葉用文冠果總多酚提取工藝及抗氧化活性分析

蘇涇涵,王改萍*,劉玉華,戚 亞,彭大慶,李守科,曹福亮

(1.南京林業(yè)大學,南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037;2.江蘇農林職業(yè)技術學院,江蘇 句容 212400;3.江蘇鹽城林場,江蘇 鹽城 224057;4.山東沃奇農業(yè)開發(fā)有限公司,山東 濰坊 262106)

文冠果(Xanthocerassorbifolia)為無患子科文冠果屬落葉小喬木或灌木,是我國特有的油料樹種[1]。文冠果的根、莖、葉、花、果實均可入藥,能祛風濕,消腫止痛。文冠果葉富含生物活性物質,加工后可作為茶飲,具有降血脂、降膽固醇等功效[2]。目前,對文冠果的研究主要集中在文冠果果實及油料提取等方面[3-5],文冠果葉總多酚提取工藝的研究鮮見報道。

多酚是一類存在于植物體內具有特殊化學活性的次生代謝產物,具有很好的抗炎抑菌、抗氧化效果,常作為一種天然的抗氧化劑[6]。多酚常見的提取工藝有溶劑萃取法、超聲波法、微波法。超聲波法操作方便,相比傳統(tǒng)的溶劑萃取法縮短了提取時間,且提取效果優(yōu)于微波法,常應用于中藥及天然產物提取方面,具有提取效率高、活性保持良好等優(yōu)點[7-9]。

超聲輔助提取技術就是利用超聲波的機械作用、空化作用、熱效應等迅速破壞植物細胞,縮短原料中有效成分進入溶劑的時間[10],加快提取過程,提高提取效率,且不易破壞植物體中有效成分,避免其抗氧化等生物活性顯著下降[11-12]。目前,李國倩等[13]利用超聲波輔助法對文冠果果殼總多酚的含量及抗氧化活性進行了研究,但是對文冠果葉總多酚的提取研究鮮見報道。

本試驗用響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取文冠果葉總多酚,研究文冠果葉總多酚的最優(yōu)提取工藝。對15個不同來源地的文冠果葉總多酚含量及其抗氧化活性進行測定,探討不同來源地的文冠果葉總多酚及其抗氧化活性的差異,旨在為我國特有油料樹種文冠果的開發(fā)利用提供理論依據(jù),為后續(xù)葉用文冠果品種篩選工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于山東省安丘市文冠果種質資源圃,材料于2021年7月進行采集,包括15個不同來源地的成年文冠果,來源地分別為:甘肅張掖、遼寧建平、新疆昌吉、河南沁陽、陜西榆林、內蒙古赤峰、河北張家口、遼寧朝陽、內蒙古翁牛特旗、內蒙古巴彥淖爾、新疆喀什、寧夏銀川、安徽鳳臺、青海樂都、吉林白城。

每個不同來源的文冠果選擇3株,設3個重復,分別于東、西、南、北4個方向采集葉片,之后混勻。葉片置于裝有干冰的采樣盒帶回實驗室,將葉片清洗干凈,經(jīng)過60 ℃恒溫干燥箱烘干,粉碎后過60目(孔徑0.25 mm)篩備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品溶液制備

準確稱取0.2 g樣品,包于脫脂濾紙中,加入一定濃度的乙醇溶液,在不同的提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度的條件下進行提取,所得濾液即為待測液。

1.2.2 文冠果葉總多酚超聲波輔助提取

采用單因素試驗方法,以額定功率240 W、體積分數(shù)60%的乙醇溶液、料液比1∶20 g/mL、提取溫度60 ℃、提取時間30 min為固定水平,探究不同水平的單因素對文冠果葉總多酚提取量的影響,為后續(xù)響應面法優(yōu)化文冠果葉總多酚提取實驗確立合適的參數(shù)范圍。

每個單因素實驗設置6個水平,乙醇體積分數(shù)[14-15]分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%,提取溫度[14,16]為30、40、50、60、70、80 ℃,提取時間[17-18]為20、30、40、50、60、70 min,料液比[17,19]分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL。

1.2.3 Box-Behnken響應面法優(yōu)化文冠果葉總多酚提取實驗

依據(jù)單因素試驗結果,在額定功率下分別對乙醇體積分數(shù)(50%、60%、70%)、料液比(1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、提取時間(30、40、50 min)、提取溫度(50、60、70 ℃)4個因子進行3水平試驗設計,采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件的響應面分析法以總多酚提取量為響應值,進行響應面分析實驗(RSM),以獲取最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.4 文冠果葉總多酚含量的測定

