基于堿性和酸性氨基酸比值的陳化烤煙煙葉適用時(shí)間判斷

周顯升 周金輝 魏玉磊 劉群 王銀龍

摘 ?要：為明確陳化期間煙葉堿性和酸性氨基酸含量及其比值變化規(guī)律，并依據(jù)其比值判斷陳化煙葉適宜使用時(shí)間，對福建龍巖、福建南平、貴州畢節(jié)、河南三門峽、湖南永州、四川涼山、陜西安康、云南保山、云南曲靖、山東、重慶和津巴布韋12個(gè)產(chǎn)區(qū)2006—2008年度烤煙復(fù)烤片煙樣品定期取樣，采用液相色譜法，跟蹤分析了樣品陳化期間游離堿性和酸性氨基酸變化，并分析了其與陳化煙葉感官質(zhì)量的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.感官評吸結(jié)果表明，同一產(chǎn)區(qū)同一等級不同年度煙葉感官質(zhì)量達(dá)到最優(yōu)所需陳化時(shí)間不同；2. 陳化期間堿性、酸性氨基酸含量比值逐漸降低，與陳化時(shí)間具有較好的線性相關(guān)關(guān)系，與感官質(zhì)量具有較好的二次相關(guān)關(guān)系；3.應(yīng)用2007、2008年度線性回歸方程計(jì)算得出陳化煙葉適宜使用時(shí)間內(nèi)的堿性、酸性氨基酸比值范圍，經(jīng)2006年度樣品驗(yàn)證，判斷準(zhǔn)確率達(dá)85%。綜上，堿性、酸性氨基酸比值可衡量煙葉陳化程度，為判斷陳化煙葉質(zhì)量提供了新方法。

關(guān)鍵詞：烤煙片煙；陳化；堿性氨基酸；酸性氨基酸；適用時(shí)間

中圖分類號：TS411???????????????????????文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ?????????????????????文章編號：1007-5119（2023）05-0086-08

Suitable Quality Determination for Aged Flue-cured Tobacco?Strips?Based on Ratio of Basic Amino Acid to?Acidic Amino Acid

ZHOU Xiansheng，?ZHOU Jinhui，?WEI Yulei¹，?LIU Qun，?WANG Yinlong

（1.?Technology Center，?China Tobacco Shandong Industrial Co.，?Ltd.，?Jinan 250014，?China; 2.?Jinan Cigarette Factory，?China Tobacco Shandong Industrial Co.，?Ltd.，?Jinan 250104，?China）

?It is crucial to investigate the changes of contents and ratio of basic and acidic amino acids in aging process， and the ratio can be used to assess the quality of aged tobacco strips. Aiming to analyze these changes?and their relationship with sensory quality， a study was conducted by using liquid chromatography to examine the variations in free basic and acidic amino acids of flue-cured tobacco strips in 2006―2008 from 12 regions， i.e. Longyan and Nanping （Fujian Province）， Bijie （Guizhou Province）， Sanmenxia （Henan Province）， Yongzhou （Hunan Province）， Liangshan （Sichuan Province）， Ankang （Shaanxi Province）， Baoshan and Qujing（Yunnan Province）， Shandong， Chongqing， and Zimbabwe. Sensory evaluation results showed that aging time required for the peak sensory quality differed among the same tobacco grades produced in different years from the same region. In aging process， the ratio of basic amino acid content to acidic amino acid content gradually decreased， demonstrating a strong linear correlation with aging time and a significant correlation with sensory quality. Linear regression equations were adopted to calculate the range of basic and acidic amino acid ratios suitable for high-quality aged tobacco leaves in 2007 and 2008. After validating the samples in 2006， the judgment accuracy reached 85%. The ratio of basic to acidic amino acids can definitely measure the aging degree of tobacco leaves， which might provide a novel method for evaluating aging quality.

?flue-cured tobacco strip;?aging;?basic amino acid;?acidic amino acid;?suitable time for use

基金項(xiàng)目：山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目（2007027）

作者簡介：周顯升（1970-），男，碩士，高級工程師，主要從事原料研究和產(chǎn)品開發(fā)與維護(hù)工作。E-mail：zxs6143@163.com

