過敏性鼻炎與過敏性哮喘及非過敏性哮喘的因果關(guān)系分析

林俊濤，曹昉欣，楊蓋，王欣童，林娜

1 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色533000；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科

哮喘是一種發(fā)生于呼吸道的過敏性炎癥，也是一種非傳染性慢性疾?。?］。哮喘可分為過敏性哮喘和非過敏性哮喘兩大表型，過敏性哮喘的臨床表現(xiàn)與非過敏性哮喘既有相似性又存在明顯差異［2］。現(xiàn)有研究表明，過敏性鼻炎（AR）與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間關(guān)系密切［3-4］，深入探究三者之間的因果關(guān)系對(duì)AR所導(dǎo)致哮喘表型的預(yù)防和治療具有重要意義。觀察性研究并不能明確AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系，且難以避免反向因果關(guān)系、樣本量少及難以剔除的混雜因素，導(dǎo)致AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系難以明確。孟德爾隨機(jī)化（MR）研究利用與暴露因素具有強(qiáng)相關(guān)的遺傳變異作為工具變量，借此推斷暴露因素與研究結(jié)局之間的因果效應(yīng)。MR遵循隨機(jī)分配原則，混雜因素的影響在很大程度上是可控的，且遺傳變異工具變量發(fā)生于疾病及表型發(fā)生之前，可有效避免反向因果關(guān)系。2023年1—7月，本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本MR研究，以闡明AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例數(shù)據(jù)來源 通過GWAS匯總數(shù)據(jù)集的遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)IEU OpenGWAS project（https：//gwas.mrcieu.ac.uk）［5］，篩選并提取與AR、過敏性哮喘、非過敏性哮喘相關(guān)的GWAS數(shù)據(jù)集，將具有代表性的相關(guān)GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。GWAS數(shù)據(jù)來自歐洲人群，能有效避免人群異質(zhì)性偏倚，其中AR包含112 583例受試者（GWAS ID ukb-b-7178，AR病例組25 486例、健康對(duì)照組87 097例），過敏性哮喘包含135 910例受試者（GWAS ID finn-b-ALLERG_ASTHMA_EXMORE，過敏性哮喘病例組4 859例、健康對(duì)照組131 051例），非過敏性哮喘包含134 760例受試者（GWAS ID finn-b-NONALLERG_ASTHMA_EXMORE，非過敏性哮喘病例組3 709例、健康對(duì)照組131 051例）。

1.2 疾病顯著相關(guān)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)篩選 MR所選取的工具變量SNP需滿足三大假設(shè)：相關(guān)性假設(shè)，即SNP與AR強(qiáng)相關(guān)；排他性假設(shè)，即SNP與過敏性哮喘及非過敏性哮喘無關(guān)，SNP只能通過AR對(duì)過敏性哮喘或非過敏性哮喘發(fā)生作用；獨(dú)立性假設(shè)，即SNP與混淆因素?zé)o關(guān)。從所篩選AR相關(guān)GWAS數(shù)據(jù)集中提取與AR顯著相關(guān)的SNP進(jìn)行后續(xù)分析，其中相關(guān)性滿足P＜5E-08。

