降香黃檀根瘤以及根瘤菌形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)特征

鄧家珍,葉紹明,林銘業(yè),藍(lán)雅惠,燕 羽,樊容源,潘彩玲

(廣西大學(xué)林學(xué)院,廣西森林生態(tài)與保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530004)

豆科植物的根與根瘤菌(rhizobia)共生是常見的一種生物固氮(biological nitrogen fixation,BNF)方式,在環(huán)境保護(hù)、全球氮循環(huán)和農(nóng)林生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要作用[1]。根瘤菌能夠?qū)⒋髿庵械牡D(zhuǎn)化為豆科植物可利用的氨,而豆科植物則為根瘤菌提供生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]。豆科植物與根瘤菌形成的互惠共生關(guān)系導(dǎo)致了根瘤(root nodule)的形成。根瘤是重要的共生固氮場(chǎng)所,不僅能促進(jìn)宿主和共生體之間的代謝物交換,還能將固氮產(chǎn)物輸送給植物的地上部。根瘤的特殊結(jié)構(gòu)和生理環(huán)境,不但保護(hù)了固氮酶而且提供了合適的固氮條件[3-4]。目前,關(guān)于豆科植物根瘤的結(jié)構(gòu)已有大量研究,尤其關(guān)注根瘤的形成發(fā)育過程和固氮生理[5-7]。已有學(xué)者從超微水平研究豆科植物根瘤的結(jié)構(gòu),對(duì)根瘤侵染細(xì)胞的特征、侵入線的結(jié)構(gòu)以及多磷酸鹽積累的特征等展開研究[8-10],但多集中于草本豆科植物,如豌豆(Pisumsativum)、田菁(Sesbaniacannabina)、大豆(Glycinemax)等[11-13],關(guān)于木本豆科植物研究較少,特別是對(duì)木本豆科植物根瘤形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)特征的研究尚鮮見報(bào)道,研究木本豆科植物根瘤的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)特征對(duì)揭示豆科植物與根瘤菌共生關(guān)系具有重要意義。

降香黃檀(Dalbergiaodorifera)是蝶形花科黃檀屬(Dalbergia)常綠喬木,國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物,其木材珍貴且經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[14]。降香黃檀根系發(fā)達(dá)能形成根瘤,可起到改良土壤、減少氮肥使用的作用,具有良好的生態(tài)效益。目前已有學(xué)者對(duì)降香黃檀的心邊材成分、藥理作用、葉的活性成分、栽培技術(shù)和資源分布調(diào)查等[15-18]進(jìn)行了研究,但鮮有關(guān)注降香黃檀與根瘤菌的共生固氮關(guān)系,尤其是降香黃檀用來進(jìn)行固氮作用的器官——根瘤。僅發(fā)現(xiàn)譚小明等[19]對(duì)降香黃檀根瘤進(jìn)行過解剖學(xué)研究,而關(guān)于其超微結(jié)構(gòu)方面目前暫鮮見相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本研究以降香黃檀根瘤為材料,制作石蠟切片、超薄切片和掃描電鏡樣品,利用光學(xué)顯微鏡(optical microscope,OM)、透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)研究降香黃檀根瘤和瘤內(nèi)根瘤菌的形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu),以期在細(xì)胞學(xué)水平上更深層次厘清降香黃檀根瘤及根瘤菌的特征,為探究降香黃檀與根瘤菌的共生固氮機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況和根瘤樣品采集

采樣地位于廣西大學(xué)林學(xué)院苗圃實(shí)習(xí)基地(108°17′14″E,22°51′20″N),于2021年1月在基地塑料大棚內(nèi)種植降香黃檀。供試苗木為1年生降香黃檀(幼苗無根瘤),每盆種植2株,盆口徑40 cm、高45 cm。供試土壤取自良鳳江國(guó)家公園,清除石粒及雜質(zhì)后混入珍珠巖以保持透水性,泥土與珍珠巖的體積比為25∶1,經(jīng)過滅菌處理后待用。待植株服盆(14 d)后,每15 d給幼苗根部澆灌根瘤菌菌液100 mL直至結(jié)瘤,根瘤菌菌株為費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobiumfredii),購(gòu)自廣東省微生物菌種保存中心。采用酵母甘露醇瓊脂固體培養(yǎng)基(yeast mannitol agar,YMA)培養(yǎng)活化保存的根瘤菌菌株,菌株活化后,接入YMA液體培養(yǎng)基中,28 ℃下?lián)u床培養(yǎng)5～6 d,用分光光度計(jì)檢測(cè)菌液吸光度OD600(OD600表示根瘤菌培養(yǎng)液在600 nm處的光吸收值)值達(dá)0.7時(shí)即可澆灌。該接菌結(jié)瘤試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)設(shè)置10盆,共60盆,120株苗。接菌后每隔5 d在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1盆觀察幼苗根系結(jié)瘤情況。本研究以肉眼觀察或借用放大鏡輔助觀察能見根瘤的當(dāng)天作為計(jì)算瘤齡的第0天,之后在第1、3、5、7、10、20、60天時(shí)采集根瘤。每次采樣于6個(gè)重復(fù)內(nèi)隨機(jī)選取4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)采集1盆,共收獲4盆,8株幼苗。

