• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接及分子動力學模擬探討黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制

    2023-12-04 09:07:44陳琴張志云朱云嬰婁龍李玲華張鳳瓊徐瑞鄧婷婷高爽
    現(xiàn)代藥物與臨床 2023年10期
    關(guān)鍵詞:小檗黃連潰瘍性

    陳琴,張志云,朱云嬰,婁龍,李玲華,張鳳瓊,徐瑞,鄧婷婷,高爽

    昆明市中醫(yī)醫(yī)院 肛腸科,云南 昆明 650011

    潰瘍性結(jié)腸炎是局限于結(jié)腸黏膜層的復發(fā)和緩解的慢性炎癥狀態(tài),發(fā)病機制包括遺傳和環(huán)境因素等[1]。臨床上,常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、糞便中帶有膿血等。該病病程長,易復發(fā)且難以治愈。該病的主要治療目的是在于控制急性發(fā)作、維持緩解以及防止病情復發(fā)等?,F(xiàn)有的西醫(yī)治療主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、微生物制劑以及生物制劑等,但諸如柳氮磺吡啶、5-氨基水楊酸、激素類制劑等部分西藥因存在肝腎損傷、價格較高、患者依從性等問題,使得臨床運用受限[2-3]。因此,尋找更安全有效的藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎至關(guān)重要。

    現(xiàn)代藥理研究表明,黃連具有很高的藥用價值,保護心腦血管、降糖、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[4]。黃連有效成分小檗堿通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、保護腸道屏障、調(diào)節(jié)腸道免疫和影響氧化應激來治療潰瘍性結(jié)腸炎[5-6]。盡管黃連及其有效成分治療潰瘍性結(jié)腸炎有效,但主要藥理機制尚未得到充分而全面的解釋。因此,在本研究中使用網(wǎng)絡(luò)藥理學[7]、分子對接和分子動力學模擬(MD)來識別黃連的主要有效成分和核心靶點,并進一步探索其治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機制。

    1 材料和方法

    1.1 黃連化學成分篩選及靶點預測

    在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索黃連的全部化學成分,以口服生物利用度(OB)≥30%,類藥性(DL)≥0.18 作為閾值,篩選活性較高的化學成分及其潛在靶點,通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫進行靶點信息比對和基因名校正。

    1.2 潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點篩選

    通過GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫,以“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞,搜索潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)靶點,合并5 個數(shù)據(jù)庫的所有靶點,去重后得到最終靶點。

    1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖及篩選關(guān)鍵靶點

    將黃連有效活性成分與潰瘍性結(jié)腸炎的交集靶點上傳至String 11.0 數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò),參數(shù)設(shè)置為:設(shè)定生物種類為“Homo sapiens”,最小互作閾值“highest confidence”>0.7,刪除游離節(jié)點。下載tsv 格式的文件導入CytoScape 3.9.0,利用Cyto Hubb 插件以MCC、Degree、MNC、EPC 4 種算法分別篩選在整個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中位于前10 位的Hub 基因。

    1.4 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

    通過Metascape 平臺,設(shè)置“H species”,P<0.01,分析交集靶點的GO 功能(生物過程、分子功能、細胞組成)和KEGG 信號通路富集結(jié)果。

    1.5 構(gòu)建藥物活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

    運用CytoScape 3.9.0 軟件構(gòu)建藥物活性成分-靶點-疾病-通路網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)其內(nèi)置工具(Network Analyzer)分析3 個主要的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù):連接度(degree)、介度(betweenness)、緊密度(closenesss)?;谝陨蠑?shù)據(jù)參數(shù),判斷復方中重要活性成分,藥物作用疾病的核心靶點,揭示相關(guān)通路調(diào)節(jié)機制。

