌體胞膜皺縮，部分細(xì)胞內(nèi)容物不均勻。有文獻(xiàn)表明，肉桂醛是疏水性的，它可以透過細(xì)胞壁，從而破壞細(xì)胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)[21]。正如透射電鏡結(jié)果顯示，肉桂醛改變了細(xì)胞膜的平滑形態(tài)，使菌體發(fā)生皺縮，而細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的一點(diǎn)微小變化就可能引起生理代謝活動(dòng)的變化[22]，從而抑制細(xì)胞生長甚至導(dǎo)致死亡，這從形態(tài)學(xué)方面展示了肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌機(jī)理。

圖1 不同濃度肉桂醛熏蒸處理的金黃色葡萄球菌透射電鏡圖Fig.1 TEM microgragh of S.aureus treated with different concentration of cinnamaldehyde

2.3 不同濃度的肉桂醛氣相熏蒸對(duì)單個(gè)金黃色葡萄球菌菌體的影響

利用不同濃度的肉桂醛（空間濃度為0.25，0.5，1.0 μL/mL）處理金黃色葡萄球菌，處理時(shí)間為24 h，選擇拉曼位移為600～1 800 cm-1的數(shù)據(jù)，用Origin 繪制拉曼光譜圖并對(duì)峰進(jìn)行標(biāo)記，不同濃度肉桂醛處理與空白對(duì)照的金黃色葡萄球菌激光鑷子拉曼光譜如圖2 所示。

圖2 不同濃度肉桂醛熏蒸下的金黃色葡萄球菌平均拉曼光譜圖Fig.2 Average Raman spectra of S.aureus treated with different concentration of vapor phase cinnamaldehyde

圖2 中的空白曲線是經(jīng)過正常生長48 h 的金黃色葡萄球菌的拉曼光譜曲線，試驗(yàn)組分別是培養(yǎng)24 h 后再經(jīng)過不同空間濃度（0.25，0.5，1.0 μL/mL）肉桂醛熏蒸24 h 的金黃色葡萄球菌的拉曼光譜曲線。對(duì)圖中金黃色葡萄球菌的拉曼特征峰進(jìn)行歸屬[15，18，23-25]，如表2 所示。

表2 金黃色葡萄球菌主要拉曼光譜信號(hào)歸屬Table 2 Main Raman spectral signal assignment of S.aureus

2.3.1 金黃色葡萄球菌胞內(nèi)生物大分子的變化細(xì)胞內(nèi)每種生物大分子的不同基團(tuán)都可能產(chǎn)生拉曼散射，且拉曼散射強(qiáng)度與激發(fā)區(qū)域內(nèi)物質(zhì)分子的含量成正比[26]。由表2 可知，歸屬于蛋白質(zhì)的特征峰有：620，645，667，726，758，852，897，938，1 001，1 030，1 126，1 254，1 320，1 336，1 370，1 450，1611，1 657 cm-1。拉曼光譜中蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象主要由CC 骨架振動(dòng)、C-N 伸縮振動(dòng)以及C-H 變形和CH2彎曲振動(dòng)引起，側(cè)鏈構(gòu)象則是來自芳香族氨基酸殘基，例如色氨酸和酪氨酸的呼吸振動(dòng)、脯氨酸側(cè)鏈振動(dòng)以及C-S 的伸縮振動(dòng)，在眾多的特征峰中，1 001 cm-1是反映菌株細(xì)胞體內(nèi)生物大分子含量變化的重要參考，該特征峰由苯丙氨酸殘基產(chǎn)生，吸收強(qiáng)度高，易于辨認(rèn)，在800～1 200 cm-1并無類似特別突出的峰值，是判斷菌細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)變化的重要依據(jù)；歸屬于核酸的特征峰有：667，726，758，779，898，1 090，1 158，1 320，1 336，1524，1576 cm-1；歸屬于脂類的特征峰有：1 090，1 126，1 450 cm-1；歸屬于碳水化合物的特征峰有：852，898，1 090，1 126，1 370 cm-1。