采集根瘤時(shí),將植株基部的枯枝落葉和0～5 cm的表層土清除,然后收集土層中降香黃檀幼苗根系的全部根瘤,并放入裝有冰袋的泡沫盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。將樣品用蒸餾水沖洗干凈,吸走表面水分后,使用放大鏡觀察降香黃檀根瘤的外部形態(tài)特征,記錄根瘤形態(tài)、顏色等指標(biāo)。使用游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測(cè)量根瘤的長(zhǎng)徑。將取下的根瘤按照50%、25%、25%的數(shù)量比例分別用于石蠟切片的制備以及掃描電鏡樣品的制備、超薄顯微切片的制備、豆血紅蛋白含量測(cè)定。

1.2 降香黃檀石蠟切片、超薄切片及掃描電鏡樣品制作

石蠟切片制樣[20]。根瘤于酒精醋酸福爾馬林混合固定液(FAA)中固定24 h,采用乙醇梯度濃度(體積分?jǐn)?shù))30%(2 h)、50%(2 h)、70%(2 h)、90%(2 h)、100%(1 h,重復(fù)1次)進(jìn)行脫水,利用TO型生物制片透明劑進(jìn)行透明,浸蠟包埋(熔點(diǎn)58～60 ℃),切片機(jī)(LEICA SM 2010 R)切片(厚度為8 μm),展片,將完全晾干的載玻片浸入TO透明劑中脫蠟30 min,重復(fù)2次。之后每隔30 min分別浸入1/3 100%乙醇+2/3 TO透明劑、1/2 100%乙醇+1/2 TO透明劑、2/3 100%乙醇+1/3 TO透明劑、100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、純水浸泡,進(jìn)行樣品組織的復(fù)水。采用番紅-固綠染色法進(jìn)行染色,中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡(LEICA ICC50 W)下觀察降香黃檀根瘤組織結(jié)構(gòu)。

超薄切片制樣參照Wang等[21]的方法并做相應(yīng)改良:將根瘤切成大小1 mm(長(zhǎng))×1 mm(寬)×3 mm(高),浸入2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛溶液4 ℃固定過夜后用pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品,1%(體積分?jǐn)?shù))鋨酸溶液固定樣品,取出鋨酸廢液后用pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗,乙醇梯度脫水,純丙酮處理20 min,再用包埋劑與丙酮的混合液(體積比為1∶1)處理樣品1 h,后用包埋劑與丙酮的混合液(體積比為3∶1)處理樣品3 h,將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋,70 ℃加熱過夜,即得到包埋好的樣品。樣品在超薄切片機(jī)(LEICA EM UC 7)中切片,厚度為70～90 nm,切片經(jīng)檸檬酸鉛染液和醋酸雙氧軸染液各染色5 min后晾干即可上透射電鏡(JEM 1200 EX)觀察。

掃描電鏡樣品制備[22]。根瘤在FAA固定液中固定24 h后取出,用pH為7.0的磷酸緩沖液每隔15 min沖洗1次,共沖洗3次。將沖洗過的樣品每隔10 min依次浸入50%、70%、80%、90%、100%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇中進(jìn)行脫水。將脫水后的樣品自然風(fēng)干。將風(fēng)干后的樣品分別粘臺(tái)、編號(hào),離子濺射儀(Cressington sputter coater 408,英國(guó))噴金,放置于場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(FEI Quattros)載物臺(tái)后觀察、拍照。每個(gè)樣品的拍攝視角不少于15個(gè)。

