鵝掌柴蜂蜜中特征性成分鑒定及真實(shí)性評(píng)價(jià)

王琪琦，黃忠連，王 莉，董 捷，林 珣，張根生

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.廣西梧州甜蜜家蜂業(yè)有限公司，廣西梧州 543000；4.江蘇鴻祺生物科技有限公司，江蘇泰州 225300）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物花蜜、植物活體分泌物或在植物活體上吮吸的蜜源昆蟲排泄物等生產(chǎn)的天然甜味物質(zhì)，與其自身分泌的特殊物質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化、沉積、脫水、貯藏并留存于蜂巢中直至成熟的一種物質(zhì)[1]。蜂蜜中主要包含葡萄糖和果糖，此外還含有少量蛋白質(zhì)、酶、多酚、萜烯類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。這些成分賦予了蜂蜜多種功能活性[5]，如抗菌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]等。鵝掌柴蜂蜜呈淺琥珀色，味甘略帶有苦味[9]，主產(chǎn)自廣西、廣東等地，是我國(guó)南方特有的冬季蜜種。以往關(guān)于鵝掌柴蜂蜜的研究只有其抗氧化活性[10]，而其特征性成分和真實(shí)性評(píng)價(jià)方法的研究幾乎沒(méi)有。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，蜂蜜是目前十大最易摻假食品之一[11]，其摻假方式主要包括向蜂蜜中摻入糖漿[12-13]和向高價(jià)蜂蜜中摻入低價(jià)蜂蜜。傳統(tǒng)的蜂蜜真實(shí)性檢測(cè)方法多集中在孢粉學(xué)和糖漿標(biāo)志物檢測(cè)上[14]。然而，孢粉學(xué)檢測(cè)需要專業(yè)孢粉學(xué)背景，且無(wú)法檢測(cè)多種蜂蜜混合的摻假[15]。糖漿標(biāo)志物檢測(cè)缺點(diǎn)是糖漿的種類繁多，不同種類糖漿的標(biāo)志物不同，特別是有些糖漿通過(guò)大孔樹脂等過(guò)濾可以有效的去除糖漿標(biāo)志物，這給蜂蜜的真實(shí)性檢測(cè)帶來(lái)了巨大困難。AOAC 碳同位素檢測(cè)也只能檢測(cè)到C4 植物糖漿摻假，對(duì)C3 植物糖漿無(wú)效[16-17]。核磁共振法和超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法價(jià)格昂貴，且核磁共振需要大量的真蜂蜜樣本建立龐大的數(shù)據(jù)庫(kù)作為支撐，無(wú)法對(duì)超出數(shù)據(jù)庫(kù)外的樣本做出評(píng)價(jià)[18-19]。

近年來(lái)，蜂蜜的真實(shí)性檢測(cè)從對(duì)糖漿標(biāo)志物檢測(cè)轉(zhuǎn)移到蜂蜜本身化合物檢測(cè)上。Qiao 等[20]通過(guò)對(duì)洋槐蜜、椴樹蜜、油菜蜜中的特征性成分的研究，發(fā)現(xiàn)洋槐蜜中的萜烯類化合物紅花菜豆酸、椴樹蜜中的萜烯類化合物椴樹素、油菜蜜中的酚酸酯類成分丁香酸甲酯可以作為這三種單花蜜的標(biāo)志性成分，結(jié)合標(biāo)志性成分和指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)這三種單花蜂蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)。林珣等[21]對(duì)枸杞蜜中植物化合物分析，發(fā)現(xiàn)其中特有的黃酮類成分花旗松素，并將其作為枸杞蜜的標(biāo)志性成分，以此建立枸杞蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)方法。因此，通過(guò)挖掘單花蜜中特征性化合物，通過(guò)特征性化合物建立單花蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)方法對(duì)單花蜜真實(shí)性評(píng)價(jià)具有重要意義。目前針對(duì)鵝掌柴蜂蜜品質(zhì)評(píng)價(jià)缺乏系統(tǒng)的方法，因此，本研究通過(guò)對(duì)鵝掌柴蜂蜜中特征性成分進(jìn)行分析，挖掘鵝掌柴蜂蜜中的特征性化合物，通過(guò)特征性化合物和指紋圖譜建立鵝掌柴蜂蜜真實(shí)性評(píng)價(jià)方法，為鵝掌柴蜂蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鵝掌柴蜂蜜樣品 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，采自廣東、廣西、海南等地；甲醇（色譜純）、乙酸（質(zhì)譜純）美國(guó)Thermo Fisher 公司；反,反脫落酸、順,反脫落酸 純度≥98%，美國(guó)Sigma 公司；4-（1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-三甲基-2-環(huán)己烯酮上海源葉生物科技有限公司；3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇 純度≥97%，本實(shí)驗(yàn)室合成。