1.3 工具變量選擇 為確保所篩選的AR顯著相關(guān)SNP是獨(dú)立的，設(shè)置連鎖不平衡參數(shù)閾值（r2＜0.001，kb＞10 000），排除連鎖不平衡對(duì)結(jié)果的影響。工具變量若納入兩個(gè)高度相關(guān)位點(diǎn)，相當(dāng)于對(duì)結(jié)果重復(fù)加權(quán)，會(huì)造成結(jié)果發(fā)生偏倚。計(jì)算F統(tǒng)計(jì)量，計(jì)算公式為F=R2×（n-k-1）÷［k×（1-R2）］，其中n表示樣本數(shù)量，k表示所選取的工具變量SNP的數(shù)量，R2表示工具變量解釋暴露的程度。R2=［2×（1-MAF）×MAF×β2］/［2×（1-MAF）×MAF×β2+（SE）2×2×N×（1-MAF）×MAF］，其中MAF為最小等位基因頻率，在計(jì)算R2時(shí)MAF可以和效應(yīng)等位基因頻率等價(jià)，β為等位基因效應(yīng)值，SE為β的標(biāo)準(zhǔn)誤。F統(tǒng)計(jì)量用于評(píng)估是否為弱工具變量偏倚，F(xiàn)＜10表明該SNP為弱工具變量或工具變量?jī)H能解釋小部分表型變異，需剔除這部分SNP，避免對(duì)結(jié)果造成影響。通過數(shù)據(jù)庫(kù)Pheno Scanner（V2）（http：//www.phenoscanner.medschl.cam.ac.uk/）［6-7］，檢驗(yàn)所選擇工具變量是否與混雜因素相關(guān)，排除其對(duì)應(yīng)表型與結(jié)局變量具有強(qiáng)相關(guān)意義的SNP，即排除混雜因素對(duì)結(jié)局變量的影響。通過harmonise_data函數(shù)將所篩選的SNP效應(yīng)等位基因?qū)R，即把暴露和結(jié)局的SNP進(jìn)行協(xié)同，剔除具有中等頻率等位基因回文序列的SNP，避免因?yàn)檫@些位點(diǎn)變化導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。通過孟德爾隨機(jī)多態(tài)性殘差和離群值（MR-PRESSO）檢驗(yàn)，將離群值剔除，并重新進(jìn)行分析。最終選取的SNP位點(diǎn)即為研究AR與過敏性哮喘或非過敏性哮喘因果關(guān)系的工具變量。

1.4 AR與過敏性哮喘、非過敏性哮喘因果關(guān)系的MR分析方法 MR遵循孟德爾第二定律隨機(jī)分配實(shí)現(xiàn)隨機(jī)分組，借助工具變量SNP進(jìn)行隨機(jī)化，模擬隨機(jī)對(duì)照研究。采用逆方差加權(quán)法（IVW）、加權(quán)中位數(shù)法（WME）和MR-Egger回歸模型進(jìn)行MR分析。IVW特點(diǎn)是回歸時(shí)不考慮截距項(xiàng)存在并且用結(jié)局方差的倒數(shù)作為權(quán)重來進(jìn)行擬合，P＜0.05提示MR分析存在潛在的因果關(guān)系。WME定義為比率估計(jì)值的加權(quán)中位數(shù)，若分析中至少有一半的信息來自有效工具，則可以評(píng)價(jià)因果關(guān)系。MR-Egger回歸法在回歸時(shí)考慮截距項(xiàng)存在，使用結(jié)局方差的倒數(shù)作為權(quán)重來進(jìn)行擬合。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用異質(zhì)性檢驗(yàn)、水平多效性檢驗(yàn)、漏斗圖及留一法評(píng)估結(jié)果的可靠性。使用R軟件（version 4.2.1）的TwoSampleMR包［8］。采用Cochran′sQ檢驗(yàn)和漏斗圖進(jìn)行異質(zhì)性分析，Cochran′sQ檢驗(yàn)P＜0.05表示分析結(jié)果具有顯著異質(zhì)性，漏斗散點(diǎn)圖呈對(duì)稱狀提示無偏倚。采用MREgger截距測(cè)試進(jìn)行水平多效性分析，若MR-Egger截距測(cè)試分析中的截距項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則表明MR分析具有明顯水平多效性。采用留一法敏感性檢驗(yàn)進(jìn)行敏感性分析，通過逐一排除SNP來判斷MR結(jié)果的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 AR與過敏性哮喘因果關(guān)系分析結(jié)果 將AR數(shù)據(jù)與過敏性哮喘數(shù)據(jù)匹配后，剔除具有中等頻率等位基因回文序列的SNP位點(diǎn)rs7774620，剔除離群值rs2066362，最終納入28個(gè)SNP作為工具變量進(jìn)行MR分析。IVW結(jié)果顯示，AR與過敏性哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)有顯著因果關(guān)系（OR=69.348，95%CI28.768 ～167.169，P=3.62E-21）。WME和MR-Egger回歸結(jié)果也顯示AR與過敏性哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)有顯著因果關(guān)系（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘因果關(guān)系的兩樣本MR森林圖