圖2a 知，經(jīng)過24 h，0.25 μL/mL 的肉桂醛氣相熏蒸的金黃色葡萄球菌拉曼譜圖中，除了歸屬于蛋白質(zhì)和核酸的645，667，1 158，1 524 cm-1幾處峰強(qiáng)比空白組低，其余所有的特征峰峰強(qiáng)都比空白組高；圖2b 中，經(jīng)過0.5 μL/mL 的肉桂醛氣相熏蒸的菌體拉曼光譜，在852，1126，1 370，1 576 cm-1處的特征峰高于空白組，其余特征峰的峰強(qiáng)都低于空白組；圖2c 中，經(jīng)過1 μL/mL 的肉桂醛氣相熏蒸的菌體拉曼光譜，除了1 030，1 370 cm-1處特征峰強(qiáng)度比空白組高，其余特征峰的峰強(qiáng)都明顯低于空白組。由此可見，金黃色葡萄球菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類、核酸以及碳水化合物經(jīng)過不同濃度肉桂醛熏蒸后，幾種大分子含量變化趨勢(shì)大體一致。

有研究表明[27]，在存在亞致死濃度的精油或其它抗菌化合物時(shí)，微生物通過增加應(yīng)激反應(yīng)蛋白的表達(dá)來進(jìn)行反應(yīng)，以修復(fù)受損蛋白。由此推斷，低濃度的肉桂醛熏蒸金黃色葡萄球菌時(shí)，細(xì)菌的生長環(huán)境發(fā)生了改變，胞內(nèi)大分子隨著生長環(huán)境的變化而變化，蛋白等大分子含量升高是細(xì)菌對(duì)生長環(huán)境做出的應(yīng)激反應(yīng)。而當(dāng)精油或其它天然抗菌劑的濃度較高時(shí)，這種反應(yīng)無法防止細(xì)胞死亡。隨著肉桂醛熏蒸濃度的增加，金黃色葡萄球菌在最低殺菌濃度（0.5 μL/mL）處理下，生長和代謝活動(dòng)都受到了肉桂醛的影響，胞內(nèi)大分子的正常生理活動(dòng)被抑制，細(xì)胞出現(xiàn)死亡，故所測(cè)得的大分子含量比正常培養(yǎng)情況下低。Zhang 等[28]研究表明，肉桂醛處理可能導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜裂解，使得胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，這可能也是拉曼圖譜測(cè)得幾種大分子含量明顯降低的原因。圖2c 中，肉桂醛熏蒸濃度越高（1.0 μL/mL），菌體的拉曼峰強(qiáng)度越低，說明對(duì)應(yīng)的生物大分子含量更低，揭示了高濃度的肉桂醛氣熏使得胞內(nèi)物質(zhì)流失越多，可能由于細(xì)胞膜損傷更嚴(yán)重。

2.3.2 金黃色葡萄球菌胞內(nèi)生物大分子特征拉曼光譜分析 由圖2 和表2 可知，歸屬于色氨酸的吲哚環(huán)在1 370 cm-1處的譜線在肉桂醛處理前、后均呈現(xiàn)出小而尖銳的峰形，說明色氨酸殘基是“埋藏”的，經(jīng)過肉桂醛處理后，菌體拉曼譜線強(qiáng)度均比空白要高，說明色氨酸經(jīng)處理后更趨于“埋藏”態(tài)。酪氨酸的對(duì)羥基苯基環(huán)的呼吸振動(dòng)和環(huán)平面外彎曲振動(dòng)的倍頻之間的費(fèi)米共振引起的850 cm-1和830 cm-1的雙峰是構(gòu)象靈敏的譜線，隨側(cè)鏈微環(huán)境而變[23]。由圖2 可明顯觀察到肉桂醛處理前、后強(qiáng)度比I850/830的比值≥1 時(shí)，說明酪氨酸是“暴露”的，經(jīng)過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，肉桂醛殺菌濃度以上處理后，I850/830的比值比空白要低，說明菌體被肉桂醛殺滅時(shí)酪氨酸更趨于“埋藏”態(tài)。研究表明[29-30]，拉曼峰1 450 cm-1處強(qiáng)度降低與脂肪族氨基酸暴露有關(guān)，由圖2 可知，在肉桂醛殺菌濃度以上處理后，1 450 cm-1的峰強(qiáng)低于空白，表明肉桂醛處理后更趨于“暴露”態(tài)。上述結(jié)果表明經(jīng)肉桂醛處理后，氨基酸殘基可能參與了分子間或分子內(nèi)的相互作用，使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使部分菌體蛋白質(zhì)變性。其余歸屬于菌體蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象的拉曼光譜強(qiáng)度均有不同程度的改變，也說明經(jīng)過肉桂醛熏蒸后的菌體蛋白主鏈、氫鍵體系以及空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

