腫瘤浸潤淋巴細胞在三陰性乳腺癌新輔助化療預測價值中的研究進展*

韓佳雯 蘇婷婷 徐元兵 綜述 胡超華 審校

目前，隨著乳腺癌的發(fā)病率在全球范圍內不斷增加，已成為全世界女性癌癥死亡的主要相關因素之一[1]。其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均不表達的一種乳腺癌亞型，由于暫無明確的分子靶點治療，化療是其主要的治療方式[2]。TNBC是乳腺癌中極具侵襲性的一種類型，占浸潤性乳腺癌的10%～20%[3]，通常治療選擇有限且復發(fā)率高，較其他亞型乳腺癌預后差[4]。近年來，越來越多學者關注到腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）在腫瘤免疫抑制、遠處轉移、局部耐藥和靶向治療反應中的重要作用[5]。而腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs ）作為TME 的重要組成部分，尤其在HER-2 陽性和TNBC 中高度表達。有研究對國內360 例TNBC 患者的腫瘤樣本分析發(fā)現，TNBC進一步細分為管腔雄激素受體（luminal androgen receptor，LAR）為23%、免疫調節(jié)型（immunomodulatory，IM）為24%、基底樣免疫抑制型（basal-like immunosuppressed，BLIS）為39% 和間充質型（mesenchymal，MES）為15%4種不同的亞型[6]。該研究進一步提出將TNBC 進行“分型而治”，通過分析465 例原發(fā)性TNBC 發(fā)現TNBC 中IM 亞型的TILs 比例明顯高于其他亞型，預后較其他亞型更好，認為“分型而治”具有重要臨床意義。因TNBC 復發(fā)轉移的風險較高，且缺乏靶向治療的作用靶點，使TNBC 患者的治療方案相對局限，缺乏有效預測療效及預后的分子標志物。本文主要針對TILs 作為生物標志物，對TNBC 的新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）療效及預后的預測價值進行闡述。

1 腫瘤浸潤淋巴細胞

癌癥是一種基因組疾病，由于基因組的不穩(wěn)定性，許多點突變在腫瘤進展過程中積累,從而導致基因組和表觀遺傳學產生表型變異[7]，引起免疫系統(tǒng)識別產生非自身抗原并引發(fā)細胞免疫反應[8]。正常機體由于免疫監(jiān)視功能可以識別并清除 TME 中的異常增殖細胞，有助于調節(jié)腫瘤的進展[9]。TME 主要由腫瘤細胞、TILs，如巨噬細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞等，腫瘤相關基質細胞[腫瘤相關的成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）]、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）以及多種信號分子等相互作用共同構成[10]。有研究表明，TILs 可能影響TME 中的組成成分改變，進而促進或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[11]。2014 年，國際免疫腫瘤生物標記物工作組對TILs 定義/檢測方法及判讀標準進行了詳細描述，TILs 分類及作用在不同類型的癌癥類型中，各種細胞的組成部分和作用機制存在較大差異性（圖1）[12]。TME 可大致分為免疫微環(huán)境和非免疫微環(huán)境，以免疫微環(huán)境為主，其中的免疫微環(huán)境主要由TILs 構成，并根據其在TME 中分布位置的位置不同，將TILs 進一步分為間質腫瘤浸潤淋巴細胞（stromal tumor-infiltrating lymphocytes，sTILs）和瘤內腫瘤浸潤淋巴細胞（intratumoral tumor-infiltrating lymphocytes，iTILs）[13]。其中大部分TME 中TILs以sTILs 為主，大多數sTILs 分布于浸潤性腫瘤細胞附近，常被認為是真正的TILs。有研究表明，在乳腺癌TILs 檢測中，75% 以T 淋巴細胞為主，20% 為B淋巴細胞，5%左右為其他類型細胞[14]。有研究進一步表明，在不同分子亞型中TNBC 的腫瘤浸潤免疫細胞檢出比例較高[15]。

圖1 腫瘤浸潤淋巴細胞分類及作用[12]

