基于游離氨基酸的烤煙配打模塊香型判別方法研究

陳紅麗 周航 楊永鋒 胡靜宜 劉茂林 劉向真 賈濤

摘?要：為明確不同香型烤煙配打模塊游離氨基酸組分差異，并實(shí)現(xiàn)對(duì)清香型、中間香型及濃香型烤煙復(fù)烤模塊的準(zhǔn)確分類(lèi)，選取7個(gè)清香型、7個(gè)中間香型和8個(gè)濃香型烤煙配打模塊為研究對(duì)象，對(duì)其游離氨基酸含量進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)合SVM模型進(jìn)行香型判別。結(jié)果表明：不同香型烤煙模塊游離氨基酸總量范圍為13 141.72～27 695.47 μg/g，其中脯氨酸和天冬酰胺含量在各香型中占比最高，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、4-氨基丁酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、色氨酸、精氨酸和游離氨基酸總量在不同香型間存在顯著性差異。丙氨酸和天冬氨酸在OPLS-DA分析中VIP值大于1且在不同香型間差異顯著（<0.05），可篩選為香型判定指標(biāo)?；?1種游離氨基酸的前兩種主成分構(gòu)建的SVM模型對(duì)模塊香型的判別率準(zhǔn)確率為86.36%；基于篩選出的2個(gè)游離氨基酸特征指標(biāo)構(gòu)建的SVM模型判別準(zhǔn)確率為90.91%?；诒彼岷吞於彼岬腟VM模型判別率和可信度都在較高水平，可應(yīng)用于烤煙配打模塊的香型判別。

關(guān)鍵詞：配打模塊；游離氨基酸；差異分析；正交偏最小二乘判別分析法；支持向量機(jī)

中圖分類(lèi)號(hào)：TS411???????????????????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ?????????????????????文章編號(hào)：1007-5119（2023）05-0079-07

Identification Methods for?Flue-cured Tobacco Flavor in Blending and Threshing Module Based on Free Amino Acids

CHEN Hongli，?ZHOU Hang，?YANG?Yongfeng?HU?Jingyi，?LIU?Maolin，?LIU Xiangzhen，?JIA Tao

College of Tobacco Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China;?2. Technology Center， China Tobacco Henan Industrial Co.， Ltd.， Zhengzhou 450000， China;?3. Baofeng Tobacco Redrying Factory，?Tianchang International Co.?Ltd.， Baofeng，?Henan 467400， China）

?Aiming?to clarify the differences of free amino acid components in different flavor types of flue-cured tobacco blending and threshing modules，?and classify?redrying?modules?of fresh?flavor， neutral?flavor and robust?flavor?types， the blending modules of 7 fresh， 7 neutral?and 8 robust?flavor?types?were selected， and their?free amino acid contents were determined?by OPLS-DA?analysis， flavor types were identified by SVM model. Results showed?that?total free amino acids in different flavor types of flue-cured tobacco ranged from 13 141.72 to 27 695.47?μg/g， and the contents of proline and asparagine exhibited?the highest among all flavor types. Significant differences?among different flavor types?occurred in the total amount of aspartate， glutamic acid， glycine， alanine， cystine， leucine， tyrosine， phenylalanine， 4-aminobutyric acid， lysine， histidine， tryptophan， arginine and free amino acid. In OPLS-DA analysis the VIP values of alanine and aspartic acid were above?1 and significantly different among various?flavor types （p<0.05）， hence?could be selected as evaluation indexes. The SVM model based on the first two principal components of 21 free amino acids exhibited an accuracy of 86.36%. The discriminant accuracy of SVM model based on two free amino acid characteristic indexes reached?90.91%. The SVM model based on alanine and aspartic acid exhibited?high discrimination rate and reliability， and can?be applied in?the flavor discrimination of flue-cured tobacco blending modules.