1.3 降香黃檀不同時(shí)期根瘤豆血紅蛋白含量測(cè)定

利用牛血紅蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品,稱取1 mg粉末溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 6.8)中配置成1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)母液。使用移液槍分別吸取1、2、3、4、5和6 mL母液至10 mL容量瓶中后用上述磷酸緩沖液定容,獲得濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mol/L的溶液。使用紫外分光光度計(jì)(Ultrospec 2100 pro)在540 nm處測(cè)定吸光值,繪制以牛血紅蛋白濃度為橫坐標(biāo),以O(shè)D540值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根瘤凍存于-80 ℃超低溫冰箱,分別取出瘤齡為1、3～5、7～10、11～20、21～60 d的根瘤于液氮中研磨成粉末,準(zhǔn)確稱取0.2 g粉末樣品,加入8 mL的低溫(4 ℃)PBS。懸濁液在4 ℃、1 000 r/min下離心15 min,吸取上清液繼續(xù)在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min。以磷酸緩沖液為空白對(duì)照,在540 nm處測(cè)定上清液吸光值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算豆血紅蛋白含量[23]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,使用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)對(duì)豆血紅蛋白含量數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析,顯著性水平設(shè)置為α=0.05。其中,單因素方差分析在R 4.1.1中調(diào)用“agricolae”和“tidyverse”包完成[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降香黃檀不同時(shí)期的根瘤形態(tài)及豆血紅蛋白含量變化

連續(xù)觀察降香黃檀根部的變化發(fā)現(xiàn),幼苗澆菌后的第20～25天開始顯瘤,隨發(fā)育進(jìn)行,根瘤的形狀由圓形逐漸分化為橢圓形、杠鈴形及不規(guī)則橢圓形等,顏色由黃白色向黃褐色轉(zhuǎn)變,著生部位由側(cè)根和基部逐漸向主根擴(kuò)散(圖1、表1)。

表1 不同時(shí)期降香黃檀根瘤形態(tài)及豆血紅蛋白含量

a—g．分別為瘤齡1、3、5、7、10、20、60 d時(shí)的根瘤形態(tài)。These are morphology of root nodules of 1,3,5,7,10,20 and 60 d respectively. h．根瘤解剖the anatomy of root nodules。 圖1 不同時(shí)期的降香黃檀根瘤形態(tài)Fig. 1 The root nodules morphology of Dalbergia odorifera in different stages

隨著根瘤變大,其中心部分由鮮明的橙紅色逐漸變淡直至灰白且伴隨凹陷(圖1h)。此外,豆血紅蛋白(leghemoglobin)含量呈先升后降的趨勢(shì),并在瘤齡為3～5 d的根瘤(長(zhǎng)徑為1～2 mm)中達(dá)到最高(表1)。

2.2 降香黃檀根瘤組織學(xué)特點(diǎn)

通過連續(xù)石蠟切片顯微觀察發(fā)現(xiàn)(圖2),降香黃檀根瘤從外到內(nèi)由周皮、皮層、內(nèi)皮層、維管束和侵染組織構(gòu)成。侵染區(qū)域幾乎由侵染細(xì)胞填滿,不同侵染細(xì)胞區(qū)域間隔2至多層薄壁細(xì)胞。侵染細(xì)胞周圍薄壁細(xì)胞的細(xì)胞核較皮層細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)達(dá),且能明顯看到胞內(nèi)物質(zhì)增多(圖2a)。在皮層與內(nèi)皮層之間分布著多個(gè)維管束,其切片面積、形狀和排列方向各不相同。維管束內(nèi)有環(huán)紋導(dǎo)管以端壁首尾相連,組成連通的長(zhǎng)管道,外有1層厚壁細(xì)胞環(huán)繞(經(jīng)番紅-固綠染色后細(xì)胞壁顏色加深)。維管束內(nèi)的細(xì)胞體積較周圍薄壁細(xì)胞小,但細(xì)胞核明顯(圖2b)。

IC.侵染細(xì)胞 infected cell;NC.根瘤皮層 nodule cortex;NE.根瘤內(nèi)皮層 nodule endodermis;NP.根瘤周皮 nodule periderm;PC.薄壁細(xì)胞 parenchymatous cell;RV.環(huán)紋導(dǎo)管 ringed vessel;SC.厚壁細(xì)胞 sclerenchymatous cell;UC.非侵染細(xì)胞 un-infected cell;VB.維管束 vascular bundle。圖2 降香黃檀根瘤組織結(jié)構(gòu)Fig.2 The histological structure of D. odorifera root nodules

2.3 降香黃檀根瘤的超微結(jié)構(gòu)