歸屬于菌體DNA 磷酸離子PO2-對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜線1 090 cm-1是構(gòu)象不靈敏的譜線，可以作為內(nèi)標(biāo)使用[31]，經(jīng)過肉桂醛殺菌以上濃度熏蒸后，其強(qiáng)度下降并且位移到1 084 cm-1處，說明DNA 發(fā)生單、雙鏈的斷裂；屬于DNA 磷酸二酯PO2對(duì)稱伸縮振動(dòng)譜線779 cm-1是構(gòu)象靈敏的，經(jīng)過肉桂醛殺菌以上濃度熏蒸，其強(qiáng)度也有所下降，同樣表明了DNA 發(fā)生單、雙鏈的斷裂。歸屬于鳥嘌呤和腺嘌呤環(huán)的C=C，C=N 伸張振動(dòng)的譜線強(qiáng)度1 573 cm-1經(jīng)過肉桂醛熏蒸后位移到1 576 cm-1，并且在最低殺菌濃度熏蒸下，強(qiáng)度變化率為正值，可能是由于精油損害了垂直的堿基-堿基堆積相互作用的結(jié)果[23]。其余歸屬于核酸的拉曼譜線強(qiáng)度經(jīng)過肉桂醛殺菌以上濃度熏蒸后均有不同程度的下降，且隨濃度增加拉曼峰強(qiáng)度下降的更多，表明肉桂醛對(duì)大部分核酸的損傷程度因濃度增加而增大。

同樣也歸屬于碳水化合物C-O-C 糖苷鍵的譜線1 090 cm-1經(jīng)過肉桂醛殺菌以上濃度熏蒸后，強(qiáng)度下降并且發(fā)生位移，說明碳水化合物中的CO-C 糖苷鍵可能被修飾，其余歸屬于碳水化合物譜線的強(qiáng)度經(jīng)肉桂醛處理后，也有不同程度的變化，說明肉桂醛可引起單糖或多糖C-C 鍵，C-OC 糖苷鍵等的變化，從而對(duì)菌體的信息傳遞或代謝免疫造成影響[23]。

歸屬于類脂的CH2、CH3彎曲振動(dòng)在1 450 cm-1的譜線是構(gòu)象不靈敏的，當(dāng)肉桂醛抑菌濃度處理菌體時(shí)，1 450 cm-1處強(qiáng)度高于空白，說明脂?；湽羌馨l(fā)生了交聯(lián)，當(dāng)肉桂醛殺菌及以上濃度處理菌體時(shí)，1 450 cm-1處強(qiáng)度低于空白，說明脂?；湽羌馨l(fā)生了斷裂。1 126，1 090 cm-1歸屬于C-C 骨架全反式鍵振動(dòng)模式和扭曲旋轉(zhuǎn)，它們的強(qiáng)度比反映出脂雙層的縱向有序度[23]，代入公式（Strans=（I1126/I1090）/1.77）計(jì)算出縱向有序度參數(shù)Strans分別為0.332（空白），0.334（0.25 μL/mL），0.35（0.5 μL/mL），0.305（1 μL/mL），隨著肉桂醛處理濃度的增加，菌體脂雙層的有序度升高，流動(dòng)性降低，而當(dāng)肉桂醛濃度為2MBC 時(shí)，脂雙層有序度降低，膜流動(dòng)性升高。

2.4 金黃色葡萄球菌蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)特征拉曼光譜分析

對(duì)于蛋白質(zhì)的拉曼譜圖，其二級(jí)結(jié)構(gòu)的歸屬主要分為：1 645～1 660 cm-1是α-螺旋，1 680～1 690 cm-1是β-轉(zhuǎn)角，1 670～1 680 cm-1是β-折疊，1 660～1 670 cm-1是無規(guī)則卷曲[32]。將拉曼光譜經(jīng)過擬合后，根據(jù)不同位移對(duì)應(yīng)的面積區(qū)域，可以計(jì)算出蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，表3 是經(jīng)過肉桂醛熏蒸的金黃色葡萄球菌菌體蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

二級(jí)結(jié)構(gòu)是肽鏈主鏈骨架原子的相對(duì)空間位置，不涉及殘基側(cè)鏈，維系二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵主要是氫鍵[33]。由表3 可知，經(jīng)過0.25 μL/mL 肉桂醛熏蒸，金黃色葡萄球菌菌體蛋白中α-螺旋含量有一個(gè)明顯的升高，反映了在抑菌濃度下，經(jīng)過肉桂醛熏蒸后的金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)分子趨于致密[20]，之后，隨著熏蒸濃度的升高，α-螺旋含量降低；β-折疊經(jīng)肉桂醛熏蒸其含量均高于空白，β-轉(zhuǎn)角則隨著氣熏濃度升高，其含量有一個(gè)逐漸上升的變化趨勢(shì)，無規(guī)則卷曲經(jīng)肉桂醛熏蒸，其含量均低于空白。由此可知，經(jīng)過肉桂醛的熏蒸，金黃色葡萄球菌蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，氫鍵體系發(fā)生變化，分子主鏈的有序結(jié)構(gòu)改變，無規(guī)則卷曲減少，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變必然進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響蛋白質(zhì)的功能。