?blending and threshing module; free amino acid; difference analysis; orthogonal partial least squares regression discriminant analysis; support vector machine

基金項(xiàng)目：河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司資助項(xiàng)目（ZW2014003）

作者簡(jiǎn)介：陳紅麗（1979-），女，副教授，博士，主要從事煙草質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail：chenhonglili06@163.com

收稿日期：2023-05-18??????????????修回日期：2023-10-16

烤煙香型長(zhǎng)期以來(lái)一直是區(qū)別烤煙風(fēng)格特征的重要指標(biāo)，同時(shí)也是卷煙企業(yè)確定其產(chǎn)品配方的重要依據(jù)。目前，大多數(shù)對(duì)煙草香型的判定一直建立在評(píng)吸人員感官質(zhì)量評(píng)價(jià)得分上。關(guān)于烤煙香型的機(jī)器判別也有部分研究，如郭東鋒等將隨機(jī)森林法引入烤煙香型分類(lèi)研究中；邱昌桂等提出了基于致香成分結(jié)合GA-SVM算法的識(shí)別方法；李超等利用不同香型烤煙中114種化學(xué)指標(biāo)建立Bayes定量判別模型，篩選出不飽和醛酮、氨基酸、堿、細(xì)胞壁物質(zhì)等的含量，對(duì)煙葉香型判別具有良好的預(yù)測(cè)能力。但目前對(duì)于香型判別仍缺少高效識(shí)別模型，且未驗(yàn)證模型的適用性。

游離氨基酸是煙草中重要的含氮化合物之一，對(duì)煙草味道和煙氣的豐滿(mǎn)度有較大影響^[5-6]。在調(diào)制和醇化過(guò)程中，煙葉中的氨基酸會(huì)與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成一系列醛類(lèi)、醇類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)等對(duì)煙草香味有重要影響的化合物。一般認(rèn)為，游離氨基酸含量過(guò)高，抽吸時(shí)刺激性強(qiáng)烈；含量過(guò)低，則煙氣勁頭不足，豐滿(mǎn)度差。過(guò)偉民等研究了烘烤過(guò)程中游離氨基酸含量組分的變化，游離氨基酸總體與煙葉質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，其中苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸、脯氨酸和天冬酰胺四種組分在烘烤過(guò)程中變化最大，與煙葉品質(zhì)相關(guān)性最高；孫曉偉等分析了不同海拔對(duì)烤煙中游離氨基酸的影響，游離氨基酸含量均以脯氨酸含量最高，谷氨酸和天冬氨酸含量次之，且變異系數(shù)較大，對(duì)烤煙質(zhì)量影響較高；彭振興等研究表明不同種植區(qū)域烤煙游離氨基酸存在顯著差異，脯氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸和色氨酸六種氨基酸組分在區(qū)域間存在顯著差異，且清香型產(chǎn)區(qū)游離氨基酸含量低于濃香型產(chǎn)區(qū)?？梢?jiàn)，不同香型煙葉氨基酸含量具有較大差異，有可能成為區(qū)分煙葉香型的特征指標(biāo)。因此，本研究以7個(gè)清香型烤煙配打模塊、7個(gè)中間香型烤煙配打模塊和8個(gè)濃香型烤煙配打模塊為研究對(duì)象，采用正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA分析）和支持向量機(jī)（Support Vector Machine， SVM）分類(lèi)判別模型，探索不同香型配打模塊游離氨基酸含量的差異性及變化趨勢(shì)，以期篩選出判別香型的游離氨基酸指標(biāo)，為工業(yè)企業(yè)原料采購(gòu)和配方調(diào)整提供理論依據(jù)，保障卷煙質(zhì)量穩(wěn)定。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

選取河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司2018年具有代表性的7個(gè)清香型烤煙配打模塊，煙葉分別產(chǎn)自四川、福建、云南地區(qū)；7個(gè)中間香型烤煙配打模塊，煙葉分別產(chǎn)自貴州、黑龍江、重慶地區(qū)；8個(gè)濃香型烤煙配打模塊，煙葉來(lái)自河南產(chǎn)區(qū)。每種原料各10 kg，所有樣品均為多等級(jí)混合打葉后的片煙，經(jīng)各中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心收集，統(tǒng)

一復(fù)烤后制成。

1.2 ?試驗(yàn)方法

參考YC/T 282—2009和文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定游離氨基酸含量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 27.0；利用SIMCA14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），根據(jù)變量重要性投影（VIP）挑選差異物質(zhì)；采用R語(yǔ)言軟件“ggplot2”包進(jìn)行主成分分析（PCA）結(jié)果提取和可視化作圖，結(jié)合支持向量機(jī)（SVM）建立判別模型并對(duì)所選特征指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。