    1.6 分子對接驗證

    從PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載小分子藥物的SDF文件,并將其轉(zhuǎn)換為mol2 文件,上傳到Autodock Tools 1.5.6[8]中進行查看電荷、判定配體的root、設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵等處理,保存為PDBQT 格式配體。在RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中對關(guān)鍵靶點進行蛋白構(gòu)象篩選,下載pdb 格式文件。在Autodock Tools 1.5.6 中,刪除所得蛋白結(jié)構(gòu)的水分子、原小分子配體等,確定活性口袋位置。采用AutoGrid 4 拉馬克遺傳算法(Genetic Alogorithm)[9]進行對接運算。整理分析對接結(jié)果,根據(jù)結(jié)合自由能把受體-配體對進行篩選排序,繪制矩陣熱圖。采用LigPlus 2.2.4 軟件繪制2D 圖,在Pymol 2.2.0 軟件中進行3D 可視化展示。

    1.7 分子動力學模擬

    MD 模擬采用Gromacs 2020.1 軟件[10],力場選擇charm36-mar2019。蛋白質(zhì)和分子復合物用TIP3P進行水解。采用最陡峭下降算法對其進行能量最小化(共5 000 步),之后在受約束的NVT 和NPT 中運行100 ps,使系統(tǒng)達到平衡狀態(tài)。NPT 在NVT 平衡的基礎(chǔ)上加以結(jié)合,穩(wěn)定系統(tǒng)的壓力。最后,對復合物進行200 ns 的MD 模擬,每10 ps 保存1 次軌跡。使用GROMACS 2020.1 計算均方根位移(RMSD)。利用gmx_mmpbsa 在線工具(https://github.com/Jerkwin/gmxtool/tree/master/gmx_mmpbsa),根據(jù)分子力學/泊松-波爾茲曼表面積(MM/PBSA)方法計算了蛋白質(zhì)和分子之間的復合結(jié)合自由能。

    2 結(jié)果

    2.1 黃連活性成分及靶點

    通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫,得到黃連活性化合物成分36 種,按閾值篩選,最終得到7 個生物活性成分,包括槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿、木蘭花堿等(表1)。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將7 個活性成分對應的靶點進行名稱校正,刪除無效值后共得到靶點137 個。

    表1 黃連的主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Coptis chinensis

    2.2 潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點的獲取

    通過GeneCards、OMIM、Drugbank、TTD、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫查找與潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)的靶點,將所有靶點合并后刪除重復值,最終獲得1 258個靶點。

    2.3 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及篩選關(guān)鍵靶點

    將藥物靶點與潰瘍性結(jié)腸炎靶點取交集后得到81 個靶點,并提交至String 11.0 網(wǎng)站,獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中共有81 個節(jié)點,590 條邊,平均degree為14.6。利用Cytoscape 3.9.0 Hubba 插件以MCC、degree、MNC、EPC 4 種算法篩選在整個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點中位于前10 位的Hub 基因(圖1)。

    圖1 4 種算法篩選Hub 基因的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of four algorithms for screening Hub genes

    2.4 GO 功能與KEGG 通路的富集分析

    應用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點進行分析,主要參與的生物學過程包括對無機物的反應、對細胞因子的反應等。分子功能主要富集于細胞因子受體結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細胞組成主要包括膜筏、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復合體等。共獲得164 條信號通路,排在前20 位的通路包括癌癥的通路、脂質(zhì)和動脈硬化、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、HIF-1 信號通路、MAPK 信號通路等,見圖2。

    2.5 構(gòu)建藥物活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

    通過CytoScape 3.9.0 對活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中各參數(shù)的degree、betweenness、closenesss進行分析(圖3),得出主要成分依次為槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿、木蘭花堿(表2)。排在前15 位的核心靶點為蛋白激酶B1(Akt1)、B 淋巴細胞 2(BCL2)、有絲分裂原活化蛋白激酶 1(MAPK1)、FOS、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、V-Rel 網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物A(RELA)、表皮生長因子受體(EGFR)、熱休克蛋白90α 家族A 類成員1(HSP90AA1)、一氧化氮合酶3(NOS3)、周期素依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)、白細胞介素-6(IL-6)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、腫瘤蛋白p53(TP53)、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)(表3)。

