江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)烤煙品種遺傳分析及分子身份證構(gòu)建

田震 李媛 孫晉浩 任民 李少鵬 張興偉 趙才能 錢建財(cái) 劉國(guó)祥

摘 ?要：煙葉原料的穩(wěn)定性、一致性是保障煙草工業(yè)公司產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展的關(guān)鍵，有效區(qū)分和鑒別煙葉原料是當(dāng)前工業(yè)公司亟需解決的難點(diǎn)。本研究以江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)主栽的23個(gè)烤煙品種為材料，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，從212對(duì)SSR引物中最終篩選出12對(duì)多態(tài)性高且條帶清晰的引物，等位基因數(shù)介于2～5，多態(tài)性信息含量介于0.333 8～0.571 1。聚類分析發(fā)現(xiàn)，各品種按照遺傳背景聚為4類；群體遺傳結(jié)構(gòu)和主成分分析均將供試材料劃分為2個(gè)亞群，且類群內(nèi)各品種的分布結(jié)果高度一致，與種質(zhì)親緣關(guān)系吻合度較高。該組引物高效可靠，可用于烤煙品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。本研究可為江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)主栽烤煙品種的育種利用和煙葉原料鑒定提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：烤煙；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S572.037 ????????????????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?????????????????????文章編號(hào)：1007-5119（2023）05-0001-08

Genetic Analysis and Molecular ID Card Construction of Flue-cured Tobacco Varieties in the Core Production Areas?of?China?Tobacco Jiangsu Industrial Corporation

TIAN Zhen， LI Yuan， SUN Jinhao， REN Min， LI Shaopeng， ZHANG Xingwei，

ZHAO Caineng， QIAN Jiancai， LIU Guoxiang

（1. China Tobacco Jiangsu Industrial Co.， Ltd.， Nanjing 210019， China; 2. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

?The stability and consistency of tobacco leaf raw materials are key for?ensuring the high-quality development of tobacco industrial companies’ products. Effective differentiation and identification of tobacco leaf raw materials is an urgent challenge that industrial companies need to solve. In this study， 23 flue-cured tobacco varieties mainly planted in the production areas?of Tobacco Jiangsu Industrial Corporation were used as materials. Eventually， 12 pairs of primers with high polymorphism and clear bands were selected from 212 pairs of SSR primers by polyacrylamide gel electrophoresis detection. The number of alleles ranged from 2 to 5， and the polymorphism information content ranged from 0.333 8 to 0.571 1. Cluster analysis revealed that each variety was clustered into four categories based on?genetic background. Based on the population genetic structure and principal component analysis the tested materials were divided?into two subgroups. The distribution results of varieties within the groups?were highly consistent， and were largely agreed with the pedigree relationship. This set of primers was highly efficient and reliable， and it could be used for constructing DNA fingerprints and genetic diversity analysis of flue-cured tobacco varieties. The results from this study could provide theoretical basis for the breeding utilization and identification of tobacco leaf materials of main flue-cured tobacco varieties in the Tobacco Jiangsu Industrial Corporation core production areas.

?flue-cured tobacco; SSR molecular marker; genetic diversity; fingerprint spectrum library

基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司重大科技項(xiàng)目（110202201014）；江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（202208）；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC01）；山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ZR2022MC145）

作者簡(jiǎn)介：田 ?震（1988-），碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙葉原料和卷煙配方研究。E-mail：tianzhen@jszygs.com。*通信作者，E-mail：liuguoxiang@caas.cn

收稿日期：2023-05-26?????????????????修回日期：2023-09-25

煙草在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位，優(yōu)良品種真實(shí)性和純度直接影響到產(chǎn)品的質(zhì)量，是突出煙葉風(fēng)格，保障中式卷煙品質(zhì)的基礎(chǔ)。而煙葉原料的穩(wěn)定性、一致性是保障工業(yè)公司產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展的關(guān)鍵。卷煙生產(chǎn)涉及煙葉種植、調(diào)制、收購(gòu)、調(diào)撥等多個(gè)環(huán)節(jié)，近年來(lái)由于部分產(chǎn)區(qū)品種布局落實(shí)不到位，導(dǎo)致在煙葉采收和調(diào)撥環(huán)節(jié)易發(fā)生品種混雜和混淆等問(wèn)題，通過(guò)田間農(nóng)藝性狀、煙葉外觀和抽樣感官評(píng)價(jià)等傳統(tǒng)鑒別方法難以對(duì)煙草品種進(jìn)行精準(zhǔn)的區(qū)分和鑒定。因此，如何高效、準(zhǔn)確、有針對(duì)性地鑒別煙葉品種成為當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

