鈣的生物利用度與多肽螯合鈣研究進(jìn)展

劉佳琛，程永強(qiáng)，唐 寧

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

人體中正常的生理過程會(huì)涉及22 種無機(jī)元素，其中鈣是含量最豐富的無機(jī)元素之一，占人體總重的1.5%～2.2%[1]。鈣與人體內(nèi)許多重要的生物學(xué)功能息息相關(guān)，如肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)、腺體分泌和骨結(jié)構(gòu)支撐等[2-3]。人體中大約99%的鈣儲(chǔ)存在骨骼和牙齒中，剩余1%的鈣則存在于細(xì)胞內(nèi)液和細(xì)胞外液中[4]。當(dāng)身體的鈣攝入量不足時(shí)，鈣就會(huì)從骨骼中釋放出來，患骨質(zhì)疏松癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)增加[5]。充足的鈣攝入可以降低慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，且因?yàn)樵陬A(yù)防骨質(zhì)疏松癥、高血壓、結(jié)腸癌和其他疾病風(fēng)險(xiǎn)方面的作用使得鈣贏得了“超級(jí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”的稱號(hào)[6-7]。食物是人體鈣攝入的主要來源，且人體中絕大部分的鈣（90%左右）都是在小腸當(dāng)中被吸收。然而并不是所有食物中的鈣都能被完全吸收，食物中的鈣組分經(jīng)胃酸消化溶解成離子形式后轉(zhuǎn)運(yùn)至微堿性的十二指腸[8]，隨著小腸腸段pH 的不斷升高，離子鈣發(fā)生沉淀，造成鈣的生物利用度降低。生物利用度是指食物中的某種營(yíng)養(yǎng)成分被實(shí)際吸收和利用的部分所占的比例[9]。人體中最常見的鈣的可利用形式是離子鈣[10]，鈣的生物利用度可以被很多內(nèi)源性因素如年齡、疾病、激素、生理?xiàng)l件（懷孕、哺乳、絕經(jīng)等）和腸道微生物等影響，也可以被膳食中其他營(yíng)養(yǎng)成分（如脂肪、植酸鹽）等外源性因素所影響。

部分有機(jī)鈣鹽（如葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣）是比較良好的鈣補(bǔ)充劑，其可以在動(dòng)力學(xué)層面（如沉淀速率、鈣鹽復(fù)合物形成和解離速率等）抑制鈣離子在堿性腸道環(huán)境中產(chǎn)生的沉淀[11]。此外，多肽和一些氨基酸（如天冬氨酸和谷氨酸）[12]被視作很好的鈣結(jié)合配體，而且無論是氨基酸螯合鈣還是多肽螯合鈣，二者都能在小腸中pH 不斷升高的環(huán)境下保持可溶的狀態(tài)。然而螯合鈣的吸收率主要取決于其所結(jié)合的配體。與氨基酸相比，肽配合物有著許多優(yōu)勢(shì)，比如能量消耗少、運(yùn)輸速度加快、載體不容易飽和等[13]。從牛奶當(dāng)中提取出來的酪蛋白磷酸肽（CPPs）已經(jīng)被證實(shí)可以和鈣離子結(jié)合形成可溶性的穩(wěn)定復(fù)合物從而增強(qiáng)鈣的吸收[14-15]。因此，多肽螯合鈣可能是改善人體胃腸道鈣吸收的合適鈣補(bǔ)充劑候選者。

本文綜述了食物基質(zhì)成分對(duì)鈣的生物利用度的影響，并就葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣等有機(jī)鈣鹽和多肽螯合鈣的促鈣吸收機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)，旨在為鈣離子的吸收和新一代鈣補(bǔ)充劑的研發(fā)提供思路。

1 鈣的生理功能

鈣離子是人體內(nèi)分布最廣泛的礦物質(zhì)，也是研究最多的、與人體健康息息相關(guān)的礦物質(zhì)元素之一[1]。人類剛出生時(shí)體內(nèi)的鈣含量為25～30 g，成年后體內(nèi)的鈣含量可以達(dá)到1000～1500 g[16]。鈣在人體內(nèi)無法自發(fā)合成，生長(zhǎng)發(fā)育所需要的鈣以及日常鈣損失的補(bǔ)償都需要從外源性食物中獲得[17]。99%的鈣都以羥基磷灰石的形式存在于骨骼和牙齒中，并通過對(duì)骨骼系統(tǒng)提供剛性支持來發(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)功能[18]。剩余1%的鈣主要存在于軟組織和體液當(dāng)中（如血液和細(xì)胞外液）。在軟組織當(dāng)中，鈣主要存在于細(xì)胞質(zhì)中的各個(gè)細(xì)胞器[19]；在血液中，鈣以三種不同的形式存在：50%以游離陽離子形式存在，40%與血漿蛋白結(jié)合，10%溶解后與其他離子（如檸檬酸鹽和乳酸）結(jié)合形成復(fù)合物[20]。健康受試者的血清鈣濃度通常維持在1.0～1.2 mmol/L 左右，并經(jīng)由甲狀旁腺激素、維生素D 和降鈣素的作用控制，分別調(diào)節(jié)腸道鈣吸收、腎臟鈣排泄或重吸收、以及骨骼鈣流失與鈣沉積等[21]。除結(jié)構(gòu)功能外，鈣還參與很多生理功能，如受精、血液凝固、肌肉收縮、神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、激素分泌、細(xì)胞死亡、免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化和酶活力調(diào)節(jié)等[22-24]。獲得和保留體內(nèi)所需量的鈣對(duì)于兒童骨骼的發(fā)育、強(qiáng)度和密度以及預(yù)防老年人骨質(zhì)流失和骨質(zhì)疏松性骨折至關(guān)重要。攝入足夠的鈣也有助于降低不同慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如高血壓、高膽固醇血癥、結(jié)腸癌、腎結(jié)石和腹部肥胖等[25-27]。當(dāng)然，僅攝入足量的鈣并不一定能滿足實(shí)現(xiàn)這些生理功能，因?yàn)槿梭w攝入的鈣需要被吸收之后才能發(fā)揮作用。