    圖3 藥物活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Drug active ingredient-target-pathway network diagram

    表2 黃連主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Table 2 Characteristic parameters of the network nodes of the main active ingredients of Coptis chinensis

    表3 黃連主要活性成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of the nodes of the target network of the main active ingredients of Coptis chinensis

    2.6 分子對接驗證結(jié)果

    最終篩選出的Hub 基因為Akt1、IL-1β、MAPK1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)、BCL2、Bax、CXC 型趨化因子配體8(CXCL8)、CC 族趨化因子配體2(CCL2)、RELA,與黃連的有效活性成分槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿進行分子對接模擬,繪制能量矩陣圖(圖4)。小分子與蛋白之間結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol,代表兩者有較好的結(jié)合活性。從對接結(jié)果看,結(jié)合能小于-5.0 kJ/mol,說明小分子與蛋白之間具有較好的結(jié)合活性。其中,挑選出具有強烈結(jié)合活性,且排名前4 位的小分子與蛋白進行可視化展示(圖5)。

    圖4 黃連主要有效成分與關(guān)鍵靶點的分子對接熱圖Fig.4 Molecular docking heat map of the main active ingredients of Coptis chinensis with key targets

    圖5 分子對接的可視化圖Fig.5 Visualization diagram of molecular docking

    2.7 分子動力學模擬

    根據(jù)分子對接結(jié)果,選取具有強烈結(jié)合活性且排名第1 位的小檗堿與IL-1β 進行進一步的分子動力學模擬驗證。如圖6 所示,在模擬過程中蛋白結(jié)構(gòu)在20 ns 后RMSD 達到平衡,小分子的RMSD 在70 ns 后達到平衡,而且小分子在模擬過程中發(fā)生了較大的移動。如圖7、8 所示,蛋白在模擬過程中,回旋半徑在模擬過程中非常穩(wěn)定,α-C 原子除了N端氨基酸波動較大外,其他氨基酸的α-C 原子在模擬過程中波動較小。綜上可知,蛋白在模擬過程中結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定。MM-PBSA 方法計算兩者之間作用力,如表4 所示,兩者的總結(jié)合自由能為-36.19 kcal/mol,其中范德華力和非極性相互作用占比最多,其次是靜電相互作用。

    圖6 模擬的100 ns 過程中小分子和蛋白的RMSDFig.6 RMSD of small molecules and proteins in the simulated 100 ns process

    圖7 模擬的100 ns 過程中蛋白骨架原子的回旋半徑(Rg)Fig.7 Simulated radii of gyration (Rg) of protein backbone atoms during 100 ns

    圖8 模擬的20~100 ns 過程中蛋白α-C 的均方根波動(RMSF)Fig.8 Simulated root mean square fluctuations (RMSF) of protein α-C during 20 — 100 ns

    表4 MM-PBSA計算蛋白和小分子之間的平均結(jié)合能及其組分Table 4 MM-PBSA calculations of the average binding energy between proteins and small molecules and their components

    3 討論

    潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性炎癥性疾病,主要影響結(jié)腸黏膜層,并由遺傳和環(huán)境因素共同引起[11]。黃連是一種傳統(tǒng)的中藥,具有清熱燥濕的功能,已被證明能夠調(diào)節(jié)免疫反應和緩解與炎癥相關(guān)的疾病[12]。黃連主要活性成分小檗堿已用于治療消化系統(tǒng)疾病數(shù)個世紀[13]。在本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接和分子動力學模擬分析了黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。