目前，TILs 檢測方法主要通過病理檢查中標準的蘇木精和曙紅（haemotoxylin and eosin，H&E）染色或免疫組織化學法染色。近年來，細胞流式技術、組織芯片或組織微陣列技術（tissue microarray，TMA）、多重熒光免疫組織化學（multiplex immunohistochemistry，mlHC）及單細胞DNA 測序等技術均可用于TILs 的分類和計數。目前，常用免疫組織化學法或熒光染色法檢測腫瘤組織中的TILs，不僅易于重復檢測，而且價格低廉，被廣泛應用于臨床實踐中TILs[16]。在2016 年生物標記物工作組指南中，建議使用sTILs 的百分比來評估TILs 的表達水平，而不是對所有的TILs 進行評估[17]。TILs 評估主要集中于sTILs 與iTILs 有效的檢測，iTILs 檢測是目前研究的熱點之一。乳腺癌中iTILs 檢測的難點主要包括下述幾個方面：樣本取材難度大，乳腺癌組織通常表現為不規(guī)則、碎片化的形態(tài)，取材難度較大，需要高質量、完整的組織樣本才能得到可靠的iTILs 檢測結果。對于iTILs 檢測的評估標準尚未統(tǒng)一，包括可見度、計數方法、評估指標等均存在差異，導致iTILs 結果的可靠性和可比性有待進一步提高，目前大部分研究集中于便于檢測的sTILs。

2 TNBC 的NAC 新輔助化療的預測評估體系

由于TNBC 作為無特定的分子治療靶點的乳腺癌亞型，NAC 常為TNBC 標準治療，使腫瘤降期保乳、因并發(fā)癥不可手術患者在接受NAC 后可行手術治療，以及根據患者對化療藥物的敏感性對改變治療策略等起著重要作用。病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）是NAC 療效評估的常見有效方法。有研究通過Meta 分析表明，達到 pCR 的乳腺癌患者的生存結局顯著改善，且達到pCR 的患者比未達到pCR 患者的無事件生存期（event-free survival，EFS）和總體生存期（overall survival，OS）明顯延長。因而手術中達到pCR 通常被認為是長期生存的替代指標[18]。盡管如此，有研究表明，提高pCR 率并不一定能改善預后[19]，仍有少部分達到pCR 的患者發(fā)生遠處轉移[20]?；颊咭蛐蠳AC 2 個周期內的治療療效未知，對于化療藥物敏感性低的患者可以更改治療方案，從而避免無效治療產生的不良反應[21]。該研究還發(fā)現，若通過評估患者對NAC 療效不佳，對NAC 療效的早期評估預測可避免患者錯過最佳手術時期。因此，NAC 療效及預后的預測需要更全面的分析。

目前，臨床上對TNBC 新輔助療效的預測手段有多種手段，主要集中在影像學、分子病理學及組學等。影像學中常用的乳房超聲檢查、乳房數字乳腺X 光攝影（digital mammography，DM）/數字乳腺斷層合成（digital breast tomosynthesis，DBT）均具有一定的預測價值；集成正電子發(fā)射斷層掃描-計算機斷層掃描（positron emission tomography computed tomography，PET-CT），以及最新的混合集成正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）/磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描儀均具有一定的預測價值；其中MRI 通常在影像學評估中具有更加客觀準確的價值[22]。分子生物標記物主要集中于TILs 檢測、Ki-67 高表達、PD-L1 表達。組學主要集中于BRCA 基因、ITPKC 基因、DNA 甲基化、循環(huán)腫瘤DNA 的探索研究，每一種評估模式均具有相應的優(yōu)缺點。

