急性胰腺炎小鼠胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織TRAF6、XIAP表達(dá)變化及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)系

譚貞菊，周翔宇，陳霞，3

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州646000；2 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺血管外科；3 成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

急性胰腺炎（AP）是由多種原因引起的胰腺炎癥性疾病，可表現(xiàn)為自限性，也可發(fā)展至多器官功能衰竭［1］。AP患者合并器官功能衰竭與胰腺壞死程度有關(guān)，壞死性胰腺炎患者的器官功能障礙嚴(yán)重程度與病死率呈正相關(guān)［2］。AP并發(fā)多臟器功能障礙的發(fā)病機(jī)制涉及過度炎癥反應(yīng)、缺血再灌注損傷、腸道細(xì)菌易位和細(xì)胞凋亡等［3］。細(xì)胞凋亡在AP發(fā)病機(jī)制中的作用也備受關(guān)注。有報道指出，細(xì)胞凋亡在急性重癥胰腺炎（SAP）的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用，是SAP多器官功能障礙和感染性并發(fā)癥的重要影響因素［4］。凋亡基因的激活是AP中細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。此外，抗凋亡基因也可能同時被激活，這使得在AP狀態(tài)下，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)更為復(fù)雜［5］。既往研究已經(jīng)證實(shí)了細(xì)胞凋亡在AP多器官功能障礙中的作用，但對于不同嚴(yán)重程度AP細(xì)胞凋亡是否存在差異研究較少。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）是TRAF家族成員，通過多種信號通路參與多種急性炎癥性疾?。?-7］。已有研究表明，TRAF6在多種細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的相關(guān)炎癥過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用［8］。凋亡抑制蛋白（IAP）是一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)家族，可負(fù)向調(diào)節(jié)Caspase激活。X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）是八種哺乳動物IAP中最有效的一種，其通過抑制Caspase-3、7、9激活來阻止細(xì)胞發(fā)生凋亡。急性水腫性胰腺炎（AEP）和急性壞死性胰腺炎（ANP）主要區(qū)別在于胰腺損傷的嚴(yán)重程度不同，AEP可導(dǎo)致胰腺組織腫脹、水腫，疾病常呈自限性，預(yù)后良好；ANP是胰腺組織出現(xiàn)出血、壞死等損傷性改變，臨床病情較重，治療難度大，死亡風(fēng)險高。AEP是ANP疾病進(jìn)展過程的前期階段，因此早期控制病情極其重要。2019年3月—2023年4月，本研究構(gòu)建了AEP、ANP小鼠模型，觀察胰腺和遠(yuǎn)隔臟器（包括腸、肺、肝、腎）組織中TRAF6和XIAP表達(dá)變化，并分析其與多臟器細(xì)胞凋亡的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與主要材料 雄性C57BL/10SnJ小鼠30只，4 ～ 6周齡，體質(zhì)量20 ～ 25 g，在西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心室內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23 ℃，12 h∶12 h光/暗循環(huán)，食水不限。本研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動物保護(hù)倫理委員會批準(zhǔn)。雨蛙素購自MCE公司，脂多糖購自Sigma公司，總RNA純化提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒購自中國YEASEN公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天公司，Caspase-3/cleaved Caspase-3、XIAP、TRAF6抗體購自cell signaling Technology公司。

1.2 動物分組及AP模型構(gòu)建 將30只小鼠隨機(jī)分為對照組、AEP組、ANP組，每組10只。造模前禁食禁水12 h，AEP組注射雨蛙素50 μg/kg，每小時一次，連續(xù)10 h。ANP組注射雨蛙素50 μg/kg，每小時一次，連續(xù)13 h，最后一次注射后追加注射一次脂多糖15 mg/kg。對照組注射同等體積的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）。造模后12 h，采用頸椎脫位法處死小鼠，取出組織標(biāo)本。取AEP組和ANP組胰腺組織，HE染色，鏡下觀察到小鼠胰腺腺體明顯增大、腺泡空泡化、炎癥細(xì)胞浸潤、明顯的間質(zhì)水腫伴小葉間隔擴(kuò)張；AEP組胰腺HE染色顯示小葉排列紊亂，小葉邊緣區(qū)腺泡細(xì)胞壞死；ANP組胰腺出現(xiàn)點(diǎn)狀、局灶性壞死，解剖時可見腹腔內(nèi)有少量血性滲出物。上述病理檢查結(jié)果判定為造模成功。

1.3 小鼠胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織中TRAF6、XIAP mRNA及蛋白檢測