    本研究獲得了黃連7 個有效成分及其137 個靶點,包括槲皮素、小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿等。槲皮素具有很強的抗氧化性質(zhì),能有效抑制結(jié)腸炎的炎癥損傷[14]。小檗堿通過調(diào)節(jié)腸道膠質(zhì)細胞、腸道上皮細胞和免疫細胞之間的相互作用對潰瘍性結(jié)腸炎的結(jié)腸發(fā)揮保護作用[15]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對硫酸葡聚糖(DSS)引起的結(jié)腸炎、平滑肌損傷和貓的腸道微生物群失調(diào)有效果[16]。

    對交集靶基因的GO 功能注釋分析顯示,小檗堿可以通過各種生物過程、細胞組成和分子功能調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)癌癥途徑、脂質(zhì)與動脈硬化、流體剪切應力與動脈硬化、HIF-1和MAPK 是主要的信號通路。研究表明,MAPK 信號通路參與了潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的全過程,抑制該通路可以明顯降低潰瘍性結(jié)腸炎引起的炎癥反應和細胞凋亡[17]。

    基于PPI 網(wǎng)絡(luò)的4 個Hub 基因算法的結(jié)果,確定了10 個關(guān)鍵基因,包括Akt1、IL-1B、MAPK1、IL-6、TNF、BCL2、BAX、CXCL8、CCL2、RELA,這表明小檗堿可能通過這些靶標發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用。Akt1 是一個與自噬相關(guān)的基因,在細胞凋亡和葡萄糖代謝等細胞過程中發(fā)揮作用。實驗研究表明,Akt1 蛋白的泛素化可以通過促進自噬來減少潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中炎癥因子的表達[18]。在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型中,IL-1β 的表達上調(diào),可能與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)展和進展有關(guān)[19]。

    分子對接結(jié)果顯示,黃連的主要有效成分與核心靶點具有良好的對接活性,其中小檗堿、(R)-氫化小檗堿和木蘭花堿與關(guān)鍵靶點Akt1 和IL-1β 的結(jié)合位點比較穩(wěn)定。這些結(jié)果通過MD 模擬得到進一步驗證,顯示小檗堿與IL-1β 的結(jié)合親和力最高,表明其內(nèi)在的高生物活性。總的來說,本研究為黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機制提供了啟示,可能為臨床應用提供參考。