2 鈣的生物利用度

評(píng)估一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度首先要評(píng)估其生物可及性。生物可及性通常適用于體外礦物質(zhì)生物利用度研究，指食物基質(zhì)經(jīng)胃腸道消化后所能釋放出來的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)組分[28]，但是并不包括礦物質(zhì)在腸道內(nèi)的吸收[29]?；诖?，Cian 等[30]和Wang 等[31]通過體外模擬消化實(shí)驗(yàn)中的可溶性組分來確定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物可及性。部分鈣鹽和鈣肽復(fù)合物可以顯著提高鈣離子進(jìn)入腸腔內(nèi)的生物可及性[32]，但這并不意味著其一定會(huì)提高鈣的生物利用度，這是因?yàn)橐环N營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度除了包含其生物可及性，還包括其正常生理代謝過程中經(jīng)腸道細(xì)胞吸收和利用的部分[17]，甚至是穿越腸道屏障到達(dá)目標(biāo)組織的部分[29]。鈣的生物利用度受內(nèi)源性因素和外源性因素兩方面的影響。內(nèi)源性因素主要包括如年齡、疾病[33-34]、激素[35]、腸道微生物[36]、生理?xiàng)l件（懷孕、哺乳、絕經(jīng)等）[37]等方面，外源性因素（表1）主要是指日常膳食營(yíng)養(yǎng)。正常生理狀態(tài)下鈣的生物利用度主要受外源性因素的影響。常量營(yíng)養(yǎng)素和微量營(yíng)養(yǎng)素會(huì)在一定程度上改善或紊亂鈣的吸收。

表1 影響鈣生物利用度的外源性因素Table 1 Exogenous factors affecting calcium bioavailability

2.1 脂肪

維生素D 是鈣吸收過程中必不可少的激素之一[38-40]，而脂肪對(duì)脂溶性維生素D 的生物利用度有一定程度的影響。一般來說，脂類可以促進(jìn)食物親脂性成分的吸收，是脂溶性微量營(yíng)養(yǎng)素傳遞的關(guān)鍵物質(zhì)。首先，脂質(zhì)作為疏水相可以溶解脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促使其從食物基質(zhì)中擴(kuò)散；然后通過刺激膽汁分泌，產(chǎn)生消化酶催化水解脂質(zhì)并釋放脂肪酸、單甘油酯和磷脂，進(jìn)一步溶解親脂性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生大量膠束；最后，這些脂質(zhì)介導(dǎo)親脂性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，避免了腸上皮細(xì)胞中維生素D 的積累，從而增加胃腸道對(duì)維生素D 的吸收。整個(gè)過程取決于脂肪（甘油三酯）的數(shù)量和脂肪酸的類型等[41]。在體外研究中檢測(cè)了兩種高脂肪飲食—富含飽和或單不飽和脂肪酸的飲食，以及低脂肪飲食對(duì)鈣吸收的影響。結(jié)果表明富含飽和脂肪酸飲食對(duì)鈣吸收作用的促進(jìn)效果最好[42]。然而，盡管如此，飽和脂肪酸對(duì)骨骼健康的影響小于同等比例的單不飽和脂肪酸或脂肪含量正常的飲食。有研究發(fā)現(xiàn)添加單不飽和脂肪酸的小鼠Calbindin-D9k（鈣結(jié)合蛋白）腸道基因表達(dá)水平和小梁狀軟骨體積厚度顯著高于未修飾飲食的小鼠。因此，富含單不飽和脂肪酸的飲食對(duì)骨骼健康最有益，并能適度增加腸道鈣的吸收[43]。

2.2 乳糖

乳制品是乳糖和鈣的主要膳食來源[44]。低乳制品飲食是鈣缺乏的一個(gè)重要因素，其會(huì)對(duì)骨代謝產(chǎn)生不利影響[45]。生理濃度下乳糖對(duì)牛奶中鈣的吸收沒有顯著影響[46-47]，而高劑量的乳糖（50 g/d）在一定程度上會(huì)影響鈣吸收[48]。

2.3 膳食纖維

膳食纖維本身（纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和非纖維素多糖）似乎對(duì)鈣的生物利用度沒有直接影響。一些難以消化的膳食纖維已被證明可以通過增強(qiáng)細(xì)菌發(fā)酵來降低腸道中的pH，增加鈣離子的溶解度[49]。還可以通過酸化腸道環(huán)境，限制有關(guān)磷酸鹽的形成，從而增加鈣吸收，因?yàn)殁}可以和部分磷酸鹽產(chǎn)生沉淀[50]。膳食纖維攝入對(duì)骨骼結(jié)構(gòu)和代謝的影響與性別有關(guān)，其原因可能是膳食纖維降低了腸道中β-葡萄糖醛酸酶的活性，導(dǎo)致雌激素重吸收的減少，從而降低骨密度[51]。

2.4 磷

飲食中鈣與磷的比例應(yīng)該保持在1.3:1 到2:1之間。低于或高于這一比例會(huì)造成人體一系列的疾病，如生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、食欲減退、皮膚屏障或肌肉力量受損，嚴(yán)重情況下甚至可以導(dǎo)致死亡[52]。低磷飲食即使鈣充足，也會(huì)導(dǎo)致表觀消化率和腎臟磷排泄的下降，以及鈣排泄的顯著增加[52]。鈣磷比2:1 是維持骨骼生長(zhǎng)發(fā)育和骨保護(hù)素含量平衡的最佳比例[53]。