參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》[20],并采用福林酚法[21]進行文冠果葉總多酚含量的測定。

1.2.5 文冠果葉體外抗氧化活性的測定與綜合分析

清除總多酚(DPPH)自由基能力參照陳克克等[22]的方法進行測定;總抗氧化能力(FRAP法)參照廖友媛[23]的方法進行測定;采用綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)[24-25]綜合評價不同來源文冠果葉總多酚的抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行分析處理并繪圖。

2 結果與分析

2.1 文冠果葉總多酚超聲波輔助提取

不同體積分數(shù)的乙醇對文冠果葉總多酚提取量有明顯影響(表1)。乙醇體積分數(shù)由40%上升到70%時,文冠果葉總多酚提取量隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增加;乙醇體積分數(shù)由70%上升到90%時,文冠果葉總多酚的提取量開始不斷減少。當乙醇體積分數(shù)為70%時,文冠果葉總多酚的提取量達到最高,為40.27 mg/g。

表1 不同單因素對文冠果葉總多酚提取量的影響

不同的料液比對文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。料液比由1∶10 g/mL變?yōu)?∶15 g/mL時,文冠果葉總多酚提取量增加;料液比由1∶15 g/mL變?yōu)?∶25 g/mL時,文冠果葉總多酚的提取量增長緩慢;料液比由1∶25 g/mL變?yōu)?∶30 g/mL時,文冠果葉總多酚的提取量明顯增加;當料液比由1∶30 g/mL變?yōu)?∶35 g/mL時,葉總多酚的提取量下降。總體看,當料液比為1∶30 g/mL時,文冠果葉總多酚的提取量達到最高,為42.86 mg/g。

不同提取時間對文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。提取時間由20 min增加到40 min,隨著提取時間的增加,文冠果葉總多酚提取量隨之增加;提取時間由40 min增加到50 min時,文冠果葉總多酚提取量開始減少,超過50 min時文冠果葉總多酚提取量又開始上升。

不同提取溫度對文冠果葉總多酚提取量有一定的影響(表1)。提取溫度由30 ℃增加到60 ℃時,總多酚的提取量顯著上升;提取溫度由60 ℃增加到70 ℃時,文冠果葉總多酚的提取量趨于平穩(wěn);由70 ℃增加到80 ℃時,文冠果葉總多酚提取量反而增加,可能是雜質導致含量增加。因此,當提取溫度達到60 ℃時,總多酚的提取量達到最高,為40.24 mg/g。

2.2 文冠果葉總多酚響應面法優(yōu)化提取

2.2.1 響應面模型建立

在單因素實驗的基礎上,利用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件的響應面分析法設計4因素3水平的文冠果葉總多酚提取優(yōu)化實驗,得到29組多酌提取量如表2所示。

表2 Box-Behnken響應面法設計及實驗結果

對表2數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸模型方程擬合,得到以乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)為影響因素的文冠果葉總多酚提取含量(c)回歸方程為:

c=39.348-1.28A+0.110 0B+1.003 3C+3.202 5D-0.117 5AB-0.502 5AC-1.102 5AD+0.345BC+0.322 5BD-0.142 5CD-1.776 5A2+0.834 8B2-0.497 8C2+0.566D2。

2.2.2 響應面回歸方程的方差分析與顯著性檢驗

表3 響應面優(yōu)化實驗設計

2.2.3 響應面分析及總多酚最優(yōu)工藝的確定

通過響應面及等高線的形狀和顏色變化(圖1),分析4個主要因素間的交互作用對總多酚提取量的影響后發(fā)現(xiàn),乙醇體積分數(shù)-提取溫度交互的響應面圖形曲面最大,顏色變化也最大,判斷乙醇體積分數(shù)和提取溫度之間的交互作用對文冠果葉總多酚提取量的影響最大。利用Design Expert中Box-Behnken對總多酚提取量進行最優(yōu)化設計,得到的最佳提取條件為:乙醇體積分數(shù)58.245%、料液比1∶29.794 g/mL、超聲波作用時間42.882 min、提取溫度69.601 ℃。為了便于實驗的操作,設定提取工藝參數(shù)為:乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶30 g/mL、提取時間43 min、提取溫度70 ℃。在此條件下,文冠果葉總多酚含量測定為43.66 mg/g,與理論值44.78 mg/g相差較小,因此可以設定此條件為文冠果葉總多酚最佳提取工藝。