    綜上所述,本研究全面揭示了黃連治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在機制。研究發(fā)現(xiàn),黃連中的活性成分可能調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中的關(guān)鍵靶點和信號通路。分子對接和分子動力學模擬結(jié)果進一步支持了黃連對潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療作用。這些結(jié)果為進一步研究和開發(fā)黃連作為潰瘍性結(jié)腸炎的潛在治療藥物提供了基礎(chǔ)。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    猜你喜歡
    小檗黃連潰瘍性
    黃連、黃連-生地配伍中5種生物堿在正常、抑郁大鼠中體內(nèi)藥動學的比較
    中成藥(2021年5期)2021-07-21 08:38:12
    貴州野生小檗屬植物土壤與植株微量元素相關(guān)性及富集特征
    交泰丸中小檗堿聯(lián)合cinnamtannin D1的降血糖作用
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:18
    黃芩苷-小檗堿復合物的形成規(guī)律
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:18
    黃連解毒湯對SAM-P/8小鼠行為學作用及機制初探
    中成藥(2017年12期)2018-01-19 02:06:50
    足底潰瘍性扁平苔蘚合并普禿一例
    中西醫(yī)結(jié)合治療潰瘍性結(jié)腸炎40例
    大黃黃連瀉心湯加味治療胃癌癌前病變30例
    愈瘍消潰方治療潰瘍性結(jié)腸炎活動期30例
    治療脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎30例
    亚洲精品美女久久av网站| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 爱豆传媒免费全集在线观看| 看免费av毛片| 99九九在线精品视频| 9热在线视频观看99| 国产探花极品一区二区| 国产精品久久久久成人av| 伦精品一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 一区福利在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 久久精品夜色国产| 母亲3免费完整高清在线观看 | 午夜激情av网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产在线视频一区二区| 亚洲国产精品一区三区| 久久av网站| 我的亚洲天堂| 欧美黄色片欧美黄色片| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 永久免费av网站大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 中文欧美无线码| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费观看a级毛片全部| 男人舔女人的私密视频| 美女主播在线视频| 如何舔出高潮| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产深夜福利视频在线观看| 一区二区av电影网| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久午夜福利片| 2021少妇久久久久久久久久久| √禁漫天堂资源中文www| 久久久亚洲精品成人影院| 日日摸夜夜添夜夜爱| 中国三级夫妇交换| 亚洲久久久国产精品| 一级毛片我不卡| 电影成人av| 香蕉精品网在线| 国产97色在线日韩免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 亚洲国产色片| 老鸭窝网址在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久久久久久国产电影| 在线观看免费视频网站a站| 欧美最新免费一区二区三区| 街头女战士在线观看网站| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 日韩视频在线欧美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久免费观看电影| 99香蕉大伊视频| 国产男女内射视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产色婷婷99| 欧美日本中文国产一区发布| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 五月伊人婷婷丁香| 国产片内射在线| 美国免费a级毛片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 久久99蜜桃精品久久| 久久久久视频综合| 搡老乐熟女国产| 曰老女人黄片| 91成人精品电影| 亚洲,欧美,日韩| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久国产一级毛片高清牌| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 中文字幕精品免费在线观看视频| 韩国精品一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 美女大奶头黄色视频| 十分钟在线观看高清视频www| 看免费av毛片| 国产精品免费视频内射| 日本91视频免费播放| 看十八女毛片水多多多| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级毛片电影观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 青春草国产在线视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产成人精品在线电影| 少妇被粗大猛烈的视频| 色视频在线一区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久毛片免费看一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲最大av| 丰满少妇做爰视频| 婷婷色av中文字幕| 日韩电影二区| 国产免费现黄频在线看| 国产高清不卡午夜福利| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 婷婷成人精品国产| 免费高清在线观看日韩| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美成人午夜精品| 人妻一区二区av| 日韩中字成人| 丰满少妇做爰视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 中文欧美无线码| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩视频在线欧美| 美女主播在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 精品人妻在线不人妻| 国产极品天堂在线| 亚洲国产欧美网| 国产精品久久久av美女十八| 一级,二级,三级黄色视频| 人人澡人人妻人| 韩国精品一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 观看美女的网站| 九九爱精品视频在线观看| 欧美激情高清一区二区三区 | 777久久人妻少妇嫩草av网站| 尾随美女入室| 99热网站在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 日韩av免费高清视频| 人妻系列 视频| 日本黄色日本黄色录像| 极品人妻少妇av视频| 亚洲四区av| 久久久久久久久久久免费av| 国产男人的电影天堂91| 老汉色∧v一级毛片| 国产高清不卡午夜福利| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产高清不卡午夜福利| 精品第一国产精品| 午夜福利视频在线观看免费| 只有这里有精品99| 婷婷色综合www| 赤兔流量卡办理| 香蕉国产在线看| 国产成人a∨麻豆精品| 国产精品久久久av美女十八| 哪个播放器可以免费观看大片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲国产色片| 中文字幕亚洲精品专区| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲成色77777| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品不卡视频一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 看非洲黑人一级黄片| 91久久精品国产一区二区三区| 99久国产av精品国产电影| 