相較于傳統(tǒng)的煙草品種鑒別方法，利用分子標(biāo)記進(jìn)行鑒定可不受環(huán)境影響且準(zhǔn)確度更高。DNA指紋圖譜具有多位點(diǎn)性、高變異性和簡(jiǎn)單穩(wěn)定的遺傳性，利用分子標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜進(jìn)行品種真?zhèn)舞b定已廣泛應(yīng)用到作物品種保護(hù)中，國(guó)際植物品種權(quán)保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）將構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)記方法確定為SSR和SNP。其中SSR標(biāo)記多態(tài)性高、專一性強(qiáng)、結(jié)果可靠、操作簡(jiǎn)單。以Bindler等公布的煙草高密度SSR標(biāo)記遺傳圖譜為基礎(chǔ)的DNA分子鑒定方法，目前在煙草領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。為了能夠快速鑒定烤煙主栽品種，黃莉莎等篩選出4對(duì)SSR引物，能將9個(gè)煙草主栽品種完全區(qū)分開(kāi)；孫九喆等利用瓊脂糖凝膠電泳篩選出5對(duì)SSR引物，構(gòu)建了11個(gè)主要煙草品種的指紋圖譜；田陽(yáng)陽(yáng)等利用SSR熒光標(biāo)記和毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù)確定了5對(duì)SSR引物，能夠有效地將8個(gè)烤煙主栽品種區(qū)分開(kāi)。

系統(tǒng)掌握核心產(chǎn)區(qū)煙葉品種、深入挖掘種質(zhì)資源遺傳信息，對(duì)進(jìn)一步明確工業(yè)公司原料基地?zé)熑~需求品種和保障煙葉原料的優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定具有重要意義。本研究以江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)主栽的23個(gè)烤煙品種為樣本，篩選出一套多態(tài)性高、重復(fù)性好的SSR引物，對(duì)供試品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建DNA指紋圖譜，建立江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)烤煙品種分子身份證，以期為煙葉原料的科學(xué)、準(zhǔn)確鑒定提供技術(shù)支持。

1 ?材料與方法

1.1??試驗(yàn)材料

根據(jù)江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)2022年度煙葉種植和品種試驗(yàn)安排，調(diào)研基地所在植煙縣內(nèi)其他主栽品種和試驗(yàn)品種，同時(shí)結(jié)合國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)中現(xiàn)有資源情況，最終選定23個(gè)烤煙品種進(jìn)行分子身份證構(gòu)建。所有供試品種由國(guó)家煙草種質(zhì)資源中期庫(kù)（青島）提供，品種資源的編號(hào)、名稱、來(lái)源及系譜見(jiàn)表1。

1.2 ?DNA提取

供試材料于2022年種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所的人工氣候室，于苗期采集嫩葉于2?mL離心管中，經(jīng)液氮冷凍后研磨，采用SLS法提取DNA，將DNA濃度統(tǒng)一稀釋到50 ng/μL后于–20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ?SSR引物

參考本實(shí)驗(yàn)室前期建立的SSR引物數(shù)據(jù)庫(kù)和其他已發(fā)表的多態(tài)性較好的SSR引物，篩選出212對(duì)SSR引物用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 ?PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序參照2×Taq PCR MasterMix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說(shuō)明書(shū)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染后觀察并記錄數(shù)據(jù)。

1.5??數(shù)據(jù)分析和指紋圖譜構(gòu)建

聚類分析、主成分分析和群體結(jié)構(gòu)分析參考向小華等方法：用DataFormater將讀取的“0，1”數(shù)據(jù)進(jìn)行矩陣轉(zhuǎn)換；用Popgene32軟件計(jì)算觀察等位基因數(shù)（Observed number of alleles）、有效等位基因（Effective number of alleles）等；利用PowerMarker 3.25軟件計(jì)算多態(tài)信息量（Polymorphic Information Content，簡(jiǎn)稱PIC）；利用NTSYS-PC 2.10軟件采用類平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析和主成分分析（PCA）；利用Structure2.3.4軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)12對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，參考王琰琰等指紋圖譜構(gòu)建方法，建立江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)品種資源分子身份證。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?SSR引物篩選

以江蘇中煙需求量大且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的5個(gè)烤煙品種（云煙87、云煙99、紅花大金元、CB-1和中煙100）為樣本，利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)212對(duì)引物進(jìn)行初篩，其中有47對(duì)標(biāo)記帶型清晰且具有多態(tài)性，占篩選標(biāo)記總數(shù)的22.17%；然后以江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)主栽的23個(gè)烤煙品種（表1）為樣本，對(duì)初選的47對(duì)標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，最終篩選出12個(gè)條帶清晰、多態(tài)性高、易于讀帶的SSR標(biāo)記。