2??結(jié) ?果

2.1??不同香型烤煙模塊游離氨基酸含量分析

對(duì)3種香型烤煙模塊的21種游離氨基酸進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表1。清香型烤煙模塊各游離氨基酸含量范圍為2.94～7 679.44?μg/g，中間香型烤煙模塊為3.96～8 465.70 μg/g，濃香型烤煙模塊為6.30～12 093.79?μg/g，3種香型中脯氨酸（Pro）含量最高，其次為天冬酰胺（Asn），蛋氨酸（Met）含量最低。3種不同香型烤煙模塊在天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、賴(lài)氨酸（Lys）、4-氨基丁酸（4-Gaba）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、色氨酸（Trp）、精氨酸（Arg）及游離氨基酸總量上存在顯著性差異（＜0.05），且濃香型烤煙模塊＞中間香型烤煙模塊＞清香型烤煙模塊含量；蘇氨酸（Thr）、天冬酰胺（Asn）、谷酰胺（Gln）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）和脯氨酸（Pro）含量在不同香型模塊中存在極顯著性差異（＜0.01），濃香型模塊含量極顯著高于清香型和中間香型烤煙模塊，但清香型和中間香型之間差異不顯著。由圖1可知，3種香型烤煙模塊游離氨基酸總量基本呈正態(tài)分布，從主峰態(tài)勢(shì)來(lái)看，濃香型烤煙模塊游離氨基酸含量和其余兩模塊間存在顯著性差異，清香型烤煙模塊和中間香型烤煙模塊間游離氨基酸含量存在差異，但不顯著。

2.2??不同香型模塊游離氨基酸成分OPLS-DA分析

2.2.1??不同香型模塊游離氨基酸OPLS-DA得分圖 ?不同香型烤煙模塊特征圖譜OPLS-DA得分（圖2和圖3）顯示，從各模塊樣品點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的表征上可以看出，不同香型烤煙模塊間氨基酸含量有顯著差異，22個(gè)烤煙模塊被明顯分為3類(lèi)。本次OPLS-DA模型分析中的自變量擬合指數(shù)（）為0.991，表明主成分對(duì)矩陣信息的解釋能力為99.1%；因變量擬合指數(shù)（）為0.867，表明預(yù)測(cè)主成分對(duì)矩陣信息的解釋能力為86.7%，模型預(yù)測(cè)能力為0.663，和超過(guò)0.5表示模型具有良好的解釋程度和預(yù)測(cè)能力（和數(shù)值越接近1說(shuō)明模型越準(zhǔn)確越可靠）。為了檢驗(yàn)OPLS-DA模型有無(wú)過(guò)擬合，進(jìn)行隨機(jī)分組200次的置換檢驗(yàn)對(duì)模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖4。通過(guò)驗(yàn)證圖（圖4）可以看出，模型結(jié)果參數(shù)的回歸線與縱軸的相交點(diǎn)為?0.916，小于0，表明模型較可靠，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。總的來(lái)說(shuō)，模型驗(yàn)證有效，結(jié)果可用于不同香型烤煙模塊游離氨基酸的鑒別分析。

2.2.2??不同香型烤煙模塊游離氨基酸特征指標(biāo)篩選 ?圖5為OPLS-DA模型中游離氨基酸各指標(biāo)的VIP圖。VIP值越大，說(shuō)明與香型差異的相關(guān)性越高，對(duì)解釋變量的貢獻(xiàn)率越大。以VIP值大于1作為具有顯著貢獻(xiàn)變量的篩選標(biāo)準(zhǔn)。由圖5可以看出，有4個(gè)游離氨基酸指標(biāo)對(duì)變量解釋的貢獻(xiàn)率較大（VIP>1），按照貢獻(xiàn)率由大到小的順序排列分別為纈氨酸（Val）、丙氨酸（Ala）、異亮氨酸（Ile）和天冬氨酸（Asp）。結(jié)合表1數(shù)據(jù)可知，天冬氨酸（Asp）和丙氨酸（Ala）含量在不同香型間存在顯著性差異，可作為區(qū)分不同香型烤煙模塊游離氨基酸的特征指標(biāo)。