1.3.1 TRAF6、XIAP mRNA檢測 每只小鼠收集50 ～ 80 mg新鮮胰腺組織，用TRIzol提取總RNA。將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并對互補(bǔ)DNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。TRAF6基因上游引物序列為5′-GCCGAAATGGAAGCACAG-3′，下游引物序列為5′-CAGGGCTATGGATGACAACA-3′；XIAP基因上游引物序列為5′-GTGAAGAAGCCAGATTGAA-3′，下游引物序列為5′-TGTTCTGACCAGGCACGAT-3′；β-actin上游引物序列為5′-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列為5′-ACCCTCATAGATGGGCACA-3′。所有樣本每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔，取均值。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達(dá)量。

1.3.2 TRAF6、XIAP蛋白檢測 采用Western blotting法。將各組小鼠新鮮的胰腺、腸、肝、肺、腎組織，用RIPA裂解緩沖冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，提取組織總蛋白。取50 μg總蛋白加樣于凝膠中，80 V電泳30 min，120 V電泳1 h，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。使用5% BSA室溫封閉PVDF膜1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入TRAF6、XIAP一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，在室溫下將膜用二抗孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min。用蛋白質(zhì)印跡專用試劑顯色成像。以β-actin為內(nèi)參。使用ECL Plus化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.4 小鼠胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞凋亡率測算及凋亡蛋白檢測 將各組小鼠的胰腺、腸、肝、肺、腎組織切片脫蠟，水化，蛋白酶工作液37 ℃孵育30 min，將載玻片置于含有200 mL的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液的塑料瓶中，用350 W微波輻照5 min。載玻片用PBS沖洗兩次，與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶和核苷酸混合物在潮濕盒子中孵育60 min，陰性對照只添加50 μL標(biāo)記溶液。孵育后PBS沖洗3次。加入50 μL過氧化物酶孵育30 min，滴加DAB工作液室溫顯色10 min。PBS漂洗切片3次，用蘇木精染色，脫水，密封，顯微鏡下拍照。凋亡細(xì)胞胞核呈棕色。每項(xiàng)檢測都設(shè)置陰性對照。顯微鏡拍照后用Image J軟件統(tǒng)計陽性細(xì)胞占比。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/每個視野總細(xì)胞數(shù)×100%。采用Western blotting法檢測各組小鼠的胰腺、腸、肝、肺、腎組織中的cleaved Caspase-3蛋白，方法參考“1.3.2”。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織中TRAF6、XIAP mRNA及蛋白表達(dá)比較 ANP組、AEP組、對照組胰腺組織中TRAF6 mRNA相對表達(dá)量分別為1.54 ±0.06、1.23 ± 0.10、0.94 ± 0.08，XIAP mRNA相對表達(dá)量分別為1.29 ± 0.06、0.56 ± 0.07、0.97 ± 0.07。AEP組胰腺組織中XIAP mRNA表達(dá)低于ANP組（P＜0.05）。ANP組胰腺、肺組織中TRAF6蛋白表達(dá)與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，ANP組各組織中XIAP蛋白表達(dá)高于對照組（P均＜0.05）；AEP組各組織中TRAF6蛋白表達(dá)高于對照組，AEP組胰腺、肺、腎組織中XIAP蛋白表達(dá)高于對照組（P均＜0.05）。AEP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織中TRAF6蛋白表達(dá)高于ANP組，XIAP蛋白表達(dá)低于ANP組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織中TRAF6、XIAP蛋白表達(dá)比較（）

表1 各組胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織中TRAF6、XIAP蛋白表達(dá)比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與ANP組相比，#P＜0.05。

組別ANP組胰腸肝肺腎AEP組胰腸肝肺腎對照組胰腸肝肺腎n5 TRAF6蛋白XIAP蛋白0.75 ± 0.03*0.38 ± 0.02 0.64 ± 0.20 0.19 ± 0.03*0.58 ± 0.08 1.01 ± 0.07*0.99 ± 0.08*1.00 ± 0.04*0.91 ± 0.12*0.99 ± 0.02*5 0.98 ± 0.07*0.77 ± 0.13*#1.10 ± 0.17*#0.98 ± 0.05*#0.98 ± 0.04*#0.47 ± 0.11*#0.77 ± 0.01#0.64 ± 0.07#0.62 ± 0.08*#0.72 ± 0.02*#5 0.26 ± 0.14 0.66 ± 0.03 0.44 ± 0.09 0.38 ± 0.06 0.54 ± 0.10 0.30 ± 0.22 0.25 ± 0.02 0.34 ± 0.10 0.37 ± 0.03 0.42 ± 0.07