SevenEasyS20 型pH 計(jì) 瑞士梅特勒公司；ThermoSorvall 離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher 公司；Strata-X-A 固相萃取柱（3 mL）美國(guó)Phenomenex 公司；0.22 μm 濾膜 Milipore 公司；安捷倫6500 型QTOF 液質(zhì)聯(lián)用儀，配備Phenomenex Gemini C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）反相色譜柱 美國(guó)Agilent 公司；DN-24W 氮吹儀 上海達(dá)洛科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜂蜜中化合物富集 參考喬江濤[22]的研究方法，稱取20 g 蜂蜜樣品，加入80 mL 超純水，制備體積分?jǐn)?shù)為5%的氨水，將蜂蜜樣品pH 調(diào)為7，放入離心機(jī)9000 r/min 離心15 min。保留上清液，合并至燒杯，用3 mL 分析級(jí)甲醇活化SPE 固相萃取柱，再用3 mL 超純水進(jìn)行平衡，用固相萃取柱進(jìn)行富集，結(jié)束后用2 mL 超純水清洗，再用2 mL 10%的甲酸甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)獯蹈珊?，加? mL 色譜級(jí)甲醇復(fù)溶，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，裝至棕色進(jìn)樣瓶中于4 ℃下保存，用于分析。

1.2.2 色譜分析條件 流動(dòng)相A：0.2%乙酸的純水，流動(dòng)相B：0.2%乙酸的甲醇，柱溫箱溫度35 ℃、反相色譜柱（C18）、樣品進(jìn)樣量20 μL、鵝掌柴蜂蜜的檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm、總流速0.7 mL/min。鵝掌柴蜂蜜的梯度洗脫方法：0～10 min，9%～14% B；10～18 min，14%～15% B；18～28 min，15%～17% B；28～40 min，17～26% B；40～44 min，26～33% B；44～54 min，33～34% B；54～64min，34～35% B；64～69 min，35～37%B；69～74 min，37～38% B；74～84 min，38～41% B；84～89 min，41～44% B；89～96 min，44～54% B；96～126 min，54～65% B；126～135 min，65～80% B。

1.2.3 質(zhì)譜分析條件 電噴霧ESI 離子源，出口電壓為125 V、噴射電壓為4 kV、加熱溫度350 ℃、氮?dú)猓∟2）流速為12 L/min、霧化氣流速為80 kPa、霧化器壓力40 psi、碰撞氣體為氦氣、掃描范圍為100～900 Da[23]。

1.2.4 特征性成分定性分析 首先通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜信息確定化合物的分子量及化學(xué)式，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜碎片信息得到化合物大致化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)合化合物的極性、最大紫外吸收，推測(cè)出化合物結(jié)構(gòu)。通過(guò)購(gòu)買商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.5 特征性成分定量分析 稱取一定質(zhì)量的苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、反,反式脫落酸、順,反脫落酸，配制成10 ml 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，按照梯度進(jìn)樣方法進(jìn)行HPLC 分析，根據(jù)不同的上樣量和不同的峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中x 為標(biāo)準(zhǔn)品的上樣量（ng），y 為峰面積，如表1 所示。由于苦蜜素C 無(wú)商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品，但苦蜜素C 和苦蜜素B 是同分異構(gòu)體，具有相同的分子量、相同的最大紫外吸收，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)也相似。因此苦蜜素C 含量以苦蜜素B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)信息Table 1 Information of standards