2.3??不同香型配打模塊游離氨基酸特征指標(biāo)驗(yàn)證

使用主成分分析對(duì)21種游離氨基酸組分進(jìn)行降維處理，得到不同香型配打模塊前2個(gè)主成分的得分散點(diǎn)圖（圖6）。其中清香型和中間香型烤煙模塊有重疊區(qū)域，但都有一定的分散傾向；濃香型烤煙模塊與其他兩模塊間區(qū)別顯著。圖7為各主成分可解釋變異圖，從中可看出PC1>PC2>PC3>PC4，其中PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為81.8%、8.6%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到90.4%，因此選取PC1、PC2分析樣本具有較好的可靠性。SVM模型依據(jù)前2個(gè)主成分，并將樣本隨機(jī)分為70%訓(xùn)練集和30%測(cè)試集，采用線性核函數(shù)“l(fā)inear”，其SVM模型判別率達(dá)到86.36%（圖8），認(rèn)為這21種游離氨基酸組分能夠用于判定不同香型烤煙模塊。

應(yīng)用丙氨酸和天冬氨酸建立SVM模型，并從樣本中隨機(jī)挑選70%組合構(gòu)成訓(xùn)練集，挑選30%構(gòu)成測(cè)試集，觀察預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果表明SVM模型在線性核函數(shù)“radial”下，判別準(zhǔn)確率為90.91% （圖9），認(rèn)為丙氨酸和天冬氨酸2個(gè)特征指標(biāo)可用于區(qū)分不同香型烤煙配打模塊，且其判別準(zhǔn)確率高于應(yīng)用21種氨基酸進(jìn)行的判別。

3??討??論

游離氨基酸是蛋白質(zhì)代謝的重要中間產(chǎn)物，是影響煙葉品質(zhì)的重要含氮化合物之一。本研究中，游離氨基酸總量表現(xiàn)為濃香型烤煙模塊＞中間香型烤煙模塊＞清香型烤煙模塊，這與賈國(guó)濤等研究結(jié)果一致。相關(guān)研究表明，谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phe），約占總游離氨基酸含量的70%，且濃香型烤煙中脯氨酸（Pro）、天冬酰胺（Asn）含量較高，與本研究結(jié)果基本相同。

本研究通過(guò)OPLS-DA建模，有效地從21種游離氨基酸中篩選出4種香型VIP值大于1的4個(gè)組分，結(jié)合差異顯著性分析，確定丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）2個(gè)特征指標(biāo)。本文以21種游離氨基酸建立了清香型、中間香型和濃香型配打模塊煙葉的SVM分類(lèi)判別模型，對(duì)不同香型的判別正確率為86.36%；而應(yīng)用上述確定的2個(gè)游離氨基酸特征指標(biāo)構(gòu)建的SVM模型判別準(zhǔn)確率為90.91%，高于應(yīng)用21種氨基酸建立的模型。因此不同配打模塊煙葉香型可以主要依據(jù)丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）的含量來(lái)進(jìn)行判別，從而大大減少需要測(cè)定的指標(biāo)數(shù)量。郭東鋒等和李超等研究樣品量較大，彼此所提的表征指標(biāo)差別很大，且均采用單一方法建模，本研究先通過(guò)OPLS-DA實(shí)現(xiàn)樣品的差異鑒別，同時(shí)獲得樣品差異的特征指標(biāo)，再通過(guò)SVM算法驗(yàn)證指標(biāo)的合理性，其結(jié)果為簡(jiǎn)化配打模塊香型分類(lèi)提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)了不同香型配打模塊快速、準(zhǔn)確的判別分類(lèi)。

4 ?結(jié)??論

對(duì)不同香型的烤煙配打模塊中游離氨基酸組分進(jìn)行OPLS-DA分析，結(jié)合差異顯著性分析篩選出2個(gè)特征指標(biāo)丙氨酸（Ala）和天冬氨酸（Asp）。以其建立的SVM模型對(duì)不同香型的判別正確率為90.91%，高于以21種氨基酸主成分建立的SVM模型（86.36%），可以作為區(qū)分不同香型配打模塊的特征物質(zhì)，具有在工業(yè)企業(yè)推廣應(yīng)用的潛在價(jià)值。

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