觀察發(fā)現(xiàn),降香黃檀根瘤的侵染細(xì)胞與非侵染細(xì)胞在組成上存在明顯差別(圖3a),侵染細(xì)胞區(qū)域存在少量非侵染細(xì)胞(圖3b)。非侵染細(xì)胞高度液泡化,細(xì)胞器被擠壓至細(xì)胞壁周圍,細(xì)胞壁厚薄不均,淀粉粒和一些質(zhì)體圍繞細(xì)胞核存在。液泡內(nèi)含有少量游離的纖維狀或顆粒狀物質(zhì)(圖3c、3d黑色箭頭所示),可能是被液泡里的水解酶降解形成。兩個(gè)鄰近非侵染細(xì)胞的細(xì)胞壁存在胞間連絲(圖3 c白色箭頭所示)。侵染細(xì)胞內(nèi)無中央液泡,細(xì)胞被形狀不一的泡囊填滿且泡囊都擁有膜結(jié)構(gòu),膜內(nèi)包被著1至多個(gè)根瘤菌類菌體。泡囊膜的生成活動(dòng)劇烈,數(shù)量不等的小泡貼附于泡囊膜外側(cè)(圖3e、3l)。在部分侵染細(xì)胞內(nèi),泡囊膜處于分離破碎的狀態(tài),根瘤菌被釋放至細(xì)胞質(zhì)中成為獨(dú)立的個(gè)體,這可能預(yù)示細(xì)胞的凋亡(圖3f、3k)。侵染細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞膜系統(tǒng)組裝活動(dòng)有關(guān),可明顯看到侵染細(xì)胞的核仁、核膜及染色質(zhì)(圖3g);有的侵染細(xì)胞的細(xì)胞核則顯示出核凸起,可能與核內(nèi)多輪DNA復(fù)制相關(guān)[25](圖3h)。侵染細(xì)胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器由于根瘤菌數(shù)量的增加被擠到細(xì)胞壁邊緣(圖3i、3j、3k)。

B.類菌體 bacteroid;CW.細(xì)胞壁cell wall;ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng) endoplasmic reticulum;IC.侵染細(xì)胞 infected cell;IS.細(xì)胞間隙 intercellular space;M.線粒體 mitochondria;N.細(xì)胞核 nucleus;NE.核膜 nucleus envelope;NU.核仁 nucleolus;P.質(zhì)體 plastid;PBM.泡囊膜 peribacteroid membrane;S.淀粉粒 starch grain;UC.非侵染細(xì)胞 un-infected cell;V.液泡 vacuole。圖3 降香黃檀根瘤超微結(jié)構(gòu)Fig. 3 Ultrastructure of D. odorifera root nodules

2.4 降香黃檀根瘤內(nèi)根瘤菌的超微觀察

通過透射電鏡觀察可見,降香黃檀根瘤細(xì)胞內(nèi)類菌體附近出現(xiàn)一些絮狀的膜物質(zhì)(圖4a箭頭所示),可能是由膜小泡聚集融合形成。發(fā)現(xiàn)泡囊膜解體現(xiàn)象,由于膜的破裂,膜碎片及一些顆粒物質(zhì)存在于細(xì)胞質(zhì)中(圖4b)。根瘤菌侵入根瘤細(xì)胞后會(huì)分化成類菌體,降香黃檀根瘤侵染細(xì)胞內(nèi)含大量長(zhǎng)短不一,粗細(xì)不均的根瘤菌類菌體,其形狀多樣,有桿形、梨形、“Y”形、啞鈴形等(圖4d、4e、4f),并具有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜(圖4c)。類菌體不具備完整的細(xì)胞核,而是擁有一個(gè)相當(dāng)于細(xì)胞核的擬核區(qū),在擬核區(qū)的附近存在明顯的黑色圓形小顆粒(圖4b、4c、4d箭頭所示),此黑色顆粒為多磷酸鹽(polyphosphate,PP)顆粒。除了多磷酸鹽顆粒外,根瘤菌類菌體內(nèi)還存在大量電子密度大的白色斑點(diǎn),為聚-β-羥基丁酸鹽(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)顆粒。

B.類菌體 bacteroid;CW.細(xì)胞壁 cell wall;PBM.泡囊膜 peribacteroid membrane;PP.多磷酸鹽顆粒 polyphosphate particle;PHB.聚-β-羥基丁酸鹽顆粒 poly-β-hydroxybutyrate。圖4 降香黃檀根瘤內(nèi)根瘤菌的超微觀察Fig. 4 Ultraobservation of rhizobium in D. odorifera root nodules