2.5 植酸和草酸

食物中的植酸鹽又被稱作肌醇六磷酸鹽（IP6），是植物中磷和肌醇的一種儲(chǔ)存形式[54]。植酸主要存在于谷物、豆類、堅(jiān)果和種子中，在胃中酸性pH 的條件下可以與鈣形成可溶性配合物，在微堿性的腸道中發(fā)生沉淀[55]。與植酸類似，草酸作為一種存在于蔬菜中的強(qiáng)有機(jī)酸，其可以與鈣形成水不溶性鹽，造成鈣生物利用度的降低[56]。

2.6 酪蛋白

酪蛋白在消化過程中會(huì)產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽（CPPs），CPPs 除了具有抗菌、防齲齒、細(xì)胞調(diào)節(jié)和免疫調(diào)節(jié)特性外，還可以轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子并增加其生物利用度[57]。Sun 等[58]和Luo 等[59]的研究已經(jīng)證實(shí)，CPPs 可以阻止腸道內(nèi)鈣離子的沉淀，且從CPPs 混合物中分離出來的單體肽“Ser（p）-Ser（p）-Ser（p）-Glu-Glu”具有最大的鈣結(jié)合能力，它可以同時(shí)結(jié)合6 個(gè)鈣離子。通過核殼細(xì)胞外微粒遞送的CPPs-殼聚糖低聚糖-三聚磷酸是鈣補(bǔ)充劑中一種很有前途的成分，其可以逐步釋放鈣離子，增加鈣的吸收時(shí)間，通過調(diào)節(jié)鈣的可控釋放增強(qiáng)其在腸道中的生物利用度[60]。

3 鈣補(bǔ)充劑

通常情況下，人主要通過膳食的方式來攝入和補(bǔ)充體內(nèi)所需要的鈣。如果膳食鈣的攝入量不足，鈣補(bǔ)充劑可以幫助預(yù)防或治療鈣缺乏癥[61]，特別是對(duì)于老年人或絕經(jīng)后的婦女，服用適當(dāng)?shù)拟}補(bǔ)充劑可以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[51,62]。鈣補(bǔ)充劑可以以不同形式的鈣鹽存在，此外，已經(jīng)有大量的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明食物蛋白中的多肽與鈣的螯合產(chǎn)物作為鈣補(bǔ)充劑的應(yīng)用潛力[1,63]。

3.1 鈣鹽

比較常見的鈣鹽有碳酸鈣、葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣和乳酸鈣。與其他鈣鹽相比，碳酸鈣的鈣元素含量最高（40%），同時(shí)也是市場(chǎng)上較為便宜的鈣源[64-65]，但是其溶解度較差，生物利用度較低，且長(zhǎng)期服用副作用明顯，會(huì)給人體帶來比較嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[66]。相比于碳酸鈣，羥基羧酸鈣鹽（葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣等）具有更高的生物利用度。

鈣主要在小腸當(dāng)中被吸收。食物當(dāng)中的鈣經(jīng)胃酸消化溶解成離子形式后轉(zhuǎn)運(yùn)至堿性環(huán)境的小腸當(dāng)中，容易產(chǎn)生離子鈣的沉淀（如鈣與食物中的植酸、草酸和磷酸等結(jié)合），導(dǎo)致生物利用率降低[67]。一些天然配體，如部分水解的蛋白質(zhì)、多肽以及羥基羧酸鹽等可以與小腸中已經(jīng)沉淀的鈣復(fù)合物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，增強(qiáng)鈣的吸收效果，盡管部分配體可能與鈣發(fā)生強(qiáng)絡(luò)合從而降低游離鈣的濃度[11]。Pak 等[68]發(fā)現(xiàn)，相較于檸檬酸鈣（二檸檬酸三鈣，檸檬酸和鈣摩爾比為1:1.5）化合物，由氫氧化鈣和檸檬酸制備的“檸檬酸鈣”混合物（檸檬酸和鈣的摩爾比為1:1.25）具有更高的溶解度以及鈣生物利用度，這充分證明了鈣在腸道中的“存在形式”對(duì)其生物利用度的重要性。在模擬腸道環(huán)境的條件下，葡萄糖酸鈉在飽和乳酸鈣溶液中等溫溶解會(huì)自發(fā)產(chǎn)生十分穩(wěn)定的葡萄糖酸鈣過飽和溶液，鈣離子活度不變，濃度增加，這主要是由于羥基羧酸鹽配體可以和沉淀物的固體表面發(fā)生反應(yīng)[69-70]。腸道中鈣鹽的過飽和溶液的形成對(duì)增強(qiáng)鈣離子吸收的重要性還沒有得到足夠多的研究。過飽和鈣鹽溶液中高濃度的鈣離子會(huì)在腸道中形成較高的滲透壓，從而增加鈣在小腸中擴(kuò)散的驅(qū)動(dòng)力[71]。此外，盡管和氯化鈣一樣，檸檬酸鈣、葡萄糖酸鈣會(huì)在胃酸中完全解離，但是后者鈣的吸收效率卻遠(yuǎn)高于氯化鈣[72]。這可能與羥基羧酸鈣鹽的解離速率有關(guān)，其在胃中發(fā)生解離后在腸道中重組形成羥基羧酸鈣復(fù)合物的速率比鈣離子在堿性腸道環(huán)境下的沉淀速率更高，因此具有更高的生物利用度。

