初發(fā)酮癥傾向2型糖尿病與單純2型糖尿病患者糞便樣本中腸道菌群結(jié)構(gòu)差異性分析

聞曉強，阿榮，池海誼，席文琪，王秀清，云慶茹，張潔

1 呼和浩特市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，呼和浩特010030；2 齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

酮癥傾向2型糖尿?。═2DM）是一類不同于1型糖尿?。═1DM）和T2DM的混合型糖尿病綜合征。酮癥傾向T2DM主要以糖尿病酮癥酸中毒或酮癥伴嚴重高血糖起病，多見于體型肥胖者，大多數(shù)有糖尿病家族史，男女比例約3∶1，青中年男性較多［1］；發(fā)病時表現(xiàn)為胰島β細胞功能急性暫時性可逆性損傷，大多數(shù)患者經(jīng)過治療后，β細胞功能可達到胰島素非依賴性緩解［2］。目前臨床上將酮癥傾向T2DM均診斷為T2DM，但二者起病特點顯著不同?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腸道菌群與T1DM及T2DM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［3-4］。但對于腸道菌群在酮癥傾向T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用鮮有報道。腸道菌群系統(tǒng)非常復雜，且數(shù)量非常龐大，正常情況下腸道菌群處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持腸道健康狀態(tài)［5］。腸道菌群失衡是指菌群結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變，進入病理狀態(tài)，從而破壞人體內(nèi)環(huán)境平衡，導致疾病發(fā)生發(fā)展［6］。本研究觀察并對比初發(fā)酮癥傾向T2DM與單純T2DM患者糞便樣本中腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異，分析差異菌種與酮癥傾向T2DM臨床代謝指標的相關(guān)性，為酮癥傾向T2DM防治相關(guān)研究提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年3月—8月就診于呼和浩特市第一醫(yī)院內(nèi)分泌科的初發(fā)酮癥傾向T2DM患者和初發(fā)單純T2DM患者各34例，分別納入酮癥傾向T2DM組和單純T2DM組。酮癥傾向T2DM組納入標準［7］：①符合1999年WHO的T2DM診斷標準；②首次就診時尿酮體陽性（尿酮體++或以上）、尿糖陽性（尿糖+或以上）或血β-羥丁酸≥0.3 mmol/L，有糖尿病相關(guān)癥狀（多飲、多食、多尿、消瘦等）時間＜6個月且未使用任何口服降糖藥物或胰島素治療，無明顯感染或應(yīng)激狀態(tài)等誘因，胰島自身抗體谷氨酸脫羧酶、抗胰島素IgG抗體、抗胰島細胞抗體均陰性，空腹血清C肽≥0.33 nmol/L或胰高血糖素刺激后C肽峰值≥0.5 nmol/L［8］。單純T2DM組納入標準［7］：①T2DM患者符合1999年WHO的糖尿病診斷標準；②首次就診時不伴酮癥或酮癥酸中毒，有糖尿病相關(guān)癥狀時間＜6個月且未使用任何口服降糖藥物或胰島素治療，無明顯感染或應(yīng)激狀態(tài)等誘因。排除標準［7］：①合并有腸道感染性疾病、肝硬化、心臟疾病、高血壓、腎臟疾病、自身免疫性疾病及全身或局部感染等疾病；②15 d內(nèi)使用過抗生素或進食含有益生菌的藥物、食物（如酸奶、含益生菌的飲料等）；③出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥。酮癥傾向T2DM組男26例、女8例，漢族28例、蒙古族6例；單純T2DM組男25例、女9例，漢族30例、蒙古族4例。兩組年齡、民族、身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）；酮癥傾向T2DM組甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平高于單純T2DM組（P均＜0.05）。見表1。本研究通過呼和浩特市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批，所有受試者知情并自愿簽署知情同意書。

表1 兩組年齡、BMI、血脂及血糖指標比較（）

表1 兩組年齡、BMI、血脂及血糖指標比較（）

注：與單純T2DM組相比，*P＜0.05。

組別酮癥傾向T2DM組單純T2DM組HbA1c（%）11.84 ± 2.36*9.50 ± 1.93 n 34 34年齡（歲）43.71 ± 11.56 49.15 ± 11.28 BMI（kg/m2）26.73 ± 4.34 27.16 ± 3.31 TG（mmol/L）3.53 ± 3.14*2.14 ± 1.35 TC（mmol/L）5.51 ± 1.85*4.56 ± 1.00 FPG（mmol/L）18.81 ± 6.22*13.23 ± 4.87