2.5 降香黃檀根瘤掃描電鏡超微觀察

與透射電鏡相比,場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡呈現(xiàn)的圖像為立體三維圖,能更直觀和清晰地了解降香黃檀根瘤內(nèi)外樣貌。從觀察到的視野來看,降香黃檀根瘤表面凹凸不平,褶皺多,周皮呈破碎狀(圖5a)。非侵染區(qū)域和侵染區(qū)域分區(qū)明顯,非侵染細(xì)胞與侵染細(xì)胞最大的區(qū)別是前者不含根瘤菌。非侵染細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)呈現(xiàn)顆?；蛘邎F(tuán)狀,分布不均,可見圓球狀的淀粉粒(圖5b、5c);侵染細(xì)胞飽滿膨大,內(nèi)含大量長(zhǎng)桿狀根瘤菌類菌體交織纏繞,細(xì)胞壁與胞間隙明顯。多個(gè)泡囊膜貼合在一起呈現(xiàn)連續(xù)狀(圖5c箭頭所示),把類菌體包圍堆疊起來形成緊密的膜系統(tǒng)(圖5d)。掃描電鏡觀察到的類菌體形態(tài)多為長(zhǎng)桿狀,少見圓球形的類菌體。每個(gè)侵染細(xì)胞所含的類菌體數(shù)量不一,剛被侵染的細(xì)胞根瘤菌數(shù)量稀少,隨著根瘤菌的分裂,類菌體的數(shù)量不斷增加直至充滿整個(gè)細(xì)胞(圖5e、5f)。

B.類菌體 bacteroid;CW.細(xì)胞壁 cell wall;IC.侵染細(xì)胞 infected cell;PBM.泡囊膜 peribacteroid membrane;RN.根瘤root nodule;UC.非侵染細(xì)胞 un-infected cell。圖5 降香黃檀根瘤的掃描電鏡觀察Fig. 5 Observation of D. odorifera root nodules by scanning electron microscope

3 討 論

豆科植物的根瘤可分為無限型根瘤(indeterminate nodule)和有限型根瘤(determinate nodule)[26]。無限型根瘤產(chǎn)生根瘤原基皮層為內(nèi)皮層,其形狀通常不規(guī)則且保留頂端分生組織;有限型根瘤產(chǎn)生根瘤原基皮層為外皮層,形狀通常為圓形,但分生組織失去活性,只能有限生長(zhǎng)[27]。此外,無限型根瘤由頂端到底部可分為頂端分生組織區(qū)、侵染區(qū)、過渡區(qū)、固氮區(qū)、衰老區(qū)和胞內(nèi)腐生區(qū)幾個(gè)年齡梯度不同的部分[28]。本研究中,降香黃檀根瘤呈現(xiàn)圓形或橢圓形,不似刺槐(Robiniapseudoacacia)、銀合歡(Leucaenaleucocephala)等無限型根瘤出現(xiàn)多重分叉、形態(tài)多樣的現(xiàn)象,說明降香黃檀根瘤形成時(shí),根瘤分生組織的分裂活動(dòng)便停止,不再向四周分裂,只保持細(xì)胞的伸長(zhǎng)[29]。且根據(jù)石蠟切片觀察結(jié)果,降香黃檀根瘤的組織結(jié)構(gòu)并不具有無限型根瘤所表現(xiàn)的侵染年齡分區(qū)[30],因此降香黃檀根瘤屬于有限型根瘤,這與草本豆科植物大豆、落花生(Arachishypogaea)等根瘤類型相同[31]。豆血紅蛋白是根瘤高效固氮的衡量特征[23,32],本研究發(fā)現(xiàn)不同瘤齡的降香黃檀根瘤內(nèi)豆血紅蛋白含量差異顯著,這與Wang等[33]研究豆血紅蛋白基因Lb1/2/3在百脈根(Lotuscorniculatus)根瘤發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)情況一致,均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。由此可見,降香黃檀根瘤在不同生長(zhǎng)時(shí)期的固氮能力存在差異。