收稿日期：2023-05-05??????????修回日期：2023-07-10

陳化（也稱為“醇化”）是提高收獲后煙葉質(zhì)量的必要過程。陳化過程中，煙葉感官質(zhì)量具有前期升高、后期降低的變化趨勢，感官質(zhì)量高峰前后1年是煙葉的最佳工業(yè)使用期。陳化時(shí)間是判斷煙葉陳化程度最常用的指標(biāo)，但不同地域生產(chǎn)煙葉的理化性質(zhì)不同，陳化質(zhì)量達(dá)到高峰所需時(shí)間也不同，因此，利用陳化時(shí)間判斷煙葉使用時(shí)期，有時(shí)會出現(xiàn)較大誤差。為此，不同學(xué)者從不同角度，提出了陳化程度、陳化質(zhì)量判斷方法。黃樂平等開展了碘值法判斷煙葉醇化程度的研究。郁建平等認(rèn)為陳化煙葉的水提取液吸光度在0.40～0.55范圍內(nèi)煙葉質(zhì)量較好，吸光度>0.55或<0.4煙葉質(zhì)量較差。劉曙光等以吸光值、pH、綠原酸、蕓香苷、總植物堿、總糖含量6個(gè)主要化學(xué)成分指標(biāo)構(gòu)建了醇化片煙感官質(zhì)量預(yù)測模型。王光耀等以堿性氨基酸占比、酸性氨基酸含量、環(huán)狀亞氨基酸含量和游離氨基酸總量構(gòu)建了醇化片煙外觀質(zhì)量回歸模型，以酸性氨基酸、脂肪族氨基酸和酰胺類氨基酸等的占比構(gòu)建了醇化片煙感官質(zhì)量回歸模型。多個(gè)專利分別公開了應(yīng)用pH降解率、外觀質(zhì)量、吸光值、紫外光譜、pH、近紅外光譜等判斷醇化程度和醇化質(zhì)量的方法，進(jìn)一步為陳化煙葉合理使用提供了技術(shù)參考。目前陳化程度、陳化質(zhì)量判斷方法多為通過分析某一單年度煙葉陳化質(zhì)量數(shù)據(jù)得出的，用于預(yù)測其他年度煙葉時(shí)會出現(xiàn)誤差偏大等問題。

王光耀等分析了湖南、貴州、福建、云南、河南、津巴布韋和巴西等產(chǎn)地片煙醇化6～33個(gè)月游離氨基酸變化，發(fā)現(xiàn)醇化33個(gè)月后，酸性、堿性氨基酸分別減少26.07%、53.45%，堿性氨基酸含量降低幅度高于酸性氨基酸，酸性氨基酸占游離氨基酸總量的比例增加32%。由于游離堿性、酸性氨基酸密切影響煙葉質(zhì)量，這兩類氨基酸在陳化期間的變化差異為利用其判斷陳化煙葉質(zhì)量提供了可能。本研究基于2006—2008年度12個(gè)產(chǎn)區(qū)59份中部、上部烤煙復(fù)烤片煙樣品，定期取樣，跟蹤分析了樣品陳化期間感官質(zhì)量、游離堿性和酸性氨基酸變化，探尋其用于表征陳化煙葉質(zhì)量的可行性，旨在為煙葉陳化程度的判斷提供新的技術(shù)方法。

1??材料與方法

1.1??試驗(yàn)材料

2006—2008年度烤煙復(fù)烤片煙：福建龍巖、南平C3FL（C3F、C3L混打，下同）、C3F，貴州畢節(jié)C3FL、C3F、B2F，河南三門峽C3FL、C3F、B23F（B2F、B3F混打）、B3F，湖南永州C3FL、C3F、B2F，四川涼山C3F、B2L，山東C3F、B2F，陜西安康C3FL、C3F、C3L，云南保山C3F、B2F，云南曲靖C4F、C3F、B3F，重慶C3FL、C3F、B2F、B3F，津巴布韋B1LT、L20。2006、2007、2008年度樣品數(shù)分別為20份、19份、20份，3年共計(jì)樣品59份。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1??煙葉陳化與取樣 ?煙葉在濟(jì)南室內(nèi)倉庫按文獻(xiàn)[4]要求室溫下正常陳化。自樣品收獲年度9月起計(jì)算陳化時(shí)間。固定煙箱取樣，每隔3～6個(gè)月取樣一次，每次每樣品取樣5?kg。取樣后煙葉切絲，一部分卷制成無嘴卷煙用于感官質(zhì)量評價(jià)，另一部分進(jìn)行氨基酸檢測。均于?20?℃低溫保存。首次至末次取樣時(shí)間跨度：2006年度煙葉陳化20—49個(gè)月，2007年度12—37個(gè)月，2008年度13—35個(gè)月。

1.2.2 ?感官質(zhì)量評價(jià) ?每份樣品首次至末次樣作為一組評價(jià)樣品。固定專家評委，采用《山東中煙原煙及復(fù)烤煙感官質(zhì)量評價(jià)辦法-標(biāo)度法》，按取樣時(shí)間順序依次評價(jià)。