久热久热在线精品观看| 国产毛片在线视频| 婷婷色麻豆天堂久久| av网站在线播放免费| 午夜老司机福利剧场| 久热这里只有精品99| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美日韩av久久| 国产在线视频一区二区| 大码成人一级视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 男的添女的下面高潮视频| 综合色丁香网| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | av线在线观看网站| 青草久久国产| 婷婷色综合www| 免费在线观看完整版高清| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产在线视频一区二区| 男女国产视频网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 91国产中文字幕| 性色avwww在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 老汉色∧v一级毛片| 天堂中文最新版在线下载| 亚洲情色 制服丝袜| av在线app专区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男女午夜视频在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 看十八女毛片水多多多| 我的亚洲天堂| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本wwww免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| av.在线天堂| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩精品有码人妻一区| 久久久精品区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 久久精品久久精品一区二区三区| 18+在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 国产亚洲一区二区精品| 一级片免费观看大全| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av成人精品一二三区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 一区二区日韩欧美中文字幕| 精品午夜福利在线看| 中文字幕制服av| 美女大奶头黄色视频| 久久精品国产综合久久久| 亚洲视频免费观看视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| av在线观看视频网站免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜福利在线免费观看网站| 国产一区二区 视频在线| 久久久a久久爽久久v久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产成人aa在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 99香蕉大伊视频| 亚洲色图综合在线观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲综合精品二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产一区二区在线观看av| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线观看一区二区三区激情| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 大片电影免费在线观看免费| 一级黄片播放器| 欧美+日韩+精品| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品熟女久久久久浪| 宅男免费午夜| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲欧美一区二区三区国产| 老司机影院毛片| 国产精品 欧美亚洲| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 最近中文字幕高清免费大全6| 久久精品国产亚洲av天美| 天堂中文最新版在线下载| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 午夜激情久久久久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 免费看不卡的av| 午夜日本视频在线| 中文字幕av电影在线播放| 国产在线一区二区三区精| 亚洲第一区二区三区不卡| 日日摸夜夜添夜夜爱| 尾随美女入室| 国产一区二区 视频在线| 哪个播放器可以免费观看大片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99九九在线精品视频| 黄色配什么色好看| av国产精品久久久久影院| 宅男免费午夜| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久婷婷青草| 有码 亚洲区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费人妻精品一区二区三区视频| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品自拍成人| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 免费观看av网站的网址| 国产精品久久久久成人av| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 日本wwww免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 日本午夜av视频| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品,欧美精品| 九色亚洲精品在线播放| 男女边摸边吃奶| 国产片特级美女逼逼视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| videossex国产| 岛国毛片在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费观看性生交大片5| 高清视频免费观看一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久久精品免费免费高清| 国产精品人妻久久久影院| 波多野结衣av一区二区av| 久久久久久伊人网av| av线在线观看网站| 亚洲综合色惰| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产熟女午夜一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品中文字幕在线视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产爽快片一区二区三区| 99香蕉大伊视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产精品一国产av| 如何舔出高潮| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男女午夜视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品午夜福利在线看| 一级爰片在线观看| av片东京热男人的天堂| 超碰97精品在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲国产日韩一区二区| 欧美少妇被猛烈插入视频| 考比视频在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 亚洲,欧美,日韩| 人人澡人人妻人| 欧美人与善性xxx| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费在线观看完整版高清| 久久久久久久久免费视频了| 免费大片黄手机在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 亚洲成人av在线免费| 99九九在线精品视频| 丝袜美腿诱惑在线| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲av日韩在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 人成视频在线观看免费观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲av中文av极速乱| 少妇 在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成人二区视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产深夜福利视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 