2.2 各組胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白表達(dá)比較 對照組胰腺及遠(yuǎn)隔臟器組織中凋亡細(xì)胞較少，AEP組和ANP組凋亡細(xì)胞均增加，AEP組凋亡細(xì)胞較ANP組明顯增多（圖1）。AEP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織細(xì)胞凋亡率均大于ANP組，AEP組和ANP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織細(xì)胞凋亡率大于對照組，AEP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織中cleaved Caspase-3表達(dá)高于ANP組和對照組，ANP組腸、肺、腎組織中cleaved Caspase-3表達(dá)高于對照組（P均＜0.05）。見表2。

圖1 各組胰腺、腸、肝、肺、腎組織細(xì)胞凋亡情況（DAB染色，×200）

表2 各組胰腺及遠(yuǎn)隔臟器細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組胰腺及遠(yuǎn)隔臟器細(xì)胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與ANP組相比，#P＜0.05。

組別ANP組胰腸肝肺腎AEP組胰腸肝肺腎對照組胰腸肝肺腎n5細(xì)胞凋亡率（%）cleaved Caspase-3 7.73 ± 1.00*9.30 ± 0.82*9.25 ± 0.93*5.14 ± 0.45*11.14 ± 3.67*0.84 ± 0.15 0.85 ± 0.02*0.64 ± 0.14 0.76 ± 0.12*0.72 ± 0.04*5 14.67 ± 0.86*#25.87 ± 2.78*#20.71 ± 0.64*#9.13 ± 1.26*#21.04 ± 2.67*#1.12 ± 0.03*#1.09 ± 0.02*#1.03 ± 0.14*#1.02 ± 0.05*#0.95 ± 0.08*#5 0.67 ± 0.06 0.65 ± 0.02 0.44 ± 0.09 0.44 ± 0.11 0.51 ± 0.03 1.33 ± 0.58 2.27 ± 1.36 2.50 ± 0.46 2.34 ± 1.10 2.53 ± 0.25

2.3 胰腺炎小鼠胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織組織中凋亡指標(biāo)與TRAF6、XIAP表達(dá)的相關(guān)性 胰腺炎小鼠胰腺、腸、肝組織細(xì)胞凋亡率與TRAF6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.934、0.770、0.834），胰腺、腸、肝、肺組織細(xì)胞凋亡率與XIAP蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.928、-0.846、-0.973、-0.681）；胰腺炎小鼠胰腺、腸、肝、肺組織中cleaved Caspase-3蛋白與TRAF6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.797、0.973、0.478、0.441），胰腺、肝、肺組織cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)與XIAP蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.798、-0.842、-0.846），P均＜0.05。

3 討論

AP嚴(yán)重程度的調(diào)控機(jī)制目前尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明，AP狀態(tài)下細(xì)胞凋亡與多器官功能損傷的發(fā)生有關(guān)［9］。本研究結(jié)果顯示，隨著AP病理改變的加重，多器官組織細(xì)胞凋亡的程度也有所不同。在腸、肝、肺、腎等胰腺遠(yuǎn)隔臟器均可見細(xì)胞凋亡，且AEP組細(xì)胞凋亡較ANP組更明顯。然而，細(xì)胞凋亡在AEP向ANP進(jìn)展中的作用及詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。與遠(yuǎn)隔臟器的細(xì)胞凋亡情況類似，胰腺組織細(xì)胞凋亡與AP的嚴(yán)重程度也有關(guān)。在以往實(shí)驗(yàn)研究的重癥胰腺炎動物模型中，器官組織以壞死為主，凋亡較少，而輕度胰腺炎模型壞死較輕，但凋亡程度較高［10］。已有證據(jù)表明，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種保護(hù)性反應(yīng)，可以減輕AP的嚴(yán)重程度［9］。由此推測，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡可能有助于控制AP重癥的發(fā)生發(fā)展。