2.2 AR與非過敏性哮喘因果關(guān)系分析結(jié)果 將AR數(shù)據(jù)與非過敏性哮喘數(shù)據(jù)匹配后，最終納入31個(gè)SNP作為工具變量進(jìn)行MR分析。IVW結(jié)果顯示，AR與非過敏性哮喘不存在顯著因果關(guān)系（OR=2.593，95%CI0.996 ～ 6.752，P=0.051）。WME和MR-Egger回歸結(jié)果也顯示AR與非過敏性哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)不存在顯著因果關(guān)系（P均＞0.05）。見圖1。

2.3 MR分析可靠性評(píng)價(jià)結(jié)果 AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘MR分析過程中，經(jīng)Cochran′sQ檢驗(yàn)，各工具變量之間有顯著異質(zhì)性（P＜0.05）；但MR-Egger截距測(cè)試顯示各組截距接近0，且P＞0.05，表明MR分析結(jié)果不存在水平多效性，工具變量沒有通過AR以外的其他因素影響過敏性哮喘或非過敏性哮喘的發(fā)生，獨(dú)立性和排他性假設(shè)成立。漏斗圖結(jié)果顯示，SNP位點(diǎn)分布基本對(duì)稱，表明結(jié)果均無明顯異質(zhì)性，見OSID碼圖1、OSID碼圖2。留一法敏感性分析顯示，無論剔除哪個(gè)SNP都不會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生根本影響，表明AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘MR分析結(jié)果是穩(wěn)健的，見OSID碼圖3、OSID碼圖4。

3 討論

哮喘是一種常見疾病，哮喘的治療耗費(fèi)巨大的人力和經(jīng)濟(jì)成本［9-11］。既往研究對(duì)AR與哮喘的因果關(guān)系尚不明確。本研究中應(yīng)用兩樣本MR研究方法較為準(zhǔn)確地證明AR與過敏性哮喘存在顯著的因果關(guān)系，而與非過敏性哮喘不存在顯著的因果關(guān)系。通過MR研究方法探討AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系，可為不同表型哮喘的預(yù)防和治療提供更加清晰的理論支撐，是進(jìn)一步探究不同表型哮喘病理生理機(jī)制的關(guān)鍵。鼻炎與哮喘是相互關(guān)聯(lián)的臨床表型［12］，觀察性研究表明，AR與哮喘發(fā)病關(guān)系密切，AR是哮喘的危險(xiǎn)因素，但無法推斷出AR是哮喘的原因還是后果。如果AR只與部分表型哮喘有因果關(guān)系，則需要深入研究評(píng)估這部分表型哮喘發(fā)生發(fā)展過程中AR所發(fā)揮的作用，并且需要進(jìn)一步探討解決AR與不同表型哮喘之間的因果關(guān)系與內(nèi)在機(jī)理，為不同表型哮喘的病理生理學(xué)機(jī)制研究提供方向。

