六神丸對口腔潰瘍小鼠IL-6、IL-8 水平及MAPK/ERK 通路的影響

周麗俐，張婷，王佳*

1.南昌大學(xué) 撫州醫(yī)學(xué)院，江西 撫州 344000

2.雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 蘇州 215009

六神丸是百草霜為衣的水丸，由麝香、牛黃、珍珠、冰片、蟾酥和雄黃組成[1]，在臨床中應(yīng)用廣泛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其具有清涼解毒、消炎止痛的功效，可用于治療喉風(fēng)喉癰、癰瘍疔瘡、無名腫毒等癥[2]。近年來隨著對六神丸藥效成分的深入研究，證實(shí)了其主要成分具有廣譜的抗炎鎮(zhèn)痛作用。除此之外，隨著相關(guān)臨床療效評價(jià)的開展，六神丸在臨床中的適應(yīng)證不斷擴(kuò)大，廣泛涉及皮膚科、內(nèi)科、口腔科等各科。但是在治療各類型口腔潰瘍時(shí)，其研究結(jié)果及臨床數(shù)據(jù)基本是基于六神丸聯(lián)合其他藥物治療，如六神丸聯(lián)合黃連素[3]、大慶霉素[4]、利多卡因[5]等。因此推測六神丸可能對口腔潰瘍在各種配伍用藥過程中起到重要作用。本研究制備小鼠口腔潰瘍模型，觀察六神丸對口腔潰瘍的治療作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 周齡C57BL/6JGpt 雄性小鼠，SPF 級，體質(zhì)量18～22 g，由江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號SCXK（蘇）2018-0008。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，濕度為（60±10）%，自由飲水進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會的批準(zhǔn)（批號202207A053），遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.2 藥品及試劑

六神丸（雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：10粒/支，批號SA18034A）；桂林西瓜霜（桂林三金藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：2.5 g，批號210973）；白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8 ELISA 檢測試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號 MM-0047R1、MM-0190R1）；NaOH（廣東光華化學(xué)廠有限公司，批號20100113）；水合氯醛（中國藥品生物制品檢定研究院，批號100121-199903）；生理鹽水（Beyotime）；異氟烷（深圳瑞沃德，批號R510-22-10）；β-actin antibody（美國proteintech 公司）；ERK 抗體、抗p-ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號#4695、#4370）；羊抗兔多克隆抗體（北京博爾西科技有限公司，批號BHR101）。

1.3 儀器

多功能酶標(biāo)儀（BioTEK Instruments，Inc.）；高速冷凍離心機(jī)（塞洛捷克D3024R）；勻漿機(jī)（拓赫茨THR 勻漿機(jī)）；離心機(jī)（AndyBio）；垂直電泳槽（美國Rio-Rad 公司）；電泳儀（Biometra）；紫外切膠儀（上海勤翔儀器）；水平脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)（美國Rio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 藥液制備

取六神丸120 粒，滴加生理鹽水碾碎并研成細(xì)粉，再烘干得到六神丸粉末0.375 g。稱取桂林西瓜霜粉末0.375 g，備用。挑選大小約3 mm×3 mm 的氫氧化鈉片狀晶體于試管中備用，保持干燥。

2.2 分組與給藥

將32 只C57BL/6JGpt 小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、六神丸組、桂林西瓜霜組，每組各8 只。采用化學(xué)灼燒法[6]。于造模前12 h 禁食，正常飲水。除對照組外，小鼠經(jīng)4%水合氯醛（0.20 mL/只）麻醉，將3 mm×3 mm 氫氧化鈉片狀晶體放在小鼠口腔左側(cè)頰部黏膜處灼燒20 s，之后迅速移開并用生理鹽水沖洗20 s，2 d 內(nèi)可見3 mm 左右直徑大小的紅白色損傷，傷口轉(zhuǎn)化為中央凹陷并覆以白色偽膜，并伴有口角邊潮濕，臉頰腫脹，甚至口腔內(nèi)出現(xiàn)膿液，即可判定為造模成功。