3.2 多肽螯合鈣

氨基酸和多肽可以幫助保持鈣的離子形式，增加鈣離子在堿性腸道環(huán)境下的溶解度，對(duì)鈣的吸收有著積極的影響[73]。Asp 和Glu 是鈣結(jié)合能力最強(qiáng)的氨基酸[74]，但是與食物中的活性蛋白質(zhì)多肽相比，其鈣的結(jié)合能力依然較弱。Vavrusova 等[75]的研究表明，Asp 和Glu 可以互相結(jié)合成四種不同的二肽（Asp-Asp/Asp-Glu/Glu-Glu/Glu-Asp），四種二肽與鈣的結(jié)合常數(shù)Ka 表明，在兩種離子強(qiáng)度下，與單個(gè)氨基酸相比，它們對(duì)鈣具有更高的親和力，對(duì)Ser 和二肽Ser-Glu 鈣親和力的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。迄今為止，研究人員已經(jīng)從多種不同的食物來源中分離得到了具有活性的多肽螯合鈣，如太平洋鱈魚皮蛋白[76]，南極磷蝦蛋白[77]，羅非魚蛋白[78]，大豆蛋白[79]和蛋清蛋白[80]等。鈣肽螯合物是十分理想的鈣補(bǔ)充劑，容易被胃腸道吸收，且具有十分良好的穩(wěn)定性[32]。酪蛋白磷酸肽（CPPs）因?yàn)槠淞己玫难a(bǔ)鈣效果現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)[15]。

4 多肽螯合鈣的結(jié)合機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系

一般來說，多肽和鈣之間的結(jié)合反應(yīng)是在特定的溫度和時(shí)間下將多肽溶液與氯化鈣攪拌混合來完成的。反應(yīng)過程中需要調(diào)節(jié)pH 來使相應(yīng)的鈣結(jié)合基團(tuán)去質(zhì)子化，這是因?yàn)槿ベ|(zhì)子化殘基更有利于結(jié)合鈣離子[81]。在胃腸道消化過程中，由于胃中的強(qiáng)酸性環(huán)境，導(dǎo)致多肽的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生質(zhì)子化，不利于多肽和鈣的結(jié)合；而在小腸的堿性環(huán)境中，由于pH 大于多肽部分氨基酸殘基的pKa，使得多肽中鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生去質(zhì)子化，更有利于和鈣的結(jié)合[82]。這就意味著盡管小腸當(dāng)中的堿性環(huán)境會(huì)降低游離鈣的溶解度甚至產(chǎn)生沉淀，但卻有利于多肽和鈣的結(jié)合，這也是多肽螯合鈣優(yōu)于其他鈣補(bǔ)充劑的原因之一。

4.1 多肽和鈣的結(jié)合原則

多肽與鈣結(jié)合的先決條件是作為電子供體的多肽和電子受體的鈣之間，存在一個(gè)或多個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，因此肽可以被看作是路易斯酸，鈣可以看做是路易斯堿，肽與鈣之間發(fā)生的反應(yīng)是因?yàn)槁芬姿顾釅A之間的相互作用。在結(jié)構(gòu)上，鈣離子屬于鈣肽螯合物的一部分[5]。鈣與肽結(jié)合形成復(fù)合物后，鈣的物理化學(xué)性質(zhì)會(huì)發(fā)生一定程度的變化，配體多肽和鈣之間互相共享部分各自的屬性，同時(shí)保留部分自己獨(dú)有的物理化學(xué)性質(zhì)[83]。

鈣肽復(fù)合物的形成主要受以下因素的影響：多肽鏈中能形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)、空間位阻、以及形成復(fù)合物所需要的能量限制[84]，其特異性與氨基酸的空間分布與排列有關(guān)[85]，即鈣肽復(fù)合物中可以形成共價(jià)配位鍵的官能團(tuán)的位置。因此，通過改變多肽序列中的氨基酸殘基，可以增加或減少鈣與多肽之間的相互作用[86]。此外，多肽表面的電荷還會(huì)影響其與鈣離子結(jié)合之后的穩(wěn)定性[87]。原子結(jié)構(gòu)、共價(jià)鍵或離子鍵、鈣或多肽之間連接的配位層都會(huì)影響多肽螯合鈣的生物利用度[83]。

4.2 多肽和鈣的結(jié)合位點(diǎn)

鈣與肽的結(jié)合主要依賴于多肽鏈上的活性位點(diǎn)，分子間作用力主要包含共價(jià)鍵、氫鍵、靜電引力和疏水相互作用[1,88-90]。目前的研究表明，多肽鏈上結(jié)合鈣離子的主要活性位點(diǎn)為磷酸基、羧基和氨基[91-92]。

4.2.1 磷酸基 磷酸化修飾有助于鈣離子與多肽的結(jié)合，而磷酸化絲氨酸是鈣離子的主要結(jié)合位點(diǎn)[93]。其中最具代表性的磷酸基-鈣結(jié)合模式是酪蛋白磷酸肽（CPPs）和卵黃高磷蛋白磷酸肽（PPPs）[94-95]。

CPPs 作為鈣鰲合肽的作用機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究。CPPs 是酪蛋白衍生的磷酸化肽，包含一段高極性序列（SpSpSpEE），由三個(gè)磷酸化絲氨酸殘基和兩個(gè)谷氨酸殘基組成，是CPPs 中鈣的結(jié)合活性位點(diǎn)，能夠促進(jìn)鈣的吸收[96]。PPPs 比CPPs 含有更豐富的磷酸化絲氨酸殘基，已經(jīng)有研究證明了PPPs 的鈣結(jié)合能力以及同磷酸鈣鹽沉淀競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合以增加鈣離子溶解度的關(guān)鍵因素是PPPs 中磷酸基團(tuán)的含量，且最佳含量為35%左右[97]。