3 TILs 在TNBC 的NAC 預測價值

近年來，關于TILs 作為TNBC 的NAC 療效預測的分子標記物開展了大量探索性研究。Denkert 等[23]首次報道了TILs 可作為乳腺癌NAC 反應的獨立預測因子，TILs 表達水平與新輔助治療pCR 率密切相關。TILs 高表達的乳腺癌患者，pCR 率維持在40%～42%。然而，該研究TILs 無表達的患者pCR率分別為3%～7%。結果表明，sTILs 表達水平與乳腺癌患者pCR 率密切相關。Ono 等[24]研究顯示，180例行NAC 乳腺癌患者同樣證實了TILs 的表達水平，在TNBC 對NAC 預后預測發(fā)揮重要作用，TNBC 達到pCR 的發(fā)生率（32%）較HER-2 陽性乳腺癌（21%）和HR 陽性/HER-2 陰性乳腺癌（7%）pCR 的發(fā)生率高于其他亞型乳腺癌。且在TNBC 患者中接受NAC 后，TILs 呈高表達水平的患者有近37% 達到pCR，而TILs 呈低表達水平的患者有近16% 達到pCR。Adams 等[25]通過對481 例TNBC 患者NAC 進行評估，發(fā)現大多數乳腺癌腫瘤組織中TILs 能正常表達，其中sTILs 表達水平與預后呈正相關。sTILs 作為連續(xù)變量與TNBC 的預后更好相關。該研究提示sTILs 表達水平每增加10%，腫瘤遠處復發(fā)風險降低18%（P=0.04），患者死亡風險降低19%（P=0.01）。

Denkert 等[26]對TNBC、HER-2 過表達型乳腺癌以及激素受體陽性乳腺癌的TILs 表達研究。在TNBC 患者中，260 例TILs 表達水平較低的患者中有80 例（31%）達到pCR，373 例TILs 患者中有117 例（31%）達到pCR，而TILs 表達水平較高的273 例患者中有136 例（50%）達到pCR。該研究結果表明，TILs表達水平高低與TNBC 患者NAC 的pCR 密切相關。Luen 等[27]探索了TNBC 行NAC 患者殘留病灶TILS 表達水平與殘留癌癥負擔（residual cancer burden，RCB）的關系，發(fā)現將NAC 后的RCB 的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3 類比率分別為11%、50%和39%。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ3 類的3 年無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）分別為86%（95%CI：76～98）、67%（95%CI：60～74）和26%（95%CI：20～34）。且RD TILs 水平與CD8+T 細胞密度之間呈正相關（P=0.41）。RD 中高表達水平的TILs 與RFS 顯著相關（HR=0.86，95%CI：0.79～0.92，P＜0.001）；高表達水平的TILs與較長 的OS 率（HR=0.87，95%CI ：0.80～0.94，P＜0.001）具有顯著性相關。Bai 等[28]進一步對TNBC 患者NAC 后殘留病灶進行TILs 細胞種類進行分類比較，指出高CD4+TILs 和高CD8+TILs與無病生存期（disease-free survival，DFS）具有顯著性相關。74例TNBC 患者在NAC 后24 例達到pCR，達到pCR率為32.4%。進一步的分析表明，CD4+/CD20+比值＞1 或CD8+/ CD20+比值＞1 是獨立預后因子，殘留腫瘤（residual tumor，RT）的TILs 亞型是NAC 后TNBC 患者生存的潛在預測生物標志物。Lee 等[29]通過比較基線腫瘤標本組織和NAC 手術后標本組織TILs 表達水平的差異性，在TNBC 接受NAC 后43例（41.3%）TILs 呈低表達低,而29 例（27.9%）呈TILs 水平高表達，而32 例（30.8%）未見明顯變化。進一步探討出TILs 表達水平連續(xù)性變化與患者的DFS相關。此外有研究證實，TNBC 患者腫瘤組織中sTILs 的表達水平與NAC 的療效及預后有關，sTILs高表達患者的治療效果和預后較低表達患者更好[30]。