1.2.6 HPLC 指紋圖譜的建立 將鵝掌柴原料蜜樣品的高效液相色譜圖，通過(guò)中藥色譜指紋圖譜軟件進(jìn)行相似度分析，在此過(guò)程中對(duì)比并記錄各個(gè)樣品中的色譜峰相似度，并在允許范圍內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)校正，即可得到鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.2.7 真實(shí)性評(píng)價(jià)方法 a.按照1.2.1 方法對(duì)蜂蜜中的特征性化合物進(jìn)行富集，在1.2.2 的色譜條件下得到樣品色譜峰。b.將樣品色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜比對(duì)，差異較大或有明顯異常色譜峰的樣品均不是鵝掌柴蜂蜜。c.色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜較一致的樣品再對(duì)其中的特征性成分進(jìn)行定量分析。d.樣品中鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的含量應(yīng)大于或等于原料蜜中最低限量，可判定其為真正的鵝掌柴蜂蜜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)分析基于SPASS 26.0 軟件計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差，MassHunter 10.0 分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，ChemBioDraw Ultra 10.4 繪制化合物結(jié)構(gòu)式，使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件建立鵝掌柴蜂蜜的指紋圖譜并且分析其相似度。每組實(shí)驗(yàn)均為3 次平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝掌柴蜂蜜中特征性成分鑒定

鵝掌柴蜂蜜樣品的高效液相色譜圖如圖1 所示。

圖1 鵝掌柴蜂蜜樣品的HPLC 圖譜Fig.1 Chromatograms of heptapleurum honey

根據(jù)化合物的保留時(shí)間、最大紫外吸收波長(zhǎng)、二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證分析，確定出鵝掌柴蜂蜜中的5 個(gè)特征性成分。表2 為鵝掌柴蜂蜜樣品的成分鑒定結(jié)果。

表2 鵝掌柴蜂蜜樣品中化合物信息Table 2 Composition information on heptapleurum honey

化合物1 在正離子模式下有m/z 241.1424[M+H]+、m/z 263.1248[M+Na]+、m/z 481.2785[2M+H]+的 準(zhǔn)分子離子峰（圖2），負(fù)離子模式下有m/z 239.1276[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此判斷該化合物的分子量為240。根據(jù)其精確質(zhì)量可計(jì)算出化學(xué)組成為C13H20O4。由m/z 241.1439[M+H]+脫水產(chǎn)生碎片離子m/z 223.1308[M+H-H2O]+，說(shuō)明化合物含有羥基；由 m/z 241.1439 [M+H]+到 m/z 197.1171[M+HCH3CHO]+，說(shuō)明化合物含有“-CH（OH）CH3”片段；由m/z 137.0956 到m/z 109.1014 是脫CO，說(shuō)明化合物結(jié)構(gòu)具有羰基，由m/z 179.1171 到m/z 123.0805，分析結(jié)構(gòu)為環(huán)烯，脫去2-甲基丙烯。該化合物在245 nm 處有最大紫外吸收峰，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道初步判定化合物1 是4-(1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮[24]。后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，明確化合物1 是4-（1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇）-3,5,5-2-環(huán)己烯酮。研究表明，環(huán)烯醚萜類物質(zhì)往往帶有苦味[25]，通過(guò)Virtual Taste 軟件[26]對(duì)化合物1 苦味度進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，值為0.77 接近于已知的苦味物質(zhì)乙酰氨基酚的苦味度0.81[27]，推測(cè)4-(1’-環(huán)乙醚-3’-丁二醇)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮是鵝掌柴蜂蜜苦味的來(lái)源之一，因此，我們將其命名為苦蜜素B。

圖2 化合物1 在正負(fù)離子模式下的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 1 in positive and negative ion mode

