二甲雙胍對肺泡上皮細胞氧化損傷的抑制作用及其機制

李鵬，歐陽運萍，陳濤，趙博，楊小軍

1 唐山職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院急診科，河北唐山063000；2 唐山職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院消化內科；3 唐山職業(yè)技術學院附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科

急性肺損傷為嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，威脅生命。研究表明，活化轉錄因子3（STAT3）、核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路參與調控急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展，能夠由促炎因子觸發(fā)，參與細胞增殖、凋亡、炎癥反應等病理生理過程［1-2］。因此，對急性肺損傷的發(fā)病機制進行研究并開發(fā)新的有效治療藥物具有重要意義［3-4］。目前臨床一般使用糖皮質激素與其他抗炎藥物輔助呼吸支持治療急性肺損傷，雖然有一定療效，但急性肺損傷患者的生活質量及病死率仍舊無法得到較好改善。張楚怡［5］研究顯示，NF-κB信號通路與Ⅱ型肺泡上皮細胞的上皮—間質轉化（EMT）進程密切相關。有研究表明，二甲雙胍能夠通過NF-κB信號通路抑制腫瘤細胞生長［6］。Ⅱ型肺泡上皮細胞較難分離獲取且難以在體外傳代，是氧化損傷的主要靶點［7］。有學者利用過氧化氫（H2O2）構建體外急性肺損傷細胞模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素對H2O2誘導的A549細胞氧化損傷有治療作用［8］。人肺泡上皮細胞A549與Ⅱ型肺泡上皮細胞形態(tài)及生化特性相似，因此，2021年6月—2022年12月，本研究以A549細胞為研究對象，觀察二甲雙胍對H2O2誘導的A549細胞氧化損傷的抑制作用，并基于EMT及NF-κB信號通路調控探討相關機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人肺泡上皮細胞A549購自武漢益普生物科技有限公司。二甲雙胍、H2O2、NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082、NF-κB通路激活劑Prostratin購自上海源葉生物科技有限公司，F(xiàn)-12K培養(yǎng)基、胎牛血清購自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8購自南京諾唯贊有限公司，ELISA檢測試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司，一抗［鼠抗人NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、纖維黏連蛋白（FN）及內參蛋白（β-actin）］、辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗鼠IgG）購自上海翌圣生物科技股份有限公司。BZ-X倒置熒光顯微鏡購自中國基恩士有限公司，VS-840-1型層流超凈工作臺購自上海博迅實業(yè)有限公司，3H16RI型智能高速冷凍離心機購自湖南赫西儀器裝備有限公司，Victor X3型全自動酶標儀購自美國Perkin Elmer公司。

1.2 細胞分組處理及二甲雙胍作用濃度篩選 將凍存的A549細胞于-80 ℃超低溫冰箱中取出并進行復蘇，加入F-12K培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素）于37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)，待細胞貼壁（80% ～ 90%）后傳代，取第3代（對數(shù)生長期細胞）進行實驗。將細胞分為對照組、模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組。對照組不給予藥物干預，模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組給予400 μmol/L H2O2刺激24 h構建體外急性肺損傷細胞模型；二甲雙胍組在此基礎上分為三個濃度亞組，分別給予2.5、5、10 mmol/L的二甲雙胍；BAY 11-7082組加入5 mmol/L的BAY 11-7082。采用CCK-8試劑盒檢測細胞活力，對照組、模型組、BAY 11-7082組及2.5、5、10 mmol/L二甲雙胍組細胞活力分別為0.97 ± 0.09、0.40 ±0.04、0.83 ± 0.06、0.47 ± 0.03、0.71 ± 0.04、0.76 ±0.05，模型組細胞活力低于對照組，5、10 mmol/L二甲雙胍組細胞活力高于模型組（P均＜0.05），選擇5 mmol/L為二甲雙胍最佳作用濃度。抑制劑組、激活劑組造模后給予5 mmol/L二甲雙胍，并分別加入5 μmol/L的BAY 11-7082和1 μmol/L的Prostratin。后置培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）培養(yǎng)細胞，各組均干預24 h。