1.2 糞便樣本獲取及腸道菌群檢測

1.2.1 糞便樣本獲取 囑兩組患者將糞便排在清潔袋上，隨后立即裝入糞便樣本盒中，迅速封口，從糞便排出到裝入糞便樣本盒的時間短于2 min，同時糞便樣本中避免混入尿液、血液等。每個樣本分裝5管，每管留取糞便樣本250 ～ 350 mg，將糞便樣本盒及5管分裝瓶放入-80 ℃冰箱中儲存待用。從糞便排出到凍存于冰箱的時間短于2 h［9］。

1.2.2 腸道菌群檢測 用MOBIO糞便DNA提取試劑盒進行糞便樣本腸道細菌DNA提取。進行PCR擴增，16 S rRNA引物序列27 F為5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′，1 492 R為5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′。構(gòu)建好的文庫使用PacBio公司提供的建庫試劑盒（SMRTbell_Template_Prep_Kit）對產(chǎn)物進行損傷修復、末端修復及連接接頭，最終磁珠純化回收后，由美國Pacific_Biosciences公司生產(chǎn)的單分子實時技術(shù)平臺進行測序。將Effective_CCS序列進行聚類，獲得操作分類單位（OTU）數(shù)量，進一步對OTU進行菌種注釋及豐度統(tǒng)計。然后在界、門、綱、目、科、屬、種各水平統(tǒng)計各樣本的菌種組成，并進行α、β多樣性和顯著性菌種差異性分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以表示，采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。采用QIIME2軟件進行α多樣性指數(shù)分析；采用PERMANOVA_test進行β多樣性指數(shù)分析；采用顯著性差異標準測試（克魯斯卡爾—沃利斯檢驗和兩兩Wilcoxon測試）和線性判別分析法進行組間差異顯著菌種分析；選擇Rstats包中的wilcox.test函數(shù)或STAMP軟件中的Welch′st-test進行組間差異分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組糞便樣本腸道菌群組成比較

2.1.1 α、β多樣性分析結(jié)果 單分子實時測序共獲得851 377條CCS序列，每個樣本至少產(chǎn)生7 909條CCS序列。在97.0%的相似度水平下將Effective_CCS序列進行聚類，獲得351個OTU，666 563個序列條數(shù)。酮癥傾向T2DM組α多樣性指數(shù)Chao1 Index、Shannon Index分別為139.52 ± 5.41、3.91 ±0.15，單純T2DM組分別為128.57 ± 5.93、4.06 ±0.16，兩組差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），考慮兩組間菌種多樣性和豐度差異較小；β多樣性分析中主坐標分析法結(jié)果顯示兩組距離矩陣差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示兩組有明顯聚類傾向，菌種及結(jié)構(gòu)分布相似度較大。見OSID碼圖1。

2.1.2 腸道菌群門、屬、種水平分布情況 共檢測出9個門水平菌種。兩組腸道菌群以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）為主要優(yōu)勢菌（占比均超過10%）；疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）也相對豐富。在屬水平上，以糞桿菌屬（Faecalibacterium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸桿菌屬（Escherichia）占比較高。在種水平上，主要以普拉梭菌（Faecalibacterium_prausnitzii、）大腸桿菌（Escherichia_coli）、單形巨單胞菌（Megamonasfuniformis）、普通擬桿菌（Bacteroide vulgatus）豐度較高。見表2及OSID碼圖2、3。

表2 兩組糞便樣本腸道菌群門水平分布情況（%）

2.1.3 差異菌種分析 LDA_Score柱狀圖及進化分支圖顯示絕對值大于2、差異有統(tǒng)計學意義的菌種。見OSID碼圖4、5。酮癥傾向T2DM組特異性菌種主要包括副溶血鏈球菌（Streptococcus_parasanguinis）、韋榮氏球菌科（Veillonellaceae）、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、普氏菌（Prevotellacopri），P分別為0.048 9、0.003 1、0.027 9、0.030 5、0.034 6；單純T2DM組特異性菌種主要包括Fusicatenibacter_saccharivorans、Anaerostipes_hadrus、乳酸明串珠菌（Leuconostoc_lactis），P分別為0.005 7、0.007 6、0.030 5。