感官質(zhì)量總分計(jì)算方法：按S（標(biāo)度平均值/9×指標(biāo)賦值）計(jì)算感官質(zhì)量總分。各指標(biāo)賦值分別為香氣質(zhì)15、香氣量20、余味25、雜氣18、喉部刺激性4、口腔刺激性4、鼻腔刺激性4。

1.2.3 ?游離氨基酸檢測 ?按照文獻(xiàn)[23]，采用柱前衍生-液相色譜法，檢測游離堿性氨基酸（Arg、His、Lys）、游離酸性氨基酸（Asp、Glu）。前處理方法：稱取0.100 g煙末，置于50 mL三角瓶中，加入25 mL超純水，振蕩萃取1 h，搖勻過濾，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾備用。移取10 μL濾液置于6 mm×50 mm衍生管底部，加入70 μL硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻。加入20 μL AccQ-2A氨基酸衍生劑，渦旋10 s，用封口膠封口，室溫靜置1 min，置于55 ℃水浴內(nèi)進(jìn)行衍生化反應(yīng)，10 min后取出冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至樣品瓶進(jìn)行分析。LC-MS方法：色譜柱為Waters AccQ·Tag 氨基酸分析柱（3.9 mm×15 cm）；流動相A，醋酸鹽-磷酸鹽緩沖液（Waters公司），按體積比l∶10用超純水稀釋；流動相B，乙腈（HPLC級）+高純水（3+2）；流速1.0 mL/min；柱溫37 ℃；檢測波長248 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4??統(tǒng)計(jì)方法 ?利用Excel繪制折線圖、散點(diǎn)圖，進(jìn)行趨勢分析，利用DPS系統(tǒng)進(jìn)行回歸分析。

2 ?結(jié) ?果

2.1??煙葉最佳陳化時(shí)間

根據(jù)感官質(zhì)量評價(jià)結(jié)果，陳化期間，煙葉樣品感官質(zhì)量均呈先升高后下降的單峰變化趨勢。但同一產(chǎn)區(qū)同一等級不同年度間煙葉感官質(zhì)量達(dá)到高峰所需陳化時(shí)間存在差異（表1），部分產(chǎn)地同級別樣品在不同年度間達(dá)到最優(yōu)陳化質(zhì)量的時(shí)間差異超過10個(gè)月?？梢姡瑑H以陳化時(shí)間作為判斷煙葉陳化程度的依據(jù)，會影響判斷準(zhǔn)確性。

2.2??酸性氨基酸變化

不同樣品酸性游離氨基酸含量（Asp+Glu）平均值隨陳化時(shí)間變化見圖1、圖2（津巴布韋2個(gè)等級煙葉計(jì)為上部，下同）。從圖中可看出，隨陳化時(shí)間延長，2007、2008年度中部、上部煙葉酸性氨基酸量大體呈升高-降低-升高-降低趨勢，起伏波動，末次樣較首次樣僅略有升高或小幅降低，上部樣品三年平均降低6.4%，中部樣品三年平均升高4.5%。首次取樣時(shí)，2006年度已陳化20個(gè)月，而2007、2008年度樣品分別陳化12個(gè)月、13個(gè)月，故2006年度未檢測到前期上升趨勢。

2.3??堿性氨基酸變化

不同煙葉樣品游離堿性氨基酸含量（Arg+ His+ Lys）平均值變化見圖3、圖4。從圖中可看出，陳化期間，堿性氨基酸含量總體具有快速降低-小幅升高-降低變化趨勢，末次樣均較首次樣大幅降低，中部、上部煙葉末次取樣分別較首次取樣降低44.5%和49.5%。三年度兩個(gè)部位樣品變化趨勢基本一致。

2.4??堿性和酸性氨基酸含量比值變化及與陳化時(shí)間的回歸分析

從圖5可看出，上部煙葉堿性和酸性氨基酸含量比值（以下簡稱堿酸氨基酸比值）大于中部煙葉，堿酸氨基酸比值與陳化時(shí)間回歸方程達(dá)顯著或極顯著水平，隨陳化時(shí)間延長，堿酸氨基酸比值線性降低，三年度煙葉樣品趨勢一致。

以陳化時(shí)間為自變量（），以堿酸氨基酸比值為因變量（），對各試驗(yàn)樣品進(jìn)行回歸分析，回歸方程見表2?？傮w看，84.7%樣品回歸方程達(dá)顯著或