圖1 乙醇體積分數(shù)-提取溫度交互作用效果圖Fig. 1 The interaction effect diagram of material liquid ratio-extraction time

2.3 不同來源文冠果葉總多酚含量及抗氧化能力比較

不同來源文冠果葉總多酚含量及抗氧化活性比較見圖2。由圖2a可知,15個不同來源地的文冠果葉總多酚平均含量為36.34 mg/g,其中銀川、建平、樂都、喀什來源地的文冠果葉總多酚含量較高;15個來源地中文冠果葉片總多酚含量最高的是銀川,含量為42.37 mg/g;朝陽與榆林文冠果葉總多酚含量均為35.92 mg/g,二者之間無差異,但均高于來自昌吉、青海、白城、張掖、鳳臺、張家口來源地的文冠果葉總多酚含量;張家口來源地的文冠果葉總多酚含量最低,僅為27.91 mg/g。

Gz.甘肅張掖 Zhangye, Gansu;Lj.遼寧建平 Jianping,Liaoning;Xc.新疆昌吉 Changji, Xinjiang;Hq.河南沁陽 Qinyang, Henan;Sy.陜西榆林 Yulin, Shaanxi;Ic.內蒙古赤峰 Chifeng, Inner Mongolia;Hz.河北張家口 Zhangjiakou, Hebei;Lc.遼寧朝陽 Chaoyang, Liaoning;Iw.內蒙古翁牛特旗 Wengniute Banner, Inner Mongolia; Ib.內蒙古巴彥淖爾 Bayan Zhuoer, Inner Mongolia;Xk.新疆喀什 Kashgar, Xinjiang;Ny.寧夏銀川 Yinchuan, Ningxia;Af.安徽鳳臺 Fengtai, Anhui;Ql.青海樂都 Ledu,Qinghai;Jb.吉林白城Baicheng, Jilin。下同。The same below.圖2 15個不同來源地的文冠果葉總多酚含量及其抗氧化活性比較Fig. 2 A comparison of total polyphenol content and antioxidant activity of X. sorbifolia leaves from 15 different sources

不同來源文冠果葉總多酚對DPPH自由基的清除率差異較大(圖2b),15個來源地的文冠果葉總多酚對DPPH自由基清除率的范圍為64.33%～92.65%。其中銀川來源地樣品的DPPH自由基清除率最高為92.65%,張家口來源地樣品的DPPH自由基清除率最低為64.33%,銀川、樂都、朝陽來源的文冠果葉總多酚清除DPPH自由基的能力較強。

不同來源地文冠果葉總多酚的總抗氧化能力見圖2c。結果表明FRAP不同來源地文冠果葉總多酚對總抗氧化差異較大,15個來源地的文冠果葉總多酚的FRAP總抗氧化能力在0.71～1.53 mol/g。其中來自樂都、銀川、巴彥淖爾、朝陽來源地的FRAP總抗氧化能力較強,樂都來源的樣品FRAP總抗氧化能力最強為1.53 mol/g;張掖的樣品FRAP總抗氧化能力最弱為0.71 mol/g。

綜上所述, 銀川、樂都來源地的文冠果葉片總多酚含量較高且抗氧化能力較強。

2.4 文冠果葉片總多酚抗氧化能力綜合評價

不同來源文冠果葉總多酚抗氧化能力指數(shù)見表4。由表4知,樂都、銀川、朝陽來源的文冠果葉總多酚綜合抗氧化能力指數(shù)(APC)較高,張掖、張家口、昌吉來源的文冠果葉總多酚綜合抗氧化能力指數(shù)APC較低;樂都的APC指數(shù)最高,為99.73%;昌吉的APC指數(shù)最低,僅為62.82%。

表4 15個不同來源文冠果葉片總多酚抗氧化能力指數(shù)