磷酸肽與鈣結(jié)合性質(zhì)之間的關(guān)系已經(jīng)得到了廣泛的研究。Jiang 等[98]的研究表明磷酸肽的分子大小對(duì)鈣離子的結(jié)合至關(guān)重要。小于1 kDa 的磷酸肽片段和沒有磷酸化的絲氨酸與鈣離子的結(jié)合能力很弱，而1～3 kDa 的磷酸肽片段甚至比CPPs 具有更強(qiáng)的鈣結(jié)合能力。Luo 等[99]的研究也得到了類似的結(jié)果，具有較強(qiáng)鈣結(jié)合能力的P-CP（磷酸化魚骨膠原肽）其分子量大小主要分布在0.5～3 kDa 范圍內(nèi)。Zong等[100]以0～3 個(gè)連續(xù)或不連續(xù)的磷酸化絲氨酸為樣品，合成6 種不同的磷酸肽，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含有3 個(gè)磷酸化絲氨酸殘基的磷酸肽的鈣結(jié)合能力最強(qiáng)，且連續(xù)的磷酸化絲氨酸殘基比不連續(xù)的磷酸化絲氨酸殘基具備更強(qiáng)的鈣結(jié)合能力。

4.2.2 羧基和氨基 根據(jù)鈣與肽的結(jié)合常數(shù)，一些非磷酸化的肽可能比CPPs 具有更強(qiáng)的鈣結(jié)合能力，表明相對(duì)于活性肽中的磷酸基團(tuán)而言，氨基酸序列對(duì)鈣結(jié)合力的影響可能占據(jù)了主導(dǎo)地位[79-80]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多不含磷酸基團(tuán)的、具有較強(qiáng)鈣結(jié)合能力的生物活性肽。Bao 等[101]研究了大豆蛋白水解物中鈣結(jié)合能力與羧基含量之間的關(guān)系。結(jié)果表明，結(jié)合鈣的含量隨著羧基含量的增加呈線性增加，且最可能的結(jié)合位點(diǎn)位于Asp 和Glu 的羧基。Zhang 等[102]從太平洋鱈魚骨凝膠水解分離出一種新的鈣結(jié)合KGDPGLSPGK，通過圓二色譜、傅立葉紅外光譜（FTIR）等技術(shù)對(duì)肽和鈣的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)Asp 羧基的氧原子和Lys 側(cè)鏈氨基的氮原子參與了螯合作用。Liu 等[103]從小麥胚芽蛋白中分離出多肽FVDVT，與鈣結(jié)合后，肽鏈中N-H 鍵的伸縮振動(dòng)向高波數(shù)方向移動(dòng)，表明由于誘導(dǎo)效應(yīng)或偶極場(chǎng)效應(yīng)，N-H 鍵附近的電子云密度增加；FTIR 中C=O 和COO—的伸縮振動(dòng)變化表明FVDVT 中的酰胺鍵和羧基氧參與了和鈣的結(jié)合。Cui 等[104]對(duì)NDEELNK肽進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其結(jié)合鈣離子后酰胺Ⅰ帶（C=O 的伸縮振動(dòng)）從1668.12 cm-1轉(zhuǎn)移到了1667.90 cm-1，酰胺Ⅱ帶（N-H 彎曲和C-N 伸縮振動(dòng)）從1544.31 cm-1轉(zhuǎn)移到了1557.67 cm-1，表明多肽NDEELNK 中的羧基氧和氨基氮和鈣離子之間發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)。對(duì)乳清蛋白水解產(chǎn)物二肽GY 的核磁共振研究結(jié)果顯示，GY 與鈣結(jié)合后兩個(gè)氨基酸的α-碳處的質(zhì)子信號(hào)發(fā)生了0.025 ppm 的化學(xué)位移，表明GY 中的兩個(gè)氨基酸殘基都與鈣離子產(chǎn)生了相互作用，且作用位點(diǎn)為N 端氨基和C 端羧基[105]。

4.3 多肽和鈣的結(jié)合方式

鈣離子與多肽上的羧基基團(tuán)（-COO--）連接的主要方式有單牙配位基、雙牙配位基、橋聯(lián)和α-連接（圖1）。單牙配位基指鈣離子與羧基基團(tuán)的一個(gè)氧原子發(fā)生相互作用，雙牙配位基指鈣離子與羧基基團(tuán)上的兩個(gè)氧原子發(fā)生相互作用。如果羧基基團(tuán)上的兩個(gè)氧原子分別與兩個(gè)鈣離子發(fā)生相互作用，則為橋聯(lián)連接。如果鈣離子與羧基基團(tuán)中的一個(gè)氧原子和另一個(gè)配體中的其他原子（O、N、S 等）發(fā)生結(jié)合，則稱為α-連接[106]。來自太平洋鱈魚骨的十肽與鈣離子有三種結(jié)合模式，分別為單牙配位基、雙牙配位基和α-連接[102]。

圖1 多肽和鈣的結(jié)合方式[106]Fig.1 Binding ways between peptides and calcium[106]

5 多肽螯合鈣的吸收途徑

小腸是鈣離子吸收的主要部位，正常生理?xiàng)l件下通過小腸吸收的鈣約占鈣吸收總量的90%。多肽螯合鈣在腸道中的吸收機(jī)制尚不完全明確。一種可能的情況是鈣肽復(fù)合物在腸道中釋放鈣離子，另一種情況是鈣肽復(fù)合物以整體的形式通過腸道中肽的吸收方式被吸收[81]。

5.1 鈣離子的吸收途徑

跨細(xì)胞途徑（Transcellular pathway）和細(xì)胞旁路途徑（Paracellular pathway）是小腸鈣離子吸收的兩種主要細(xì)胞機(jī)制（圖2）。過去的研究認(rèn)為兩種吸收途徑是兩個(gè)相互獨(dú)立的體系，最近的研究表明，跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁路途徑之間可能存在協(xié)同作用來維持機(jī)體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。跨細(xì)胞途徑主要負(fù)責(zé)鈣攝入量較低或?qū)︹}的需求量較高（如妊娠期和哺乳期）時(shí)鈣的吸收，當(dāng)小腸腸腔內(nèi)的鈣離子濃度遠(yuǎn)高于血漿鈣離子濃度時(shí)，將通過細(xì)胞旁路途經(jīng)來吸收鈣離子[107]。