2.5 肉桂醛不同熏蒸時(shí)間對(duì)金黃色葡萄球菌胞內(nèi)生物大分子的影響

肉桂醛在空間濃度MIC（0.25 μL/mL）和MBC（0.50 μL/mL）下熏蒸金黃色葡萄球菌，每6 h 采集1 次拉曼信號(hào)，觀察其細(xì)胞體內(nèi)生物大分子的含量變化，分別繪制拉曼光譜曲線如圖3 所示。

圖3 金黃色葡萄球菌在不同濃度肉桂醛熏蒸下不同時(shí)間的平均拉曼光譜圖Fig.3 Average Raman spectra of S.aureus treated with different concentration of vapor phase cinnamaldehyde at different times

特征峰吸收強(qiáng)度越高，其代表的分子含量越高。從圖3 可以看出，隨著肉桂醛熏蒸時(shí)間的延長，金黃色葡萄球菌在兩種熏蒸濃度下，拉曼峰值均呈先升后降的趨勢(shì)，在肉桂醛熏蒸6 h 時(shí)，菌體的拉曼曲線峰值大部分比初始有所升高，推斷菌體受到肉桂醛熏蒸后，在6 h 左右發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，快速合成新陳代謝所需的各類物質(zhì)，導(dǎo)致幾種生物大分子含量增加。當(dāng)肉桂醛熏蒸時(shí)間達(dá)到12 h以上時(shí)，各拉曼峰值都出現(xiàn)了顯著降低，推測(cè)MBC 和MIC 下，肉桂醛對(duì)菌體的破壞已經(jīng)不能進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，菌體細(xì)胞膜受損，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)流出，從而使其含量降低。作用12 h 與18 h 的拉曼強(qiáng)度變化相對(duì)較小，由此推斷，熏蒸6～12 h 是肉桂醛氣相抑制或殺死細(xì)菌的關(guān)鍵作用時(shí)間段。

3 結(jié)論

關(guān)于肉桂醛抗菌機(jī)理的研究很多，米嘉琦等[34]認(rèn)為肉桂醛的抑制機(jī)理是通過影響細(xì)胞膜的通透性和完整性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。何學(xué)文等[35]的研究表明，肉桂醛抑制菌體蛋白質(zhì)代謝，破壞菌體正常形態(tài)，增加細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性。Rogiers等[36-38]的研究表明，肉桂醛能影響細(xì)菌細(xì)胞膜上脂肪酸的分布和連接，改變膜流動(dòng)性，抑制生物膜形成。這些研究大都是對(duì)肉桂醛的直接接觸抗菌機(jī)理的研究，很少涉及到氣相抗菌機(jī)理的研究，且大部分是針對(duì)微生物群體的研究。本文研究了肉桂醛的氣相抗菌機(jī)理，分離同步細(xì)胞，對(duì)研究的菌體進(jìn)行了統(tǒng)一，且通過激光鑷子拉曼捕獲的是單個(gè)菌體細(xì)胞的拉曼信號(hào)。

本文通過氣相熏蒸與菌塊轉(zhuǎn)移方法，研究了肉桂醛對(duì)金黃色葡萄球菌的氣相抗菌作用，通過TEM 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肉桂醛處理可導(dǎo)致菌體細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，通過拉曼光譜位移與峰強(qiáng)分析，肉桂醛氣相熏蒸可導(dǎo)致金黃色葡萄球菌菌體蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂類等大分子的含量與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，通過歸屬峰的分析可知，精油處理導(dǎo)致菌體蛋白主鏈、氫鍵體系以及空間結(jié)構(gòu)的變化，DNA發(fā)生單、雙鏈的斷裂，脂酰基鏈骨架發(fā)生斷裂或交聯(lián)，同時(shí)，菌體脂雙層的有序度也因精油的不同濃度處理而發(fā)生改變，從而影響膜的流動(dòng)性。結(jié)果表明，利用激光鑷子拉曼光譜研究精油的抗菌機(jī)理是可行的，可以從分子含量和結(jié)構(gòu)變化分析菌體的變化，從而得出可能的抗菌機(jī)理。