極顯著水平。說明堿酸氨基酸比值與陳化時(shí)間具有較好的線性關(guān)系。隨陳化時(shí)間延長，堿酸氨基酸比值總體呈線性降低趨勢。

2.5??堿酸氨基酸比值與感官質(zhì)量關(guān)系分析

煙葉堿酸氨基酸比值平均值（）與感官質(zhì)量總分平均值（）回歸方程見表3。從表中可看出，堿酸氨基酸比值與感官質(zhì)量總分具有較好的二次相關(guān)關(guān)系，回歸方程達(dá)到顯著或極顯著水平，堿酸氨基酸比值顯著影響煙葉感官質(zhì)量。陳化期間，隨著堿酸氨基酸比值的降低，感官質(zhì)量先升高后降低。

2.6??陳化煙葉適宜使用期的堿酸氨基酸比值范圍

2.6.1??適宜范圍確定 ?煙葉在質(zhì)量高峰前后1年使用最為理想。利用表2中2007、2008年度樣品回歸方程，以表1中煙葉達(dá)到最優(yōu)感官質(zhì)量的陳化時(shí)間作為中心值，前推6個(gè)月（）、后推6個(gè)月（），對應(yīng)計(jì)算堿酸氨基酸比值、，則[，]為該年度煙葉適宜使用期的指標(biāo)范圍（表4）。從表4中可看出，雖然同一產(chǎn)區(qū)同一部位2007、2008年度煙葉初始堿酸氨基酸比值不同，但大部分樣品[，]范圍較接近。

取同一產(chǎn)區(qū)同一部位2007、2008年度煙葉[，?]的交集[， ]作為該產(chǎn)區(qū)該部位煙葉適宜使用期的堿酸氨基酸比值范圍，9份單一年度樣品的[，?]直接作為[， ]，列于表4。

2.6.2 ?指標(biāo)驗(yàn)證 ?以2006年度樣品進(jìn)行驗(yàn)證。由于2006年度樣品首次取樣時(shí)已陳化20個(gè)月，堿酸氨基酸實(shí)測比值與陳化時(shí)間回歸方程缺少樣品前期信息，因此在分析陳化質(zhì)量指標(biāo)時(shí)未采用本年度樣品。2006年度樣品感官質(zhì)量高峰、高峰前1次和高峰后1次取樣的堿酸氨基酸實(shí)測比值見表4。從表4中可看出，20份樣品中17份堿酸氨基酸實(shí)測比值在[， ]范圍內(nèi)。比值不在范圍內(nèi)的取樣樣品，實(shí)測比值與判斷指標(biāo)范圍差異較小。如果以取樣樣品實(shí)測比值處于[， ]范圍內(nèi)代表煙葉陳化適宜使用期判斷正確，則2006年度煙葉樣品判斷準(zhǔn)確率85%。

3??討 ?論

本研究發(fā)現(xiàn)，2007、2008年度樣品酸性氨基酸含量變化趨勢與蘇宇研究結(jié)果基本一致。2008年度煙葉陳化初期堿性氨基酸升高，可能與陳化過程

中蛋白酶活性前期升高、后期下降的趨勢有關(guān)。不同煙葉樣品因化學(xué)成分含量和蛋白酶活性差異，可能會使氨基酸含量達(dá)到最大值所需時(shí)間不同，導(dǎo)致2008年度樣品氨基酸含量在陳化13個(gè)月后仍有升高現(xiàn)象。2006年度樣品因首次樣陳化時(shí)間大于2007、2008年度樣品，陳化前期酸性氨基酸含量缺少上升階段，其他變化趨勢與2007、2008年度相同。

本研究中，陳化期間堿性氨基酸含量降低，降幅大于酸性氨基酸，與王光耀等結(jié)論基本一致；且陳化末次樣較首次樣堿性氨基酸含量大幅降低，酸性氨基酸含量降低幅度較小或增加，堿性、酸性氨基酸含量不同變化導(dǎo)致陳化過程中堿酸氨基酸比值呈線性降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)煙葉堿酸氨基酸含量比值與感官質(zhì)量具有顯著二次相關(guān)關(guān)系，堿酸氨基酸比值可反映陳化煙葉感官質(zhì)量優(yōu)劣。這種現(xiàn)象可能與以下原因有關(guān)：首先，依據(jù)美拉德反應(yīng)的程度可將氨基酸的反應(yīng)活性劃分為高、中、低3檔，高活性的氨基酸多為堿性，低活性氨基酸多為酸性。陳化期間，堿性氨基酸較多參與反應(yīng)，含量降幅大，酸性氨基酸較少參與反應(yīng)，含量降幅??；其次，雖然氨基酸參與酶促棕色化反應(yīng)，且棕色色素組分中氨基酸Asp、Glu最多，但在陳化12個(gè)月后，蛋白酶、多酚氧化酶活性不斷降低，酶促棕色化反應(yīng)逐步放緩，導(dǎo)致參與反應(yīng)的酸性氨基酸量不斷減少，酸性氨基酸含量降幅減少。這也證明了煙葉陳化過程中美拉德反應(yīng)可能是主要的棕色化反應(yīng)的觀點(diǎn)。