六神丸組給予局部外敷六神丸，給藥處理前先用異氟烷將小鼠麻醉，將消毒棉簽用生理鹽水潤濕，再用已經(jīng)制備好的六神丸粉末0.375 g，蘸取涂抹于患處，以完全覆蓋創(chuàng)面為標(biāo)準(zhǔn)，2 次/d，連續(xù)治療5 d。桂林西瓜霜組用同樣的方式給予局部外敷桂林西瓜霜粉末0.375 g，2 次/d，涂抹于小鼠口腔潰瘍處，連續(xù)治療5 d。模型組不給予藥物。六神丸與桂林西瓜霜組給藥前使用生理鹽水沖洗口腔，所有小鼠在給藥后禁食禁水0.5 h。實(shí)驗(yàn)過程中所有小鼠均給予正常飲食，自由飲水，所有小鼠均存活并造模成功。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 一般狀態(tài) 每天上午10∶00 時(shí)記錄各小鼠體質(zhì)量并觀察各小鼠外觀形態(tài)變化、對外界反應(yīng)、采食行為等。

2.3.2 潰瘍病理變化 給藥期間觀察潰瘍病理變化和恢復(fù)情況。潰瘍表面感染情況分級及評分規(guī)則為0 級：肉眼觀察潰瘍恢復(fù)至正常狀態(tài)，記0 分；Ⅰ級：表面無明顯假膜，記1 分；Ⅱ級：潰瘍表面有薄層黃白色假膜，周圍無水腫，記2 分；Ⅲ級：潰瘍表面假膜較厚，且周圍伴有炎性水腫，記3 分。顯效：潰瘍表面感染情況評分0、Ⅰ級。有效：潰瘍表面感染情況評分Ⅱ級。無效：潰瘍表面感染情況評分Ⅲ級[7]。

總愈合率＝（顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）/總例數(shù)

2.3.3 生理生化指標(biāo) 在治療第5 天后，采用摘眼球取血的方式采集靜脈血0.5 mL，室溫自然凝固20 min，3 000 r/min、4 ℃離心20 min，分離上層血清于離心管中，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法測定小鼠血清IL-6、IL-8 水平，具體步驟按照ELISA試劑盒說明書來操作。

2.3.4 ERK1/2 磷酸化水平 取小鼠的口腔上皮組織，提取總蛋白，通過二喹啉酸（BCA）方法定量蛋白濃度并配制成2 μg/μL 蛋白濃度，金屬浴煮5 min 使蛋白變性。用β-actin 作為內(nèi)標(biāo)，取樣品5 μg進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析?？辜?xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）抗體和抗 p-ERK 抗體（Cell Signaling Technology，批號#4695、#4370），1∶1 000 稀釋，二抗用羊抗兔多克隆抗體（北京博爾西科技有限公司，批號BHR101），1∶10 000 稀釋。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行處理分析。兩組連續(xù)性計(jì)量數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較，計(jì)量資料以表示，檢驗(yàn)方法采用單因素方差分析（One way-AVONA）。

3 結(jié)果

3.1 一般情況及體質(zhì)量變化

造模第1 天對照組小鼠活動(dòng)敏捷，步態(tài)、行為及對外界反應(yīng)情況正常，無死亡。模型組、六神丸組和西瓜霜組小鼠皮毛光澤變得黯淡，體質(zhì)量開始減少，活力降低（P＜0.05）。給藥第5 天，對照組小鼠體質(zhì)量保持穩(wěn)定，一般狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)開始前無明顯變化，且無小鼠死亡。六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠活力較造模2 d 已經(jīng)有所恢復(fù)，體質(zhì)量逐漸增長，但仍未恢復(fù)到初始體質(zhì)量（P＜0.05）。提示六神丸對氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍具有一定的促進(jìn)恢復(fù)作用，見圖1。

圖1 六神丸對口腔潰瘍小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Influence of Liushen Pills on body mass of mice with oral ulcer