圖2 鈣離子的吸收途徑Fig.2 Absorption pathways of calcium ions

5.1.1 跨細(xì)胞途徑 跨細(xì)胞吸收途徑是一種主動(dòng)的、轉(zhuǎn)運(yùn)量飽和的、順濃度梯度的吸收方式，其主要發(fā)生在十二指腸和空腸，受維生素D 調(diào)控，且鈣離子需要跨越粘膜-漿膜兩側(cè)細(xì)胞質(zhì)膜腸道屏障[108]。跨上皮細(xì)胞途徑主要涉及三個(gè)主要鈣離子運(yùn)輸步驟[109]：a.鈣離子穿過小腸上皮細(xì)胞頂端刷狀緣進(jìn)入細(xì)胞；b.從刷狀緣轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞基底膜；c.穿過細(xì)胞基底膜排出細(xì)胞。

5.1.1.1 從頂端刷狀緣進(jìn)入細(xì)胞 鈣離子穿過刷狀緣進(jìn)入細(xì)胞的過程主要受位于小腸上皮頂端的鈣離子通道蛋白TRPV6 調(diào)控，TRPV6 缺陷小鼠會(huì)產(chǎn)生鈣離子吸收障礙，導(dǎo)致體重下降、骨密度降低等一系列問題的發(fā)生[110]。TRPV6 為瞬時(shí)受體電位TRP（transient receptor potential）的超家族成員，屬于香草酸型瞬時(shí)受體電位亞家族（TRPV）。上皮鈣離子通道結(jié)構(gòu)上包含3 個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端由327 個(gè)親水性氨基酸組成，有3 個(gè)錨定蛋白結(jié)合位點(diǎn)和數(shù)個(gè)潛在的蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)；中間為6 次跨膜域，N-端含有2 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)和一段額外的疏水性肽鏈，可以形成離子孔道；C-端由151 個(gè)親水性氨基酸組成，含有潛在的蛋白激酶A 和蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)[111-112]。

5.1.1.2 從刷狀緣轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞基底膜 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度受到十分精細(xì)的調(diào)控，其濃度必須保持在10-7mol/L 以下，才能維持細(xì)胞內(nèi)正常的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)防止細(xì)胞凋亡。一旦大量的鈣離子進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞，細(xì)胞需要有緩沖多余鈣的機(jī)制，并能夠?qū)⑦@些鈣離子從粘膜側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)至漿膜側(cè)[113]。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的轉(zhuǎn)運(yùn)主要由鈣結(jié)合蛋白Calbindin D9k（CB-D9k）介導(dǎo)，其含有兩個(gè)EF-hand 鈣離子結(jié)構(gòu)域，因此每摩爾CB-D9k 可以結(jié)合2 摩爾鈣離子，對(duì)鈣離子有著極高的親和力[114]。CB-D9k 主要在十二指腸絨毛尖端處聚集表達(dá)[115]。

5.1.1.3 穿過細(xì)胞基底膜排出細(xì)胞 鈣離子穿過細(xì)胞基底膜排出細(xì)胞是一個(gè)能量依賴的過程。P 型初級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP2B1（即PMCA1b）和二級(jí)活性轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC8A1（即NCX1）主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞質(zhì)中的鈣從小腸細(xì)胞基底膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外[116]。PMCA1b 是細(xì)胞基底膜主要的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，負(fù)責(zé)80%的胞漿鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)[108,117]。PMCA1b 可以被胞漿鈣離子、鈣調(diào)素和CB-D9k 有效激活，被釩酸鹽抑制[118-119]。最近的研究表明4.1R 蛋白可能是PMCA1b 活性作用的關(guān)鍵蛋白。Liu 等[120]的研究發(fā)現(xiàn)，4.1R 蛋白敲除小鼠的PMCA1b 表達(dá)下調(diào)，小腸鈣吸收受損，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)低鈣血癥和骨質(zhì)減少。NCX1 轉(zhuǎn)運(yùn)體負(fù)責(zé)大約20%的胞漿鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)。PMCA1b 和NCX1 并不是相互獨(dú)立的兩個(gè)基底膜鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，二者之間存在協(xié)同作用，當(dāng)用KB-R7943 等小分子對(duì)NCX1的表達(dá)進(jìn)行抑制，發(fā)現(xiàn)PMCA1b 的活性也受到了抑制，反之亦然[121]。

5.1.2 細(xì)胞旁路途徑 與跨細(xì)胞途徑不同，細(xì)胞旁路途經(jīng)是一種不飽和的、被動(dòng)的擴(kuò)散吸收途徑，主要發(fā)生在小腸上皮細(xì)胞的緊密連接和細(xì)胞間隙中，受小腸管腔內(nèi)的電化學(xué)梯度和緊密連接的完整性驅(qū)動(dòng)[122]。大鼠十二指腸細(xì)胞和Caco-2 單層細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)顯示，當(dāng)小腸腸腔內(nèi)的鈣離子濃度超過5 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞旁路途徑的鈣通量明顯增加[123-124]。Fujita 等[125]認(rèn)為，細(xì)胞旁路途經(jīng)是一種可調(diào)節(jié)的、跨緊密連接的轉(zhuǎn)運(yùn)方式，在生理?xiàng)l件下可以與跨細(xì)胞途徑發(fā)生協(xié)調(diào)互補(bǔ)作用。緊密連接是位于腸上皮細(xì)胞頂端和基底膜之間的特殊膜域，通過其對(duì)電荷和分子大小的選擇性，對(duì)離子、蛋白質(zhì)和其他大分子在腸道內(nèi)的運(yùn)動(dòng)形成屏障。Claudins 是一個(gè)由24 個(gè)成員組成的蛋白家族，分子量從20～27 kDa 不等，已經(jīng)被鑒定為緊密連接中形成跨膜屏障和孔道的主要跨膜組分[126]。最近的一項(xiàng)研究表明，Claudin-2 蛋白敲除動(dòng)物的細(xì)胞旁路途徑鈣吸收減少，證明了Claudin-2 蛋白在細(xì)胞旁路吸收途徑中的重要性[127]。含有帶電氨基酸的細(xì)胞外環(huán)可以插入胞外空間，形成具有不同選擇性的離子通道孔徑[128]。Claudin-2 和Claudin-12 蛋白在其細(xì)胞外環(huán)處含有帶負(fù)電荷的氨基酸，可以吸引鈣離子[129-130]。