化合物2 在正離子模式下有m/z 225.1476[M+H]+、m/z 471.2662[2M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰（圖3），確定其分子量為224。如表1 所示，該化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)為268 nm，二級(jí)特征離子碎片為m/z 181.1218 [M+H-CH3CHO]+,m/z 151.1104[M+HCH3CHO-OCH3]+,m/z 121.1005[M+H-CH3CHOOCH3-OCH3]+，判斷該化合物的分子式為C12H16O4，計(jì)算其環(huán)加雙鍵值為5，可以確定分子結(jié)構(gòu)中有苯環(huán)。結(jié)合碰撞能量分析，由m/z 225.1465 到m/z 181.1218 相差44，通過(guò)元素?cái)M合中性丟失為CH3CHO，m/z 181.1218 到m/z 151.1104 相差30，由m/z 151.1104到m/z 121.1005 相 差30，由m/z 121.1005 到m/z 91.0531 為連續(xù)斷裂3 個(gè)甲氧基，根據(jù)以上斷裂規(guī)律，初步推測(cè)該化合物為3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，確定該化合物為3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，由于首次在蜂蜜中鑒定出該成分，將其定為鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分。

化合物3 在正離子模式下有m/z 241.1444[M+H]+、m/z 263.2697[M+Na]+的準(zhǔn)分子離子峰（圖4），負(fù)離子模式下有m/z 239.0523[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此判斷該化合物分子量為240?；衔? 和化合物1 互為同分異構(gòu)體。兩個(gè)化合物的二級(jí)質(zhì)譜斷裂碎片也都接近，表明兩個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)接近。比較化合物3 和化合物1 的碎片離子m/z 137.0958和m/z 153.0526 的豐度可知，化合物1 中碎片離子m/z 137.0958 是m/z 179.1084 經(jīng)過(guò)H 重排后斷裂來(lái)的，化合物3 中m/z 137.0958 可以通過(guò)m/z 179.1084經(jīng)過(guò)H 重排和m/z 153.0526 的RDA 碎裂而來(lái)。因此，判斷化合物1 的環(huán)氧共軛在C6 和C7 上，而化合物3 的環(huán)氧共軛在C8 和C9 上。初步斷定化合物3 可能為：4-(1’2’-二羥基-3’環(huán)氧丙烷)-3,5,5-2-環(huán)己烯酮。通過(guò)Virtual Taste 軟件對(duì)化合物3 苦味度進(jìn)行預(yù)測(cè)分析為0.80，推測(cè)化合物3 也可能是鵝掌柴蜂蜜的苦味來(lái)源之一，因此我們將其命名為苦蜜素C。

圖4 化合物3 在正負(fù)離子模式下的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.4 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of compound 3 in positive and negative ion mode

化合物4 在正模式下有m/z 265.1414[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（圖5），負(fù)離子模式下有m/z 263.1259[M+H]-、m/z 527.2657[2M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此，判斷其分子量為264。如表1 所示，該化合物在263 nm 下有最大紫外吸收峰，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期鑒定成果及加入標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證[28]，確定該化合物為反,反式脫落酸。

圖5 化合物4 在正負(fù)離子模式下的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 4 in positive and negative ion modes

化合物5 在正離子模式下有m/z 529.2759[2M+H]+準(zhǔn)分子離子峰（圖6），負(fù)離子模式下有m/z 263.1285[M+H]-、m/z 527.2643[2M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰，因此，判斷其分子量為264。結(jié)合表1 可知，化合物5 與化合物4 的分子量、最大紫外吸收波長(zhǎng)及二級(jí)斷裂碎片均相同，保留時(shí)間不同，因此推測(cè)兩者可能互為同分異構(gòu)體。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期鑒定成果及加入標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證[29]，確定該化合物為順,反式脫落酸。

圖6 化合物5 在正負(fù)離子模式下一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.6 HPLC-MS and HPLC-MSMS spectrum of composition 5 in positive and negative ion modes