3.2 小鼠口腔潰瘍部位組織病理變化的觀察

觀察各組小鼠口腔潰瘍面的基本狀態(tài)，結(jié)果顯示對照組無潰瘍癥狀出現(xiàn)。其余組別在使用氫氧化鈉灼燒過后可出現(xiàn)明顯的口腔潰瘍，肉眼觀察潰瘍面的黏膜出現(xiàn)大小3 mm×3 mm、覆蓋黃白色偽膜，左側(cè)臉頰充血水腫，說明口腔潰瘍模型制備成功。連續(xù)給藥5 d，對小鼠口腔潰瘍表面進(jìn)行連續(xù)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組口腔黏膜始終保持完整、光滑，無明顯損傷。其他各組潰瘍隨時(shí)間的推移均有不同程度的恢復(fù)趨勢。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出[3]小鼠口腔潰瘍模型具有一定自愈性，隨著時(shí)間的延長，潰瘍面積逐漸減小，創(chuàng)面組織表面逐步恢復(fù)。在給藥第2、5 天觀察，與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍組織顯著恢復(fù)。給藥5 d，模型組潰瘍表面仍存在假膜、膿液，六神丸組小鼠潰瘍面假膜基本消失、恢復(fù)情況良好，桂林西瓜霜組小鼠基本愈合。結(jié)果表明，六神丸可以改善氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍病理狀態(tài)并在一定程度上促進(jìn)恢復(fù)，見圖2。

圖2 六神丸對小鼠口腔潰瘍部位組織病理變化的影響Fig.2 Effect of Liushen Pills on pathological changes of oral ulcer in mice

3.3 六神丸對小鼠口腔潰瘍等級評分的影響

根據(jù)潰瘍表面感染情況分級、評分規(guī)則，造模前模型組、六神丸組、桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍感染評分無顯著性差異；在給藥第1、3、5 天，與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠口腔潰瘍等級評分均顯著減小（P＜0.05）。此外，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠的治愈率明顯高于模型組（P＜0.05），見表1。結(jié)果提示六神丸可以顯著加快氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍的愈合作用。

表1 六神丸治療小鼠口腔潰瘍的等級評分和治愈率（，n=8）Table 1 Grade scores and cure rate of oral ulcers treated by Liushen Pills in mice (,n=8)

表1 六神丸治療小鼠口腔潰瘍的等級評分和治愈率（，n=8）Table 1 Grade scores and cure rate of oral ulcers treated by Liushen Pills in mice (,n=8)

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

3.4 六神丸對口腔潰瘍小鼠血液中IL-6、IL-8 水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠血清中IL-6、IL-8水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠血清中IL-6 水平顯著降低，六神丸組小鼠血清中的IL-8 水平顯著下降（P＜0.05），而桂林西瓜霜組小鼠的IL-8 水平無顯著性差異，見圖3。結(jié)果提示，六神丸可以降低口腔潰瘍小鼠血清中IL-6、IL-8 炎癥因子的水平，可能是其治療氫氧化鈉誘導(dǎo)的口腔潰瘍的作用機(jī)制之一。

圖3 六神丸對口腔潰瘍小鼠血清中IL-6、IL-8 水平的影響（，n=8）Fig.3 Effect of Liushen Pills on serum IL-6 and IL-8 levels in oral ulcer mice (,n=8)

3.5 六神丸對口腔潰瘍小鼠口腔黏膜ERK1/2 磷酸化水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯升高，但總ERK1/2 沒明顯變化，桂林西瓜霜組和六神丸組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯降低，六神丸組降低幅度較桂林西瓜霜組明顯，而桂林西瓜霜并未引起模型小鼠口腔黏膜組織中總的ERK1/2 水平，見圖4。

圖4 六神丸對口腔潰瘍小鼠血清中ERK1/2 磷酸化水平的影響Fig.4 Effect of Liushen Pills on ERK1/2 phosphorylation in serum of oral ulcer mice

4 討論

口腔潰瘍是臨床上常見的口腔疾病，近年來該病的患病率呈顯著的上升趨勢。其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，口腔潰瘍的發(fā)病誘因比較多，包括但不限于遺傳因素、維生素缺乏、精神壓力與內(nèi)分泌紊亂、系統(tǒng)性疾病、創(chuàng)傷等[8]。臨床中以促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合，縮短康復(fù)周期，防止復(fù)發(fā)等作為主要治療原則?，F(xiàn)有針對口腔潰瘍治療的專一、特效方法仍然有待探索。傳統(tǒng)的方法如給予維生素C，可一定程度促進(jìn)瘡面愈合；噴涂西瓜霜粉末有清熱解毒，消腫止痛的功效，但治療效果受限，不利于快速康復(fù)[9]。除此之外還有抗菌類的藥物，但是在實(shí)際臨床應(yīng)用中都存在一定的缺陷，如會產(chǎn)生耐藥性、對真菌感染無效且伴有顯著的不良反應(yīng)、停藥后容易復(fù)發(fā)等諸多問題。針對上述的各種情況，在中醫(yī)學(xué)理論中有著完整的論述和治療方向?？谇粷冊谥嗅t(yī)學(xué)中又稱“口瘡”，其發(fā)生原因的闡述與現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)研究較為相近。但是在治療方法上以清熱解毒、祛腐生肌、消腫止痛為主要原則。