2.5 文冠果葉總多酚與抗氧化活性的關系

不同來源文冠果葉總多酚抗氧化能力相關性見表5。由表5可知,不同來源的文冠果葉片總多酚含量與DPPH清除能力、總抗氧化能力均呈極顯著(P<0.01)正相關。

表5 不同來源文冠果葉總多酚含量與抗氧化活性 的相關性分析

3 討 論

隨著乙醇體積分數(shù)的升高,文冠果葉總多酚提取量在不斷上升,但當乙醇體積分數(shù)大于70%時總酚含量開始下降,造成此現(xiàn)象的原因可能是文冠果葉多酚類物質與其他物質形成穩(wěn)定化合物,存在一定極性[26],當乙醇體積分數(shù)過高時,溶劑的極性減弱,導致溶出的其他物質與多酚類物質競爭[27-29],使得多酚提取率下降。料液比由1∶10 g/mL變?yōu)?∶30 g/mL時,隨著乙醇提取劑含量的增加,增大了反應面積[30],促進文冠果葉多酚類物質的提取,但當料液比由1∶30 g/mL變?yōu)?∶35 g/mL時,文冠果葉總多酚的含量反而減少,可能由于文冠果葉多酚類物質已經(jīng)溶出[31],過多的乙醇提取劑導致單位體積內多酚含量變小,降低了文冠果葉總多酚的提取量[32]。

提取時間由40 min變?yōu)?0 min時,文冠果葉總多酚提取量開始減少,當提取時間繼續(xù)增長,出現(xiàn)文冠果葉總多酚含量再次增長的現(xiàn)象,造成此結果的原因可能是由于過長的超聲時間會使機械力和熱能破壞總多酚類物質分解生成其他雜質[33-34];因此選擇40 min作為單因素試驗最適提取時間。前期隨著溫度升高,促進分子運動,使得提取劑與物料接觸增多,多酚溶出增加[35];當提取溫度大于70 ℃時,文冠果葉總多酚提取量不斷上升,造成此現(xiàn)象的原因可能是提取溫度過高時多酚結構被破壞,生成部分雜質[26,36]。

超聲波輔助法有利于植物多酚的提取,此方法節(jié)約時間、便于操作,因此選擇此方法探究文冠果葉總多酚的最佳提取工藝[37]。前期對文冠果葉片單因素實驗進行測定,得到最適提取工藝,并探究了不同體積分數(shù)的乙醇、料液比、提取時間、提取溫度[38-41]對總多酚提取率的影響,最適工藝條件為:乙醇體積分數(shù)70%、料液比1∶30 g/mL、提取時間40 min、提取溫度60 ℃。后期為了可以更直觀地反映各因素間的交互作用,得到更可靠的預測值,通過Box-Behnken響應面法[42]對文冠果葉總多酚提取率進行優(yōu)化設計,得到最優(yōu)提取條件為:乙醇體積分數(shù)60%、料液比1∶30 g/mL、超聲波作用時間43 min、提取溫度70 ℃。在此優(yōu)化條件下,文冠果葉片總多酚提取量為43.66 mg/g。

目前,對文冠果總多酚含量的研究較少,李媛等[43]研究發(fā)現(xiàn)文冠果果殼總多酚含量為10.22 mg/g。本研究發(fā)現(xiàn)不同來源的文冠果葉片總多酚平均含量為36.34 mg/g,文冠果葉片的多酚含量遠高于文冠果果殼總多酚含量。此外,對于總多酚的研究主要集中在中草藥、茶葉及水果方面。陳克克等[22]研究表明北蒼術的總多酚含量為11.9 mg/g;馬飛躍等[44]研究表明桑葚葉總多酚含量為26.35 mg/g;薛雯等[45]發(fā)現(xiàn)葡萄葉總多酚含量為36.594 mg/g;李曉英等[46]發(fā)現(xiàn)藍莓嫩葉的總多酚含量為43.77 mg/g,老葉總多酚含量為38.76 mg/g。綜上所述文冠果葉片總多酚含量較高,可作為一種新型植物多酚提取樹種。

本研究結果顯示文冠果葉片總多酚含量與DPPH清除力、總抗氧化能力呈極顯著正相關,即表現(xiàn)為,文冠果葉總多酚含量越高,其DPPH清除力、總抗氧化能力也整體呈上升趨勢。這一結論與馬飛躍等[44]對不同品種桑葉總酚含量及抗氧化活性的研究結果,以及林寶妹等[47]不同品種嘉寶葉總多酚抗氧化活性的研究結果一致。

15個不同來源地的文冠果葉總多酚平均含量為36.34 mg/g, 其中銀川的文冠果葉總多酚含量最高,為42.37 mg/g。銀川的DPPH自由基清除率最高,為92.65%;樂都的總抗氧化能力最強,為1.53 mol/g。

綜上所述,15個來源地的文冠果葉總多酚含量較高,抗氧化能力較強,文冠果可以作為一種新型總多酚提取植物。