2.2 ?遺傳多樣性分析

SSR引物在23份供試材料中共檢測(cè)出37個(gè)基因位點(diǎn)（表2），平均等位基因數(shù)為3.083 3個(gè)。有效等位基因數(shù)在1.714 7～2.806 4之間，平均為2.104 0，有效等位基因所占比例為68.24%。觀測(cè)雜合度的變化范圍為0.342 0～0.573 9；群體平均Shannon’s遺傳多樣性指數(shù)和Nei’s多樣性指數(shù)分別為0.843 3和0.513 1；期望雜合度的平均值為0.524 5；引物的多態(tài)性信息含量在0.333 8～0.571 1之間，平均值為0.433 3，其中PT52358的PIC值最大，表明具有較高的鑒別能力（圖1）。

2.3 ?參試種質(zhì)的聚類分析

聚類分析結(jié)果表明（圖2），除云煙87和云煙301、云煙116和湘煙3號(hào)及湘煙5號(hào)外，利用SSR標(biāo)記可以將剩余烤煙品種相互區(qū)分開(kāi)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.46時(shí)，可將供試品種分為4個(gè)類群。第I類包括云煙87、云煙301、云煙116等10個(gè)品種，均具有K326的遺傳背景；第II類包括云煙105、延安1號(hào)、LY1306等7個(gè)品種，遺傳背景較為豐富；第III類包括云煙99、云煙100、中川208等5個(gè)品種，遺傳背景主要為K326和紅花大金元；第IV類僅包含CB-1這1個(gè)品種。

2.4??主成分分析及遺傳結(jié)構(gòu)分析

分別利用NTSYS軟件和Structure軟件對(duì)供試品種進(jìn)行主成分分析（圖3）和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析（圖4），結(jié)果表明，兩種分析方法均將23個(gè)烤煙品種劃分為2個(gè)類群，除湘煙6號(hào)外，其他品種在2種方式下的分類結(jié)果相同。其中，主成分分析中的類群I和遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群1（紅色部分）均具有K326的遺傳背景，并且在聚類圖中也聚為一個(gè)分支；主成分分析中的類群II和遺傳結(jié)構(gòu)分析中的類群2遺傳背景較為多樣化，且涵蓋了聚類分析中的II、III、IV。

2.5??DNA指紋圖譜及二維碼的構(gòu)建

根據(jù)12對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建了23個(gè)烤煙品種的指紋圖譜和二維碼（表3）。在進(jìn)行煙葉品種鑒別時(shí)，可利用12對(duì)SSR標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果與已有指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，位點(diǎn)差異在1個(gè)及以上的認(rèn)定為不同品種。通過(guò)該方法可確認(rèn)煙草公司調(diào)撥的煙葉品種是否準(zhǔn)確，是否存在品種混雜問(wèn)題。

3 ?討 ?論

作物種質(zhì)資源是支撐農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新和作物遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，2023年中央一號(hào)文件明確把種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)列為重點(diǎn)工作，要求加快構(gòu)建開(kāi)放協(xié)作、共享應(yīng)用的種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定評(píng)價(jià)機(jī)制。水稻、玉米、大麥、高粱、陸地棉以及小麥等13種農(nóng)作物已經(jīng)制定了SSR分子標(biāo)記法的品種鑒定技術(shù)規(guī)程農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。但目前為止，煙草還未制定SSR標(biāo)記法品種鑒定技術(shù)規(guī)程。前人對(duì)于我國(guó)主栽烤煙品種分子鑒定研究中的供試材料數(shù)量普遍較少，隨著我國(guó)烤煙新品種選育工作的不斷推進(jìn)，用于實(shí)際生產(chǎn)的品種范圍也在不斷擴(kuò)大，原有鑒定引物已無(wú)法進(jìn)行有效區(qū)分。因此，本試驗(yàn)結(jié)合江蘇中煙的實(shí)際煙葉收購(gòu)情況，將供試品種擴(kuò)大到23個(gè)，以前人已發(fā)表的研究結(jié)果為基礎(chǔ)，擴(kuò)大引物篩選范圍，最終從212對(duì)SSR引物中篩選出12對(duì)用于DNA指紋圖譜構(gòu)建。引物篩選結(jié)果表明，多數(shù)前人篩選出來(lái)的引物應(yīng)用于本試驗(yàn)時(shí)多態(tài)性較低，無(wú)法進(jìn)行有效區(qū)分，一方面可能與供試種質(zhì)的親緣關(guān)系有關(guān)，另一方面可能與SSR標(biāo)記的檢測(cè)方法有關(guān)。此外，本研究根據(jù)江蘇中煙2022年煙葉種植情況選取了23個(gè)品種進(jìn)行試驗(yàn)，后續(xù)將根據(jù)江蘇中煙原料需求及實(shí)際種植情況，不斷更新完善DNA指紋圖譜，保障煙葉品種鑒定順利進(jìn)行。