六神丸來源于《雷允上誦芬堂方》，是我國著名的傳統(tǒng)國藥精粹。六神丸具有清熱解毒、消腫止痛、斂瘡生肌之功效，以及無論內(nèi)服、外敷，對紅腫癰癤、口咽糜爛等癥均有奇效[10]，這都符合前文所述對于口腔潰瘍的治療原則。這提示了可以進(jìn)一步探索六神丸對于口腔潰瘍的療效。有臨床報(bào)道[11-12]，六神丸與多種藥物聯(lián)合使用對各類型的口腔潰瘍患者具有較好的治療效果，對口腔黏膜損傷有一定的保護(hù)作用。研究表明六神丸具有很好的抑制炎癥和鎮(zhèn)痛效果，對非感染性和感染性炎癥均具有良好的抑制作用[13]，且對于口腔內(nèi)黏膜的治療，采用含服給藥方式的效果比傳統(tǒng)給藥方式更突出，藥物有效濃度持續(xù)時(shí)間更長，對人體的不良反應(yīng)也更小。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，六神丸組與桂林西瓜霜組小鼠的體質(zhì)量顯著增高，表明六神丸通過對小鼠口腔潰瘍感染處的鎮(zhèn)痛作用，減輕潰瘍所帶來的疼痛感對小鼠進(jìn)食、情緒等方面的影響，進(jìn)而可降低口腔潰瘍對小鼠體質(zhì)量的影響，也提示六神丸可以緩解進(jìn)食、正常生理活動(dòng)下因潰瘍面的造成的疼痛、改善小鼠精神狀態(tài)、促進(jìn)體質(zhì)量的恢復(fù)。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究均采用潰瘍面積大小或者愈合時(shí)間作為衡量指標(biāo)[10,14-16]。本研究采用潰瘍表面感染分級作為評價(jià)指標(biāo)，以此對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步的量化處理，使結(jié)果更具直觀性和對比性。結(jié)果顯示，治療第5 天，六神丸組和桂林西瓜霜組小鼠的口腔潰瘍等級評分顯著低于模型組。

急性的創(chuàng)傷可以導(dǎo)致口腔黏膜上皮水腫和早期炎癥細(xì)胞浸潤[9]，故小鼠血清中的炎性因子如IL-6、IL-8 在口腔潰瘍的發(fā)生中扮演著重要的角色。其中IL-6 能夠促進(jìn)機(jī)體釋放多種炎癥因子，從而造成炎性損傷[17]；IL-8 能夠促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞釋放多種趨化因子，導(dǎo)致機(jī)體的局部炎癥反應(yīng)，從而引起黏膜損傷[18]。結(jié)果顯示，與模型組相比，六神丸組與桂林西瓜霜組小鼠血清IL-6、IL-8 水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)造模成功小鼠會出現(xiàn)高炎癥狀態(tài)，六神丸可以通過抗炎作用對小鼠口腔潰瘍起到顯著的保護(hù)作用。ERK1/2 是MAPK 蛋白家族成員之一，是調(diào)節(jié)正常細(xì)胞增殖、存活和分化的關(guān)鍵信號通路。本研究顯示，六神丸組小鼠口腔黏膜組織中ERK1/2 磷酸化水平明顯降低，表明六神丸可以通過降低ERK1/2 磷酸化水平調(diào)控正常細(xì)胞增殖，保護(hù)黏膜細(xì)胞、緩解潰瘍損傷，促進(jìn)小鼠恢復(fù)。

綜上所述，六神丸能緩解口腔潰瘍小鼠口腔組織損傷，抑制炎性因子的釋放，促進(jìn)小鼠恢復(fù)，其對小鼠的療效觀察較為滿意，提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突