国产色婷婷99| 国产亚洲最大av| 午夜福利,免费看| 人人澡人人妻人| 亚洲精品美女久久av网站| 国产综合精华液| 久热这里只有精品99| 成年女人毛片免费观看观看9 | av在线老鸭窝| 99香蕉大伊视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲中文av在线| 制服人妻中文乱码| 国产免费又黄又爽又色| 男人操女人黄网站| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 好男人视频免费观看在线| 国产一区二区激情短视频 | 国产成人精品在线电影| 国产片内射在线| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲av成人精品一二三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美xxⅹ黑人| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲第一青青草原| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 九九爱精品视频在线观看| 只有这里有精品99| 免费日韩欧美在线观看| 国产免费现黄频在线看| 日本av手机在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产欧美在线一区| 男女午夜视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人午夜精彩视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 色婷婷久久久亚洲欧美| 超色免费av| 丝袜在线中文字幕| 2022亚洲国产成人精品| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 大陆偷拍与自拍| av片东京热男人的天堂| 男女午夜视频在线观看| 少妇人妻 视频| 飞空精品影院首页| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 欧美日韩精品网址| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲av福利一区| 男女午夜视频在线观看| 一区在线观看完整版| 观看美女的网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 婷婷成人精品国产| 国产黄色免费在线视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利,免费看| 激情五月婷婷亚洲| 男女无遮挡免费网站观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 男女午夜视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| 麻豆乱淫一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 下体分泌物呈黄色| 男人操女人黄网站| 丝袜喷水一区| 激情五月婷婷亚洲| 性高湖久久久久久久久免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中文欧美无线码| 99久久人妻综合| 2018国产大陆天天弄谢| 午夜福利,免费看| 丝袜美足系列| 老鸭窝网址在线观看| 婷婷成人精品国产| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 考比视频在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产av码专区亚洲av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲色图综合在线观看| 黄频高清免费视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 少妇人妻 视频| 美女中出高潮动态图| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 九草在线视频观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲熟女精品中文字幕| 欧美精品高潮呻吟av久久| 制服人妻中文乱码| 成人亚洲欧美一区二区av| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 日韩电影二区| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲成人一二三区av| 日本vs欧美在线观看视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久青草综合色| 在线天堂最新版资源| 韩国av在线不卡| 国产一区二区在线观看av| 日韩欧美一区视频在线观看| 91精品国产国语对白视频| 国产成人精品无人区| 老汉色∧v一级毛片| 久久久久视频综合| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | www.av在线官网国产| 热99国产精品久久久久久7| 青草久久国产| 欧美av亚洲av综合av国产av | 一区二区三区激情视频| 七月丁香在线播放| 黄片小视频在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| freevideosex欧美| 国产乱人偷精品视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产男女超爽视频在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品一二三| 午夜91福利影院| 18在线观看网站| 97在线人人人人妻| 亚洲国产精品一区三区| 最近中文字幕2019免费版| 人妻系列 视频| av免费在线看不卡| a级片在线免费高清观看视频| 色播在线永久视频| 国产极品天堂在线| 免费黄频网站在线观看国产| 精品第一国产精品| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲综合色网址| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩中字成人| 日韩欧美一区视频在线观看| 丝袜美足系列| 超色免费av| tube8黄色片| 天堂8中文在线网| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 亚洲精品国产一区二区精华液| 黄色一级大片看看| 国产精品99久久99久久久不卡 | 一区二区三区乱码不卡18| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久人人人人人| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久久亚洲精品成人影院| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 777米奇影视久久| 亚洲精品美女久久av网站| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品偷伦视频观看了| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产亚洲最大av| 亚洲成色77777| 97人妻天天添夜夜摸| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品一区二区三卡| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久人妻熟女aⅴ| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品久久久久成人av| 国产黄频视频在线观看| 在线观看人妻少妇| 国产人伦9x9x在线观看 | 亚洲欧美清纯卡通| 免费人妻精品一区二区三区视频| av在线app专区| 久久影院123| 叶爱在线成人免费视频播放| 三级国产精品片| 一级毛片 在线播放| 久久亚洲国产成人精品v| 久久精品国产综合久久久| freevideosex欧美| 十八禁高潮呻吟视频| 国产人伦9x9x在线观看 | 最近手机中文字幕大全| av在线观看视频网站免费| 在线观看人妻少妇| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲av日韩在线播放| 欧美 日韩 精品 国产| 午夜激情久久久久久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 赤兔流量卡办理| 精品国产国语对白av| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲伊人色综图| 久久久精品94久久精品| 欧美最新免费一区二区三区| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久视频综合| 日本黄色日本黄色录像|