細(xì)胞凋亡是一種復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象，它受各種調(diào)控途徑的誘導(dǎo)，同時也受多種調(diào)控基因的影響。有許多細(xì)胞因子與細(xì)胞凋亡有關(guān)。目前普遍認(rèn)為，細(xì)胞凋亡的共同途徑是Caspase的激活。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的核心環(huán)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號時，胞質(zhì)內(nèi)的Caspase-3激活被剪切為cleaved Caspase-3活性狀態(tài)，cleaved Caspase-3繼續(xù)活化其下游底物如PARP、Caspase-6等，從而發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用，因此測定cleaved Caspase-3可以反映細(xì)胞凋亡水平［11］。AP狀態(tài)下一些致病因素誘導(dǎo)Caspase-3激活可能是胰腺細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。本研究結(jié)果顯示，AEP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織中cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)高于ANP組，這種表達(dá)趨勢與細(xì)胞凋亡結(jié)果相一致。

TRAF6是一種E3泛素連接酶，是腫瘤壞死因子（TNF）超家族和toll樣/白細(xì)胞介素（IL）-1受體超家族的關(guān)鍵適配器分子。TRAF6可介導(dǎo)多種信號通路，激動或抑制TRAF6表達(dá)有望實(shí)現(xiàn)對多種相關(guān)疾病的治療目的［12］。除了在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)病中的作用外，TRAF6在多種細(xì)胞凋亡介導(dǎo)的炎癥過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［8］。TRAF6對細(xì)胞凋亡的抑制或促進(jìn)作用取決于器官和炎癥刺激的類型。有研究報道，TRAF6可促進(jìn)卡介苗誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡［13］。抑制或競爭性結(jié)合TRAF6可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞的凋亡［14-15］。本研究結(jié)果顯示，TRAF6 mRNA在AEP和ANP小鼠中的表達(dá)均被激活。但既往有研究表明，TRAF6不是在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮作用，而是在翻譯后的蛋白水平進(jìn)行對凋亡的調(diào)控［16］。也有關(guān)于AP的研究提示，TRAF6通過調(diào)節(jié)腺泡細(xì)胞凋亡在雨蛙素誘導(dǎo)的輕度AP中發(fā)揮胰腺保護(hù)作用［16］。這一研究結(jié)論與本研究結(jié)果類似，AEP組胰腺、腸、肝、肺、腎組織中的TRAF6蛋白表達(dá)高于ANP組，且AEP組胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3表達(dá)高于ANP組，cleaved Caspase-3表達(dá)與TRAF6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示TRAF6蛋白可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡在輕度AP進(jìn)程中發(fā)揮保護(hù)胰腺的作用。

凋亡調(diào)控基因XIAP是一種E3泛素連接酶，是IAP家族中最強(qiáng)的凋亡抑制因子。XIAP能通過抑制Caspase和其他方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)抑制Caspase-3和Caspase-7活性時，XIAP的BIR2結(jié)構(gòu)域與活性位點(diǎn)底物溝槽結(jié)合，阻斷正常蛋白進(jìn)入，從而阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程。有報道顯示，胰腺炎狀態(tài)下，XIAP是關(guān)鍵的Caspase調(diào)節(jié)因子，抑制XIAP可使胰腺淀粉酶水平和NF-κB活性降低，TNF-α和IL-6釋放減少，Caspases活性增加，胰腺腺泡細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，壞死減少［17］。在雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠胰腺炎模型中，降解XIAP可促進(jìn)Caspase激活，XIAP表達(dá)與胰腺細(xì)胞凋亡及Caspase-3、7、9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)［18］，這一結(jié)論與本研究結(jié)果一致。本研究中，與ANP組相比，AEP組胰腺及腸、肝、肺、腎等遠(yuǎn)隔臟器中XIAP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，導(dǎo)致XIAP對胰腺及遠(yuǎn)隔臟器細(xì)胞凋亡的抑制作用減弱，從而引起AEP組胰腺及遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞凋亡率和cleaved Caspase-3表達(dá)上調(diào)，因此XIAP在AP中可能通過抑制胰腺及遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞的凋亡，從而影響胰腺炎的病情。

綜上所述，AP小鼠胰腺和遠(yuǎn)隔臟器組織中TRAF6、XIAP表達(dá)異常，且與細(xì)胞凋亡指標(biāo)存在相關(guān)性；RAF6、XIAP在AEP與ANP中的表達(dá)趨勢有所差異。在AP狀態(tài)下，TRAF6和XIAP對細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用，導(dǎo)致不同嚴(yán)重程度AP胰腺及遠(yuǎn)隔臟器組織細(xì)胞凋亡的差異，同時這種細(xì)胞凋亡差異可能影響AP的嚴(yán)重程度。進(jìn)一步研究AP發(fā)生發(fā)展過程中RAF6、XIAP對細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，有望為AP治療提供新的方向。