本研究利用2007—2008年度煙葉堿酸氨基酸比值與時(shí)間的回歸方程計(jì)算出12個(gè)產(chǎn)區(qū)中、上部陳化煙葉適宜使用期堿酸氨基酸比值范圍，嘗試用于判斷其他年度煙葉陳化程度和適宜使用期。經(jīng)2006年度20份樣品驗(yàn)證，判斷準(zhǔn)確率為85%。堿酸氨基酸比值大于指標(biāo)上限，表明煙葉陳化不足；小于指標(biāo)下限，說明陳化過度。煙葉在指標(biāo)上限附近開始使用，在下限前用完，可獲得較高的使用質(zhì)量。本文提出的陳化煙葉適宜使用期指標(biāo)是基于濟(jì)南地區(qū)倉庫陳化煙葉得出的。由于不同地區(qū)環(huán)境條件和倉儲環(huán)境差異影響煙葉陳化質(zhì)量，同一煙葉在不同地區(qū)倉庫儲存，陳化適宜時(shí)間可能不同。與本研究同步進(jìn)行的青島地區(qū)陳化試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。

在現(xiàn)有的表征和判斷煙葉陳化程度的方法中，碘值法因需目視判斷滴定終點(diǎn)顏色，不易掌握，誤差較大。吸光值法、pH降解率法需通過它們與醇化時(shí)間的回歸方程獲得醇化時(shí)間，實(shí)質(zhì)上是利用醇化時(shí)間判斷醇化進(jìn)程，而本研究證明利用醇化時(shí)間判斷煙葉醇化程度有時(shí)會出現(xiàn)較大誤差。利用走油、碳化煙葉占片煙比例判斷煙葉使用時(shí)間也需通過目視確定外觀質(zhì)量，判斷精度易受人員個(gè)體差異影響。黃桂紅等研究表明，代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方法能有效區(qū)分醇化和非醇化煙葉，并且能揭示不同醇化程度煙葉的特征及不同產(chǎn)地對煙葉化學(xué)成分的影響。梁珂馨等基于非靶向代謝物組成，將云南上部和中部煙葉醇化進(jìn)程劃分為3個(gè)階段，篩選出了醇化前期至中期、醇化中期至后期的差異代謝物。但兩研究的測定分析方法復(fù)雜，不宜實(shí)施。煙葉游離堿性、酸性氨基酸含量可通過儀器直接獲得，檢測方法成熟，同時(shí)堿酸氨基酸比值顯著影響感官質(zhì)量，因此利用堿酸氨基酸比值判斷煙葉陳化程度可獲得較高判斷準(zhǔn)確率。

由于受生態(tài)、栽培、烘烤和復(fù)烤等多種因素影響，年度間煙葉質(zhì)量可能存在較大差異。利用2個(gè)年度煙葉得出的指標(biāo)范圍難免會具有一定局限性，本研究采用的3個(gè)年度煙葉堿性、酸性氨基酸含量差異也證明了這一點(diǎn)。今后需不斷利用其他年度煙葉優(yōu)化、驗(yàn)證指標(biāo)，使其適用性更加廣泛。

4??結(jié) ?論

陳化煙葉感官質(zhì)量呈現(xiàn)升高后下降的單峰變化趨勢，同一產(chǎn)區(qū)同一等級不同年度煙葉達(dá)到最高質(zhì)量的時(shí)間存在差異。堿酸氨基酸比值隨陳化時(shí)間延長線性下降?？梢砸罁?jù)陳化煙葉適宜使用期確定此期間的堿酸氨基酸比值范圍，從而通過堿酸氨基酸比值判斷煙葉是否在適用時(shí)間內(nèi)。經(jīng)過驗(yàn)證比較，煙葉實(shí)際適宜使用期間測得的比值有85%在用于判斷的比值范圍內(nèi)。游離堿性、酸性氨基酸含量不同變化幅度是導(dǎo)致陳化期間堿酸氨基酸比值線性降低的主要原因。堿酸氨基酸比值顯著影響煙葉感官質(zhì)量，可用于判斷煙葉陳化程度。

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