腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)變化及其與患者預(yù)后的關(guān)系

萬(wàn)勇軍，阮先國(guó)，張學(xué)勤，殷妮，張大虎

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院泌尿外科，湖北襄陽(yáng)441100；2 襄陽(yáng)市中心醫(yī)院泌尿外科

腎癌是常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，病理類型以腎透明細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占所有類型的80%。腎癌起病隱匿，約有30%腎癌患者初次就診時(shí)已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對(duì)于局部進(jìn)展期腎癌患者，即使經(jīng)手術(shù)、靶向治療等綜合治療，術(shù)后仍可能發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后［2］。目前腎癌患者預(yù)后評(píng)估主要依靠TNM分期，但即使相同分期患者預(yù)后仍然差異較大。核苷酸還原酶亞單位M2（RRM2）是核糖核酸還原酶的催化亞基，能夠催化核糖核苷酸形成脫氧核糖核苷酸，參與DNA修復(fù)及細(xì)胞周期等過(guò)程。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，RRM2在膀胱癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展，是潛在的腫瘤預(yù)后標(biāo)志物［3-4］。膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）是膜聯(lián)蛋白A超家族成員，參與膜聚集、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生物學(xué)過(guò)程［5］。研究表明，乳腺癌［6］、甲狀腺癌［7］等腫瘤中ANXA1表達(dá)上調(diào)，通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究觀察了腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)變化，探討兩者與腎癌臨床病理參數(shù)及無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2020年3月收治的腎癌患者102例納入研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：初次診治，年齡＞18歲；均接受腎癌根治術(shù)，術(shù)后病理檢查明確為腎癌；患者同意參加本研究并簽署知情同意書，相關(guān)臨床病理和隨訪資料完整。排除合并嚴(yán)重心肺疾病、合并其他惡性腫瘤患者，一般狀況差、不能耐受手術(shù)的患者，轉(zhuǎn)移性腎癌或腫瘤原發(fā)灶來(lái)源于其他器官的患者，妊娠、哺乳期女性。102例中，男60例、女42例；年齡33 ～ 79（63.59 ± 7.60）歲；透明細(xì)胞癌80例，非透明細(xì)胞癌22例；TNM分期Ⅰ期58例，Ⅱ ～ Ⅲ期44例；Fuhrman分級(jí)Ⅰ ～ Ⅱ級(jí)52例，Ⅲ ～ Ⅳ級(jí)50例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移91例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理號(hào)2023KY044）。

1.2 腎癌組織中RRM2、ANXA1蛋白檢測(cè) 取術(shù)中獲取的部分腎癌組織和癌旁正常腎組織，10%中性甲醛固定16 h，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，磷酸鹽緩沖液中100 ℃熱修復(fù)10 min，3%過(guò)氧化氫溶液10 min，RRM2、ANXA1一抗工作液（稀釋比均為1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，二抗工作液室溫孵育1 h，DAB顯色液顯色5 min，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察染色情況。由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片，根據(jù)著色程度和染色面積進(jìn)行半定量染色評(píng)分，著色程度為無(wú)染色計(jì)0分，弱染色計(jì)1分，強(qiáng)染色計(jì)2分；染色面積＜10%計(jì)0分，10% ～ 25%計(jì)1分，25% ～ 50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分；兩項(xiàng)得分相乘，＞2為陽(yáng)性，≤2為陰性。

1.3 預(yù)后觀察 患者出院后開始定期隨訪，以門診復(fù)查方式進(jìn)行，包括體格檢查、B超及腹盆腔CT檢查等。分別于術(shù)后1、6、12個(gè)月隨訪1次，以后每年隨訪1次。隨訪內(nèi)容為有無(wú)腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者生存情況。腫瘤進(jìn)展定義為隨訪中發(fā)現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或患者死亡。隨訪截至2023年4月。隨訪終點(diǎn)為隨訪時(shí)間結(jié)束或出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析法。采用Log-Rank檢驗(yàn)比較不同RRM2、ANXA1表達(dá)腎癌患者3年無(wú)進(jìn)展生存率的差異。采用單因素及多因素COX回歸分析腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)變化及其相關(guān)性 腎癌組織RRM2、ANXA1陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。腎癌組織RRM2、ANXA1陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.59%（72/102）、66.67%（68/102），均高于癌旁正常腎組織的7.84%（8/102）、5.88%（6/102），P均＜0.05。見(jiàn)圖1。腎癌組織中RRM2與ANXA1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.702，P＜0.05）。

圖1 腎癌組織和癌旁正常腎組織RRM2、ANXA1表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床病理參數(shù)腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)比較 不同腫瘤TNM分期、Fuhrman分級(jí)腎癌組織中RRM2、ANXA1陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。不同性別、年齡、病理類型之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)比較［例（%）］

2.3 不同預(yù)后患者腎癌組織RRM2、ANXA1表達(dá)比較 102例腎癌患者，腫瘤進(jìn)展21例，3年無(wú)進(jìn)展生存率為79.41%。RRM2陽(yáng)性者、陰性者3年無(wú)進(jìn)展生存率分別為75.00%（54/72）、90.00%（27/30），ANXA1陽(yáng)性者、陰性者3年無(wú)進(jìn)展生存率分別為73.53%（50/68）、91.18%（31/34），RRM2陽(yáng)性、ANXA1陽(yáng)性患者3年累積無(wú)進(jìn)展生存率分別低于RRM2陰性、ANXA1陰性患者（P均＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同RRM2、ANXA1表達(dá)情況腎癌患者3年無(wú)進(jìn)展生存情況比較