2.2 糞便樣本差異菌種與酮癥傾向T2DM組臨床代謝指標的相關(guān)性 酮癥傾向T2DM組差異菌種韋榮氏球菌科豐度與TG呈正相關(guān)（r=0.267，P＜0.05），但與FPG、HbA1c、TC無顯著相關(guān)（r分別為0.225、0.098、-0.048，P均＞0.05）；普雷沃氏菌、普氏菌與FPG、HbA1c呈正相關(guān)（r分別為0.294、0.260、0.337、0.295，P均＜0.05），但與TG、TC無顯著相關(guān)（r分別為0.229、0.163、0.197、0.085，P均＞0.05）；Dialister_invisus、副溶血鏈球菌豐度與FPG、HbA1c、TG、TC均無顯著相關(guān)（r分別為0.209、0.136、0.009、-0.149、-0.209、-0.127、0.069、-0.011，P均＞0.05）。

3 討論

酮癥傾向T2DM不同于T1DM和T2DM的發(fā)病特點，主要以糖尿病酮癥酸中毒或自發(fā)性酮癥起病，發(fā)病率較高，病因不明。腸道菌群可以調(diào)節(jié)宿主的能量儲存與代謝，被認為與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。酮癥傾向T2DM發(fā)病與腸道菌群的相關(guān)性尚不明確。腸道菌群在機體內(nèi)會受到多種因素影響，如生活環(huán)境、飲食結(jié)構(gòu)、抗生素、腸道疾病及合并其他疾病等［10］。為了更加準確地研究酮癥傾向T2DM患者與單純T2DM患者腸道菌群的差異，首先排除生活環(huán)境及飲食結(jié)構(gòu)因素的影響，故入組患者均選擇長期居住在呼和浩特市市區(qū)的居民，且通過飲食結(jié)構(gòu)表得出兩組患者在飲食攝入習慣方面無顯著差異。本研究結(jié)果顯示，兩組年齡、性別、民族、BMI差異無統(tǒng)計學意義，而FPG、HbA1c、TG、TC差異有統(tǒng)計學意義。酮癥傾向T2DM除了以酮癥伴高血糖起病外，其臨床特征與T2DM相似，酮癥傾向T2DM組FPG、HbA1c高于單純T2DM組而兩組BMI差異無統(tǒng)計學意義符合這一臨床特點。此外，酮癥傾向T2DM組高TG水平與既往研究結(jié)果一致，高水平的TG可導致機體內(nèi)血漿游離脂肪酸含量增高，可能進一步誘發(fā)、加重胰島素抵抗并促進酮體的產(chǎn)生［11］。

酮癥傾向T2DM以酮癥起病的機制可能還與精氨酸代謝異常有關(guān)。精氨酸可參與生理代謝及維持細胞功能，如刺激胰島素分泌［12］。KASHYAP等［13］報道，典型T2DM患者與健康對照組相比血漿精氨酸水平相似。而MULUKUTLA等［12］研究發(fā)現(xiàn)酮癥傾向T2DM患者與健康對照組相比血漿精氨酸濃度降低了25%，由此考慮酮癥傾向T2DM患者精氨酸儲備受損。也有研究表明，精氨酸缺乏會導致胰島素減少［14］。由此推測酮癥傾向T2DM患者的精氨酸儲備及利用率降低，導致胰島素分泌不足；同時，胰島素分泌減少，機體糖代謝紊亂，不能利用葡萄糖供能，從而利用脂肪酸，產(chǎn)生了乙酰輔酶A，進而導致酮體生成增多。