我國(guó)主栽烤煙品種大多直接或者間接來(lái)源于G28、K326、紅花大金元和NC82等，存在親本過(guò)度集中、親緣關(guān)系較近等問(wèn)題，容易造成同一生態(tài)區(qū)內(nèi)品種抗性降低。本研究UPGMA聚類分析結(jié)果顯示了與之相似的規(guī)律：遺傳背景相似的品種大都聚在一起。其中云煙87和云煙116的遺傳距離較近，這與丁永亮等和軒貝貝等的結(jié)果一致；CB-1與其他品種的遺傳距離最遠(yuǎn)，這與田陽(yáng)陽(yáng)等研究結(jié)果一致。但是在軒貝貝等研究結(jié)果中，云煙87與K326首先聚在一起，遺傳相似系數(shù)高達(dá)0.9，但在本研究中，二者雖都位于第I類群，但聚類到了不同分支上，這可能與供試材料和SSR標(biāo)記的不同有關(guān)。群體遺傳結(jié)構(gòu)和PCA主成分分析均將供試材料劃分為2個(gè)亞群，且類群內(nèi)具體品種的分布結(jié)果高度一致；3種分析方法中類群I所包含的品種相同，均具有K326遺傳背景，說(shuō)明煙草種質(zhì)間的遺傳差異與其親本來(lái)源密切相關(guān)，此結(jié)果與前人在分子水平上對(duì)烤煙品種資源的研究相吻合?。本研究中所選的12對(duì)引物可以清楚地檢測(cè)出供試品種的遺傳多樣性，類群劃分真實(shí)反映了供試材料的群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系，說(shuō)明該組引物高效可靠，適用于烤煙品種資源鑒定和遺傳多樣性分析。

我國(guó)栽培煙草品種間親緣關(guān)系較近、形態(tài)相似程度高，找到有效鑒定引物是品種區(qū)分的關(guān)鍵。在本研究中，云煙87和云煙301沒(méi)有區(qū)分開(kāi)，原因可能是云煙301是云煙87通過(guò)定向改良技術(shù)選育的抗PVY新品種，二者遺傳背景高度一致；云煙116、湘煙3號(hào)和湘煙5號(hào)也沒(méi)有區(qū)分開(kāi)，這3個(gè)品種都具有K326的親本來(lái)源，遺傳背景比較狹窄。本研究開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記僅分布于9條染色體上，而且分布不均勻；因此，下一步將擴(kuò)大引物篩選范圍，最終形成一套在染色體上分布均勻、多態(tài)性信息含量高的核心引物組，確保每一個(gè)品種有唯一分子身份證。

核心產(chǎn)區(qū)煙葉原料的穩(wěn)定性、一致性是保障工業(yè)公司產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展的關(guān)鍵所在。如何高效率地對(duì)煙葉原料進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，是當(dāng)前工業(yè)公司亟需解決的難點(diǎn)。本研究基于聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，篩選出一套SSR引物集，構(gòu)建了江蘇中煙核心原料產(chǎn)區(qū)主栽品種獨(dú)有的DNA指紋圖譜，為煙葉原料分子鑒定提供了數(shù)據(jù)支撐。下一步將以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建調(diào)撥煙葉品種鑒別技術(shù)體系，并利用該技術(shù)體系完成江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)調(diào)撥煙葉品種鑒定工作，確認(rèn)調(diào)撥煙葉品種是否準(zhǔn)確，是否存在品種混雜的問(wèn)題。實(shí)現(xiàn)從田間管理到收購(gòu)采樣，全流程跟蹤、鑒定核心產(chǎn)區(qū)原料，保障煙葉原料質(zhì)量的穩(wěn)定性和可靠性。

4 ?結(jié) ?論

本研究以江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)主栽的23個(gè)烤煙品種為材料，從212對(duì)SSR引物中最終篩選出12對(duì)多態(tài)性高且條帶清晰的引物。聚類分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)和主成分分析真實(shí)反映了供試材料的親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)，說(shuō)明該組引物高效可靠，可用于烤煙品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析。本研究結(jié)果可為江蘇中煙核心產(chǎn)區(qū)主栽烤煙品種的煙葉原料鑒定提供理論依據(jù)，保障煙葉原料質(zhì)量的穩(wěn)定性、可靠性，為工業(yè)公司產(chǎn)品高質(zhì)量發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

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