5.2 鈣離子吸收的節(jié)段異質(zhì)性

鈣的吸收發(fā)生在整個(gè)胃腸道，但其在每個(gè)節(jié)段的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)效率存在異質(zhì)性（表2）。當(dāng)鈣攝入量充足或較高時(shí)，鈣的吸收效率取決于膳食鈣在胃腸道中所處的節(jié)段位置、在不同節(jié)段位置的停留時(shí)間以及膳食鈣的溶解度[131]。

表2 鈣離子吸收的節(jié)段異質(zhì)性Table 2 Segmental heterogeneity of calcium absorption

5.2.1 胃 胃中通常不存在鈣的吸收，但是胃可以為膳食鈣的溶解提供酸性環(huán)境[132]。胃壁細(xì)胞產(chǎn)生的胃酸增加了膳食鈣的溶解度，并允許鈣離子與其他食物成分形成復(fù)合物。參與表達(dá)胃酸產(chǎn)生的基因（Cckbr、Tcirg1、Snx10 等）如果被破壞，會(huì)對(duì)正常的胃酸分泌產(chǎn)生影響，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致骨密度降低、低鈣血癥等[133-134]。臨床數(shù)據(jù)顯示胃切除的術(shù)后病人也會(huì)產(chǎn)生相同的癥狀[38,135]。這些發(fā)現(xiàn)表明正常的胃酸分泌對(duì)維持人體的鈣穩(wěn)態(tài)起到了不可替代的作用。

5.2.2 十二指腸 食物經(jīng)胃消化后產(chǎn)生的酸性食糜會(huì)進(jìn)入十二指腸，并由十二指腸腺分泌的HCO3-和堿性粘液中和。由于此時(shí)食糜中的游離鈣含量較高，十二指腸中pH 的即時(shí)變化并不會(huì)對(duì)游離鈣的濃度產(chǎn)生十分大的影響，且與小腸中其他遠(yuǎn)端腸段相比，十二指腸中鈣的溶解度最高[138-139]。然而由于食物在十二指腸中僅停留2～3 min，十二指腸中的鈣吸收量?jī)H占整個(gè)腸道鈣吸收總量的8%[140]。

十二指腸中既存在鈣離子的跨細(xì)胞吸收途徑，也存在細(xì)胞旁路吸收途徑。當(dāng)機(jī)體鈣攝入不足時(shí)，1,25（OH）2D3上調(diào)鈣選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)受體TRPV6 和鈣結(jié)合蛋白Calbindin D9k，促進(jìn)鈣離子的跨細(xì)胞途徑吸收[141-142]，但因?yàn)榭缂?xì)胞吸收途徑可以飽和，因此該途徑下鈣的吸收隨著鈣攝入量的增加而減少[143]。當(dāng)腸腔內(nèi)的游離鈣濃度大于5 mmol/L 時(shí)，十二指腸中鈣離子的吸收主要為細(xì)胞旁路途徑[123]。

5.2.3 空腸 進(jìn)入空腸的鈣離子在接近空腸遠(yuǎn)端的過程中逐漸暴露于較高的pH（6.6～8），從而導(dǎo)致空腸腸腔內(nèi)的不溶性鈣增加[138]。高鈣飲食的大鼠其膳食鈣在整個(gè)空腸停留的時(shí)間為40～45 min，約為十二指腸停留時(shí)間的20 倍，因此空腸中膳食鈣的吸收量要高于十二指腸（17% vs 7%）[144]。與十二指腸相同，空腸中同時(shí)存在鈣離子的跨細(xì)胞吸收途徑和細(xì)胞旁路吸收途徑，其中細(xì)胞旁路途徑負(fù)責(zé)了空腸中80%的鈣吸收，跨細(xì)胞吸收途徑（15%）主要發(fā)生在空腸近端[144]。最近的研究顯示，與新生小鼠相比，成年小鼠空腸中TRPV6 的表達(dá)要低得多，這是因?yàn)楫?dāng)新生小鼠的十二指腸跨細(xì)胞吸收途徑?jīng)]有發(fā)育完全時(shí)，由空腸的跨細(xì)胞吸收途徑來維持新生小鼠體內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)[145-146]。

5.2.4 回腸 回腸是絕大部分鈣離子被吸收的地方，雖然回腸中pH 大于8，導(dǎo)致鈣的溶解度和吸收率降低，但鈣的吸收總量并沒有減少，這是因?yàn)槭澄镌诨啬c中的停留時(shí)間最長(zhǎng)[138]。高鈣飲食飼喂的成年大鼠中，鈣在其十二指腸、空腸和回腸中的停留時(shí)間分別為3、43 和141 min[66]。當(dāng)回腸腔內(nèi)少量的未沉淀的游離鈣被吸收后，不溶性的鈣沉淀會(huì)進(jìn)一步解離為游離鈣，從而進(jìn)一步被吸收[17]。因此盡管回腸中鈣的轉(zhuǎn)運(yùn)速度要比十二指腸和空腸中慢得多，但是回腸當(dāng)中膳食鈣的長(zhǎng)時(shí)間停留保證了緩慢而穩(wěn)定的細(xì)胞旁路吸收途徑，使得回腸成為了大量鈣吸收（65%～88%）的腸道節(jié)段[147]。