AR是世界上患病率最高的疾病之一，帶來巨大的醫(yī)療和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［13-14］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［15］。AR是哮喘控制不佳的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，多項(xiàng)流行病學(xué)和臨床研究表明，AR和哮喘之間存在密切關(guān)系，但對(duì)他們的內(nèi)在機(jī)制聯(lián)系仍不明確［1，16-17］。過敏性哮喘與非過敏性哮喘是哮喘的主要表型，過敏性哮喘的特征包括嗜酸性氣道炎癥、對(duì)各種過敏原特異性致敏、總IgE水平和特異性IgE水平升高、血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加、呼出一氧化氮水平升高，而非過敏性哮喘沒有這些特征表現(xiàn)，但兩者的共同點(diǎn)都是可逆性氣道阻塞［18］。哮喘合并AR的情況較為常見，應(yīng)重視哮喘患者過敏原的篩查與AR的防治［19］。AR與哮喘屬于“同一氣道，同一疾病”，是2001年世界衛(wèi)生組織提出的觀念，與本研究MR分析結(jié)果AR與過敏性哮喘有顯著的因果關(guān)系相互印證，也與世界變態(tài)反應(yīng)組織提出的過敏性鼻炎—哮喘綜合征這一診斷術(shù)語(yǔ)相互印證，但本研究MR分析結(jié)果還提示AR與非過敏性哮喘不存在顯著的因果關(guān)系，需進(jìn)一步探討不同表型哮喘與AR之間的潛在聯(lián)系和病理生理學(xué)機(jī)制。

本研究利用MR研究方法探討AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系，具有許多傳統(tǒng)流行病學(xué)研究方法所不具備的優(yōu)勢(shì)。MR是基于全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)、類似于隨機(jī)對(duì)照研究、能有效減少偏倚、用于揭露因果關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。傳統(tǒng)流行病學(xué)研究方法對(duì)病因研究存在許多弊端，其中觀察性研究不能人為施加干預(yù)措施，只能在自然狀態(tài)下判斷想要研究的因素和發(fā)生疾病之間的關(guān)聯(lián)，存在反向因果關(guān)系、潛在混雜因素等問題，而實(shí)驗(yàn)性研究如隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)需先在動(dòng)物身上進(jìn)行實(shí)施，通過動(dòng)物毒理學(xué)測(cè)試，再逐步開展人體試驗(yàn)，實(shí)施起來困難較大，且須考慮醫(yī)學(xué)倫理等問題，難以探究疾病的病因。運(yùn)用MR研究方法從基因?qū)W角度探討和判斷AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。MR分析基因與基因之間的作用，是在基因?qū)用孢M(jìn)行研究，不會(huì)受到外界環(huán)境因素干擾。MR研究基于孟德爾遺傳規(guī)律，親代的等位基因隨機(jī)分配給子代，此過程相當(dāng)于隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中的隨機(jī)分組過程，不受傳統(tǒng)混雜因素如環(huán)境暴露、社會(huì)地位、行為等影響，且滿足時(shí)間順序的合理性，即遺傳變異繼承來自父母，且保持相對(duì)不變。

本研究也存在一定的局限性，異質(zhì)性檢驗(yàn)過程中，Cochran′sQ檢驗(yàn)結(jié)果表明有顯著異質(zhì)性，可能是由于雙樣本的數(shù)據(jù)存在差異，即來自不同分析平臺(tái)、不同實(shí)驗(yàn)及不同人群的SNP可能存在異質(zhì)性，但這不影響MR分析結(jié)果的可靠性。MR分析中利用隨機(jī)效應(yīng)的IVW作為主要結(jié)局，存在異質(zhì)性是可以接受的，且本研究MR分析結(jié)果不存在水平多效性，不違背MR核心假設(shè)，不影響最終的MR分析結(jié)果［20］。另外，GWAS數(shù)據(jù)年齡跨度可能比較大，疾病嚴(yán)重程度也未能有效分層，只能籠統(tǒng)分析，不能進(jìn)行更加細(xì)致的分層分析。因此該研究無法驗(yàn)證不同性別或年齡層中AR與過敏性哮喘及非過敏性哮喘之間的因果關(guān)系是否是一致的，也不能驗(yàn)證不同AR嚴(yán)重程度與不同表型哮喘之間的因果關(guān)系。當(dāng)后續(xù)分層GWAS匯總數(shù)據(jù)可得時(shí)，可進(jìn)行更加細(xì)致的因果關(guān)系分析，進(jìn)一步驗(yàn)證研究成果。