4 TILs 對TNBC 的預后價值

研究表明，TILs 作為NAC 療效預測的有效生物標志物，其對TNBC 的預后值得關注。大型臨床試驗數據表明，TILs 可作為乳腺癌患者NAC 的預后預測生物標志物，尤其是在TNBC 乳腺癌中，TILs 水平升高與RFS 之間存在強線性關系[31]。TILs 可分為T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等，并以T 淋巴細胞為主[32]。在TILs 中T 細胞可根據其T 細胞受體（T cell receptor，TCR）亞基以及核心系標記CD8 和CD4進行大 致分類，T 細胞主 要可分 為TCRγδ+、TCRαβ+CD4-CD8-雙陰性T 細胞以及TCRαβ+CD4+CD8+雙陽性T 細胞（其中包含CD4highCD8low、CD4highCD8high、CD4medCD8high和CD4lowCD8high）[32]。該研究認為TCRαβCD4+CD8+T 細胞是包括腫瘤組織在內最豐富的T 細胞亞群。CD8+TCRαβT 細胞，簡稱為CD8+T 細胞，有較強的抗病毒和抗腫瘤功能，通常被稱為細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），CTLs 能夠產生高水平的抗腫瘤細胞因子和細胞毒性分子，如干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、穿孔素和顆粒酶等[33]。因此，通常認為CD8+CTL 表達量與癌癥的預后改善相關[34]。該研究顯示，外周組織駐留記憶（tissue-resident memory T cell，TRM）CTLs 在腫瘤免疫中的作用已成為熱點，在外周組織中的 TRM 細胞表達經典標記CD103，也稱為整合素αE，CD103 通常與整合素β7 復合，形成αEβ7 復合物，這種復合物與腫瘤細胞上表達的E-鈣黏蛋白相互作用。因此，CD103+CTL 與多種實體瘤的生存率提高相關，包括幾種婦科惡性腫瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素和幾種頭部腫瘤[35]。B 淋巴細胞在免疫治療中的存在與改善不同癌癥類型的預后有關，B 細胞的促腫瘤作用也已被廣泛應用[36]。有研究發(fā)現，伴隨CD20+B 細胞的CD8+TILs 對預后有利[37]。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，近年來中國的乳腺癌免疫治療從分子靶點、藥物研發(fā)到臨床試驗，均取得了突破性的進展。研究表明，TILs 中的細胞亞群具有促腫瘤和抗腫瘤的雙向作用，目前TILs 免疫治療在大多實體瘤中都取得了一定的療效[38]，值得進一步研究。然而，在不同研究中對于TILs 表達水平的差異性與預后的關系存在不同的結論。本文通過查閱近年來關于TILs 與乳腺癌相關文獻進行總結（表1）。提示上述研究結果的原因可能為：樣本取材難度（乳腺癌組織通常表現為不規(guī)則、碎片化的形態(tài)，取材難度較大，需要高質量、完整的組織樣本才能得到可靠的TILs 檢測結果）。TILs 評估標準不統(tǒng)一（對于TILs 檢測的評估標準目前尚未統(tǒng)一，包括可見度、計數方法、評估指標等均存在差異，導致TILs 結果的可靠性和可比性有待進一步提高）。專業(yè)技能要求高（TILs 的檢測需要有具備一定的解剖、病理、免疫學專業(yè)知識和技能的病理醫(yī)師來評估和計數，但目前缺乏一批專業(yè)、規(guī)范的人才隊伍，技能水平和經驗不足，也會影響到TILs 檢測結果的準確性）。檢測結果的批次差異（TILs 檢測通常需要多個批次測試，如不同實驗室、不同測試時間等，由于實驗環(huán)境的不同，不同批次檢測結果會存在波動，如不加以消除會影響到TILs 檢測的準確性）?？傊橄侔┲蠺ILs 檢測的難點較多。針對上述難點，需要進一步完善TILs 檢測方法，建立統(tǒng)一的評估標準，加大專業(yè)技術人才的培養(yǎng)和引進力度，以及進一步采取有效措施，以提高檢測結果的準確性和可靠性。

表1 TILs 與TNBC 的NAC 相關文獻匯總

5 結語與展望

綜上所述，TILs 在TNBC 中提供了重要獨立的預后信息，TILs 作為生物標記物可以對TNBC 的NAC 療效進行有效預測。其中，TILs 以表達CD4+、CD8+TILs 為主，且通常在TNBC 和HER-2 過表達型乳腺癌中呈現高表達；TILs 表達水平越高，對TNBC 患者NAC 療效及預后越好；以及TILs 的連續(xù)性變化可能對TNBC 患者NAC 療效及預后有影響。但有關TILs 病理評估的質控標準有待進一步探討和制訂。此外，臨床前瞻性和回顧性的多中心、大樣本量探討TILs 分型與乳腺癌各亞型的關系相關性研究，為乳腺癌患者的治療提供了更好的預測價值。

本文無影響其科學性與可信度的經濟利益沖突。