回腸中鈣離子的吸收主要為細(xì)胞旁路途經(jīng)，現(xiàn)有的研究表明回腸中跨細(xì)胞鈣吸收十分有限[143]。與其他節(jié)段相比，回腸中參與細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)木o密連接蛋白Claudin-2 和Claudin-12 的表達(dá)量要高出很多[129]，而跨細(xì)胞途徑中的TRPV6 和Calbindin D9k 的表達(dá)量幾乎缺失，PMCA1b 的表達(dá)量極低[148]。

5.3 肽的吸收途徑

多肽螯合鈣中活性肽的序列大小一般為2～20個(gè)氨基酸殘基[149]，其需要抵抗胃酸的消化和胃蛋白酶的活性，并最終進(jìn)入腸道被吸收[150]。因此，了解腸道中肽的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有助于了解多肽螯合鈣的促鈣吸收機(jī)制（圖3）。腸道中肽的吸收途徑主要有三種[113]：a.PepT1 介導(dǎo)的二肽和三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收；b.細(xì)胞內(nèi)囊泡介導(dǎo)的寡肽的胞吞作用；c.寡肽和二肽、三肽的細(xì)胞旁路吸收。

圖3 肽的吸收途徑Fig.3 Absorption pathways of peptides

5.3.1 PepT1 介導(dǎo)的二肽和三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收 PepT1是一種廣泛存在的特異性肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，具有由710個(gè)氨基酸殘基組成的12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中肽結(jié)合腔大小約為13×12×11?，因此其只能結(jié)合二肽和三肽，對(duì)于四肽及以上的多肽的結(jié)合存在空間限制[151]。PepT1 介導(dǎo)的二肽和三肽的轉(zhuǎn)運(yùn)受小腸上皮細(xì)胞頂端刷狀緣膜上的質(zhì)子梯度驅(qū)動(dòng)。PepT1 蛋白從腸腔內(nèi)攝取二肽/三肽和H+后，細(xì)胞內(nèi)的H+通過刷狀緣膜上的Na+-H+交換泵離開細(xì)胞，Na+進(jìn)入細(xì)胞。隨后Na+通過基底膜外側(cè)上的Na+-K+泵排出。三個(gè)Na+被運(yùn)輸出細(xì)胞的同時(shí)兩個(gè)有K+進(jìn)入細(xì)胞，以恢復(fù)細(xì)胞的電化學(xué)梯度[152]。有研究表明芳香族或堿性氨基酸殘基可能在PepT1 識(shí)別中起關(guān)鍵作用[153]。

5.3.2 細(xì)胞內(nèi)囊泡介導(dǎo)的寡肽的胞吞作用 一種細(xì)胞內(nèi)囊泡介導(dǎo)的運(yùn)輸系統(tǒng)，即胞吞作用，也存在于小腸上皮細(xì)胞中。一些寡肽，特別是含有高比例疏水性或堿性氨基酸殘基的寡肽，可能與小腸上皮細(xì)胞膜表面發(fā)生相互作用，并通過胞吞作用進(jìn)行運(yùn)輸，但是這一吸收途徑在小腸肽吸收當(dāng)中所占的比例很小，因?yàn)樵诎套饔煤箅目赡軙?huì)被細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的肽酶水解[149]。

5.3.3 寡肽和二肽、三肽的細(xì)胞旁路吸收 小腸上皮細(xì)胞的閉合蛋白Occludin、緊密連接蛋白Claudins和其他輔助蛋白相互結(jié)合，構(gòu)成了小腸中的緊密連接[149]。緊密連接中存在一定大小的孔徑，可以允許二肽、三肽以及寡肽（3～5 個(gè)氨基酸殘基）的運(yùn)輸[154]。

6 結(jié)論與展望

本文綜述了食物基質(zhì)成分對(duì)鈣的生物利用度的影響，闡述了部分鈣鹽以及鈣肽螯合物的促鈣吸收作用，并對(duì)多肽螯合鈣中鈣肽結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系、多肽螯合物的吸收機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)。食物基質(zhì)中的很多成分均對(duì)鈣的生物利用度有影響，其中植酸、草酸和磷酸鹽等物質(zhì)可以和鈣形成沉淀，從而抑制鈣的吸收。鈣離子對(duì)人體的重要性已經(jīng)在很多研究中得到了證實(shí)，且人體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的失衡可以誘發(fā)一系列的疾病。鈣補(bǔ)充劑可以以不同形式的鈣鹽存在，但葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈣等有機(jī)鈣鹽對(duì)鈣生物利用度的影響尚未得到比較明確的闡釋。除部分有機(jī)鈣鹽外，多肽螯合鈣有著十分顯著的促鈣吸收潛能，已經(jīng)有越來越多的研究對(duì)鈣肽結(jié)合的機(jī)理與構(gòu)效關(guān)系、以及多肽鰲合鈣中鈣離子的吸收機(jī)制進(jìn)行了研究。因此，在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，未來對(duì)鈣離子吸收的研究可以聚焦在以下幾個(gè)方面：a.不同鈣鹽中的鈣在腸道中的“存在形式”以及腸道中過飽和鈣鹽的形成對(duì)鈣離子生物利用度的影響；b.多肽螯合鈣中鈣的吸收形式，鈣離子是否可以在腸道中從復(fù)合物釋放，亦或是以鈣肽復(fù)合物整體的形式被吸收。c.由于部分有機(jī)鈣鹽、氨基酸和多肽均具有促鈣吸收作用，因此可以探究鈣鹽-氨基酸或鈣鹽-多肽復(fù)合物是否具有促鈣吸收潛質(zhì)。