2.4 RRM2、ANXA1表達(dá)對(duì)腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的影響 以隨訪3年內(nèi)患者是否出現(xiàn)疾病進(jìn)展為因變量（是=1，否=0），將腎癌臨床病理參數(shù)及RRM2、ANXA1表達(dá)納入單因素及多因素COX回歸分析，結(jié)果顯示，TNM分期Ⅱ ～ Ⅲ期、Fuhrman分級(jí)Ⅲ ～ IV級(jí)、RRM2陽(yáng)性及ANXA1陽(yáng)性表達(dá)是腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的影響因素。見(jiàn)表2、表3。

表2 腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后影響因素單因素COX分析結(jié)果

表3 腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后影響因素多因素COX分析結(jié)果

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，約1/3的腎癌患者術(shù)后可發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是腎癌患者死亡的主要原因［8］。雖然近年來(lái)分子靶向治療藥物及免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療轉(zhuǎn)移性腎癌有一定臨床療效，但患者仍存在耐藥或治療低應(yīng)答率的問(wèn)題［9］。因此，尋找新的、敏感的腎癌腫瘤標(biāo)志物評(píng)估腎癌進(jìn)展及預(yù)后，對(duì)于提高腎癌臨床診治效能具有重要意義。

人核糖核苷酸還原酶參與催化核糖核苷二磷酸轉(zhuǎn)化為2′-脫氧核糖核苷二磷酸，合成DNA合成修復(fù)所需的2′脫氧核糖核苷5′-二磷酸。RRM2是維持人核糖核苷酸還原酶活性的重要催化亞基。研究表明，非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤中RRM2表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生及惡性轉(zhuǎn)化，是新的分子診斷學(xué)和預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)志物［10］。本研究中，腎癌組織RRM2表達(dá)升高，提示RRM2參與腎癌的發(fā)生。腎癌中RRM2表達(dá)升高與抑癌基因多溴蛋白1突變有關(guān)。研究表明，40%腎癌中存在抑癌基因多溴蛋白1突變，其編碼蛋白不能構(gòu)成SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，導(dǎo)致RRM2基因過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)免疫抑制性CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［11］。本研究中，腎癌組織RRM2表達(dá)與TNM分期及Fuhrman分級(jí)有關(guān)，提示RRM2促進(jìn)腎癌進(jìn)展。分析原因，RRM2的表達(dá)升高不僅能夠通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的進(jìn)行，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)及腫瘤細(xì)胞惡性增殖，還能夠抑制干擾素基因刺激因子通路，抑制腫瘤殺傷性CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，RRM2陽(yáng)性表達(dá)的腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存率較低，提示檢測(cè)腎癌組織中的RRM2有助于評(píng)估患者預(yù)后。分析其原因，一方面是RRM2陽(yáng)性表達(dá)的腎癌患者腫瘤TNM分期及Fuhrman分級(jí)高，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移潛能大，術(shù)中可能殘留微小轉(zhuǎn)移灶，造成術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；另一方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RRM2陽(yáng)性表達(dá)的腎癌細(xì)胞對(duì)靶向藥物治療及免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的有效性較差，導(dǎo)致腫瘤不易被徹底清除，腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后［13-14］。

ANXA1屬于膜聯(lián)蛋白家族成員，分子量為38 kD，參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中ANXA1作為一種致癌因子，能夠與硫酸乙酰肝素結(jié)合，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為［15］。本研究中，腎癌組織ANXA1表達(dá)明顯升高，提示ANXA1參與腎癌的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA1通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞惡性增殖［16］。本研究中，ANXA1表達(dá)與腎癌患者不良臨床病理特征有關(guān)，提示ANXA1表達(dá)可促進(jìn)腎癌的惡性進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道，ANXA1表達(dá)能夠通過(guò)磷酸化激活下游蛋白激酶B和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，促進(jìn)腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［17］。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性腎癌患者腫瘤組織中ANXA1表達(dá)上調(diào)還能降低腎癌細(xì)胞對(duì)舒尼替尼治療的敏感性，是評(píng)估轉(zhuǎn)移性腎癌患者靶向治療預(yù)后的生物標(biāo)志物［18］。本研究也證實(shí)，ANXA1陽(yáng)性是影響腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明ANXA1有望作為腎癌無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。有學(xué)者在腎癌細(xì)胞系Caki-1中發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)ANXA1能夠上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1A表達(dá)，促進(jìn)啟動(dòng)子區(qū)含有缺氧反應(yīng)原件的基因如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1等表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管新生及代謝重編程，導(dǎo)致腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移潛能增高［19］。

本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在腎癌發(fā)生發(fā)展中可能存在協(xié)同作用。有學(xué)者報(bào)道，腎癌中RRM2表達(dá)上調(diào)能夠與ANXA1蛋白相互作用，穩(wěn)定ANXA1的表達(dá)并磷酸化激活蛋白激酶B，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及對(duì)舒尼替尼的耐藥［20］。因此，腎癌組織中RRM2可能是通過(guò)ANXA1發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，針對(duì)兩者的靶向治療可能成為新的腎癌治療方案。

綜上所述，腎癌組織中RRM2、ANXA1表達(dá)上調(diào)，兩者表達(dá)與腫瘤TNM分期及Fuhrman分級(jí)有關(guān)。TNM分期Ⅱ ～ Ⅲ期、Fuhrman分級(jí)Ⅲ ～ Ⅳ級(jí)、RRM2陽(yáng)性及ANXA1陽(yáng)性表達(dá)是影響腎癌患者無(wú)進(jìn)展生存預(yù)后的因素。以上研究結(jié)果有助于指導(dǎo)醫(yī)生早期對(duì)腎癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，對(duì)于高危腎癌患者予以積極治療及隨訪，以改善患者遠(yuǎn)期生存率。然而本研究樣本量有限，未能對(duì)不同病理類型的腎癌患者進(jìn)行分層分析，有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。