本研究發(fā)現(xiàn)，與單純T2DM組相比，酮癥傾向T2DM組以副溶血鏈球菌、韋榮氏球菌科、Dialister_invisus、普雷沃氏菌科、普氏菌等為主要差異性菌種。一項研究發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬參與分解精氨酸［15］。同時，有學者發(fā)現(xiàn)精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)（ADS）是一種多酶反應(yīng)途徑（由操控子編碼），可以將精氨酸分解為鳥氨酸和二氧化碳等［16］。該系統(tǒng)多數(shù)存在于原核生物中，平時處于非表達狀態(tài)。一些細菌擁有一整套基因可以誘導ADS表達，其中包括副溶血鏈球菌。由此推測，酮癥傾向T2DM組的差異菌種副溶血鏈球菌可能導致精氨酸減少，進而誘導了酮癥的發(fā)作。有學者發(fā)現(xiàn)韋榮氏球菌科可以產(chǎn)生乙酸和丙酸［17］。乙酸是結(jié)腸中主要的短鏈脂肪酸，是肝臟膽固醇及脂肪酸合成的底物，高水平乙酸可促進高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥的形成［18］。目前對于丙酸的作用仍存在爭議，但現(xiàn)已證實其可以通過激活G蛋白偶聯(lián)受體43或游離脂肪酸受體2，抑制脂肪分解。動物實驗結(jié)果顯示，丙酸能增加小鼠脂肪合成和抑制脂肪分解［19］。由此也解釋了與單純T2DM組相比，酮癥傾向T2DM組中的TG、TC水平明顯增高的可能原因。SERENA等［20］發(fā)現(xiàn)，普雷沃氏菌科（科水平）、普氏菌（種水平）可以產(chǎn)生琥珀酸，同時也明確指出，細胞外的琥珀酸是從存在特定腸道菌群的腸道內(nèi)產(chǎn)生。琥珀酸可以作為合成丙酸的關(guān)鍵中間體，促進丙酸的合成。

本研究分析了差異菌種豐度與酮癥傾向T2DM組臨床代謝指標的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)酮癥傾向T2DM組韋榮氏球菌科豐度與TG呈正相關(guān)，推測韋榮氏球菌科豐度增高促進了TG生成增加。而且LECOMTE等［18］的研究也表明韋榮氏球菌科與體質(zhì)量及TG變化呈正相關(guān)。韋榮氏球菌科產(chǎn)生的乙酸會導致高甘油三酯血癥。本研究結(jié)果與之基本一致。

一項研究表明，普氏菌與血糖、HbA1c呈正相關(guān)，考慮普氏菌豐度降低會導致血糖、HbA1c水平下降［19］。還有研究顯示，普氏菌、普雷沃氏菌可誘導胰島素抵抗，導致血糖、HbA1c升高［21］。本研究還發(fā)現(xiàn)普氏菌豐度與FPG、HbA1c呈正相關(guān)，與以上研究結(jié)論基本一致。然而，有研究表明普氏菌可通過產(chǎn)生的琥珀酸作為糖異生底物，或產(chǎn)生丁二酸激活腸道糖異生，從而改善葡萄糖耐受性及胰島素敏感性［20］。對于以上結(jié)論差異，考慮腸道菌群之間可能存在相互作用，因此不能僅通過單菌種作用下結(jié)論，需要進一步深入研究。

研究發(fā)現(xiàn)，Dialister_invisus可以產(chǎn)生乙酸及丙酸，從而促進TG和TC生成［18］，推測Dialister_invisus與FPG、HbA1c、TG、TC存在相關(guān)性。但本研究未發(fā)現(xiàn)它們之間的相關(guān)性?？紤]與其他研究相比，本研究入組對象含有蒙古族患者，因此可能與種族差異有關(guān)；其次，酮癥傾向T2DM患者腸道菌群相對豐富，是否因為菌種之間相互作用而導致此結(jié)果，需要進一步完善菌種功能預測加以論證。對于副溶血鏈球菌與血糖、血脂指標的相關(guān)性，暫無明確報道，仍需進一步明確。

總之，與初發(fā)T2DM相比，酮癥傾向T2DM的腸道菌群相對豐富，其腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征更容易導致酮體的生成及TG、TC的合成。由此推測酮癥傾向T2DM患者腸道差異菌種可能是導致其酮癥起病的原因之一。但腸道菌群系統(tǒng)非常復雜，僅靠幾種菌種無法做出確切結(jié)論，以上結(jié)論仍需證實。糞便微生物組移植可作為未來治療代謝疾病和胃腸道疾病的新方向［22］。飲食干預腸道菌群組成也有望作為預防代謝性疾病或其他疾病的一種選擇。