降香黃檀根瘤含有2～3個(gè)侵染區(qū)域,合理的解釋為在根瘤發(fā)育過程中,根瘤菌為擴(kuò)大侵染面積或響應(yīng)根瘤皮層細(xì)胞的分裂速度,侵染距離相近的外皮層薄壁細(xì)胞,形成新的侵染區(qū)域[34-35],進(jìn)而提高根瘤固氮作用面積,這是降香黃檀與根瘤菌共生固氮的特征。維管束連接著根瘤、根系和植物的其他部分,對(duì)根瘤進(jìn)行代謝具有重要作用[36]。降香黃檀根瘤的侵染區(qū)周圍分布著維管束,能夠給根瘤進(jìn)行固氮作用提供水分和無機(jī)鹽支持[37]。依據(jù)透射電鏡和場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡的觀察結(jié)果,降香黃檀根瘤非侵染細(xì)胞與侵染細(xì)胞的組成截然不同,說明根瘤菌的入侵改變了根部細(xì)胞原有的組成。值得注意的是,降香黃檀根瘤侵染細(xì)胞內(nèi)的液泡已不復(fù)存在,這與前人對(duì)沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、銀合歡等根瘤侵染細(xì)胞的觀察結(jié)果不一致[38-39],上述植物的根瘤侵染細(xì)胞都含大液泡,這可能暗示不同豆科植物根瘤侵染細(xì)胞維持胞內(nèi)環(huán)境平衡作用機(jī)理不一[40]。此外,降香黃檀根瘤的非侵染細(xì)胞之間存在胞間連絲,這與韓善華[41]觀察大豆根瘤非侵染細(xì)胞特征研究結(jié)果相似,說明降香黃檀根瘤的非侵染細(xì)胞之間存在信息交流現(xiàn)象,再次證實(shí)了非侵染細(xì)胞擁有物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ堋?/p>

根瘤菌進(jìn)入宿主根部的皮層細(xì)胞定殖后分化成具有強(qiáng)固氮活性的類菌體。類菌體利用宿主植物提供的蘋果酸或琥珀酸進(jìn)行代謝[42],維持自身生理生化反應(yīng)和固氮反應(yīng)供能,并與宿主植物進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[43-44]。降香黃檀根瘤內(nèi)存在大量的根瘤菌類菌體,說明瘤內(nèi)的固氮代謝活動(dòng)強(qiáng)烈,有助于根瘤固定空氣中的氮。多磷酸鹽(PP)顆粒在微生物體內(nèi)可以用來合成氨基酸、堿基、糖類、脂肪等生命必需物質(zhì)[45],聚-β-羥基丁酸(PHB)顆粒是一種存在于微生物細(xì)胞中并作為營(yíng)養(yǎng)和能量?jī)?chǔ)存物質(zhì)參與細(xì)胞代謝的天然產(chǎn)物[46]。降香黃檀根瘤菌類菌體內(nèi)同時(shí)含有PP和PHB顆粒,說明其類菌體的固氮活動(dòng)擁有良好的儲(chǔ)能條件作為支持。但這兩種顆粒的含量及分布在類菌體內(nèi)均不一致,導(dǎo)致差異的原因可能與類菌體的發(fā)育相關(guān),有關(guān)它們產(chǎn)生的時(shí)期和途徑還有待深入探討。

泡囊膜,又稱類菌體周膜,可以保護(hù)類菌體和寄主植物細(xì)胞,保證二者之間能進(jìn)行正常的物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝和信息傳遞[47]。根瘤菌從侵入線釋放到宿主細(xì)胞后,都以膜包裹的類菌體形式存在,否則將引起宿主細(xì)胞的防御反應(yīng)[48]。本研究中降香黃檀根瘤侵染細(xì)胞內(nèi)擁有多個(gè)泡囊,這與豌豆[11]、田菁[12]、肯氏相思(Acaciacunninghamia)[49]的根瘤情況類似。Bergerson等[50]最早在大豆根瘤發(fā)現(xiàn)類菌體被泡囊膜包圍,何一等[51]在白車軸草(Trifoliumrepens)根瘤內(nèi)發(fā)現(xiàn)相鄰細(xì)菌周膜融合的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn),降香黃檀根瘤侵染細(xì)胞內(nèi)存在泡囊膜的合成狀態(tài),其合成可能是以下過程:由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者質(zhì)膜合成膜小泡釋放至細(xì)胞質(zhì),而后膜小泡移動(dòng)至類菌體的附近融合成絮狀膜,最后通過融合反應(yīng)變成泡囊膜,包裹著根瘤菌類菌體。由于泡囊膜的面積大小直接影響侵染細(xì)胞與類菌體物質(zhì)交換的量,所以泡囊膜的合成和解離與固氮作用的強(qiáng)弱有一定聯(lián)系,這也是降香黃檀與根瘤菌互惠共生關(guān)系的重要表現(xiàn)。