2.2 鵝掌柴蜂蜜中特征性成分定量分析

將Y01～Y10 不同產(chǎn)地的鵝掌柴原料蜜中的特征性成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表3 所示。其中，順,反式脫落酸含量最高，平均含量14.46±0.34 mg/kg，反,反式脫落酸的平均含量為6.85±0.52 mg/kg，苦蜜素B 和苦蜜素C 的平均含量分別為5.97±0.26、11.13±0.45 mg/kg。鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇的平均含量為2.30±0.25 mg/kg，最低含量為1.73±0.18 mg/kg。

表3 鵝掌柴原料蜜中化合物含量（mg/kg）Table 3 Contents of compounds in heptapleurum raw honey samples (mg/kg)

2.3 鵝掌柴蜂蜜HPLC 指紋圖譜建立

將10 個(gè)鵝掌柴原料蜜樣品的高效液相色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，在可允許范圍內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)校正，樣品間相似度均高于0.8。鵝掌柴原料蜜樣品生成的指紋圖譜及鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜見(jiàn)圖7 和圖8。

圖7 鵝掌柴原料蜜樣品生成的指紋圖譜Fig.7 Fingerprints of heptapleurum raw honey samples

圖8 鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.8 Fingerprints of heptapleurum honey

2.4 市售鵝掌柴商品蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)

根據(jù)上述建立的鵝掌柴蜂蜜真實(shí)性評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)市售的6 個(gè)品牌鵝掌柴蜂蜜進(jìn)行真實(shí)性評(píng)價(jià)。從HPLC 色譜圖（圖9）中可以看到，品牌A、B 和C 樣品的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜較一致，在三個(gè)品牌中，均檢測(cè)到了在鵝掌柴蜂蜜中鑒定出的5 個(gè)成分（表4），其含量范圍分別為4.12～6.65、1.98～2.72、4.57～11.23、4.96～8.25、10.92～14.68 mg/kg，標(biāo)志性成分含量均大于1.73 mg/kg，與原料蜜樣品中含量較接近。因此，這三個(gè)品牌為品質(zhì)較好的鵝掌柴蜂蜜。在品牌D 和E 中，雖然也檢測(cè)到在鵝掌柴蜂蜜中鑒定出的5 個(gè)成分，但與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相比，存在較明顯差異，且品牌D 中出現(xiàn)含量較高的異常峰。因此，推測(cè)品牌D 和E 可能混入了其他單花蜜，純度較低。在品牌F 中，均未檢測(cè)到在鵝掌柴蜂蜜中特征性成分，且與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜差異較大。因此，我們推測(cè)品牌F 不是鵝掌柴蜂蜜。

表4 鵝掌柴商品蜜中化合物含量（mg/kg）Table 4 Contents of compounds in heptapleurum commercial honey samples (mg/kg)

3 結(jié)論

通過(guò)HPLC-Q-TOF-MSMS 在鵝掌柴蜂蜜中共鑒定出5 個(gè)特征性成分，分別為苦蜜素B、3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇、苦蜜素C、反,反式脫落酸、順,反式脫落酸。首次在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)3,4,5-三甲氧基苯丙烯醇，將其定為鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分。通過(guò)中藥色譜指紋圖譜軟件，建立鵝掌柴蜂蜜的HPLC 指紋圖譜，通過(guò)結(jié)合特征性成分和指紋圖譜，建立了鵝掌柴蜂蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)方法。對(duì)市售的6 個(gè)鵝掌柴蜂蜜進(jìn)行真實(shí)性評(píng)價(jià)，其中3 個(gè)品牌為品質(zhì)較好的鵝掌柴蜂蜜，2 個(gè)品牌為鵝掌柴蜂蜜中可能混入其他蜂蜜，1 個(gè)品牌中未檢測(cè)到鵝掌柴蜂蜜的標(biāo)志性成分，并且色譜圖與指紋圖譜存在明顯差異，推測(cè)其不是鵝掌柴蜂蜜。本研究為鵝掌柴蜂蜜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立，提供了重要的理論依據(jù)。