1.3 細胞形態(tài)和生長觀察 取各組細胞，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。

1.4 細胞遷移率測算 取各組細胞接種于6孔板，細胞密度達90%后用移液器槍頭（200 μL）劃痕，后置培養(yǎng)箱（于37 ℃，5% CO2）培養(yǎng)24 h。顯微鏡下拍照記錄0 h（S0）和24 h（S24）劃痕情況。Image J軟件分析遷移面積。細胞遷移率=（S0遷移面積-S24遷移面積）/S0遷移面積×100%。

1.5 細胞培養(yǎng)液上清丙二醛（MDA）、超氧化物岐化酶（SOD）檢測 采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)液上清中的MDA、SOD，按試劑盒說明書操作。

1.6 細胞中EMT及NF-κB信號通路相關蛋白檢測 收集各組細胞，提取總蛋白定量后上樣，電泳后轉膜，封閉2 h。加入稀釋一抗（NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN及β-actin）4 ℃孵育過夜后TBST洗滌，加入二抗（山羊抗鼠IgG）孵育2 h，洗滌3次，凝膠成像系統(tǒng)顯影后拍照記錄。Image J軟件分析蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS26.0軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett′st檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態(tài)及生長情況比較 干預24 h后，對照組和抑制劑組細胞生長良好，具有較強的貼壁能力，細胞數(shù)量較多且形狀為正常生長狀態(tài)，碎片較少；二甲雙胍組和BAY 11-7082組細胞生長狀態(tài)次之；模型組和激活劑組細胞生長受抑制最明顯，細胞數(shù)量最少，貼壁能力最弱，細胞形狀不規(guī)則且細胞碎片增多。見圖1。

圖1 各組細胞形態(tài)

2.2 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較與對照組相比，模型組細胞培養(yǎng)液上清MDA水平升高、SOD水平降低（P均＜0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組和BAY 11-7082組MDA水平降低、SOD水平升高（P均＜0.05）。與二甲雙胍組相比，抑制劑組MDA水平降低、SOD水平升高，激活劑組MDA水平升高、SOD水平降低（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較（）

表1 各組細胞培養(yǎng)液上清中MDA、SOD水平比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

SOD（U/mL）28.31 ± 2.57#28.67 ± 2.32#37.03 ± 3.88&20.12 ± 2.19&19.34 ± 1.96*38.33 ± 3.54組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組MDA（nmol/mL）13.52 ± 1.52#12.92 ± 1.13#8.96 ± 0.88&16.98 ± 1.23&16.82 ± 1.41*8.28 ± 0.74

2.3 各組細胞遷移能力比較 對照組、模型組、二甲雙胍組、BAY 11-7082組、抑制劑組、激活劑組細胞遷移率分別為5.73% ± 0.48%、7.02% ± 2.32%、20.83% ± 1.79%、20.14% ± 1.73%、6.29% ±0.43%、34.51% ± 2.39%。與對照組相比，模型組細胞遷移率顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，二甲雙胍組和BAY 11-7082組細胞遷移率降低（P均＜0.05）；與二甲雙胍組相比，抑制劑組細胞遷移率下降，激活劑組細胞遷移率增高（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細胞遷移情況（×4）

2.4 各組細胞EMT相關蛋白表達比較 模型組E-鈣黏蛋白表達低于對照組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達高于對照組（P均＜0.05）。二甲雙胍組、BAY 11-7082組E-鈣黏蛋白表達高于模型組，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達低于模型組（P均＜0.05）。與二甲雙胍組相比，抑制劑組E-鈣黏蛋白表達升高，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達降低；激活劑組E-鈣黏蛋白表達下降，N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達增加（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞EMT相關蛋白表達比較（）

表2 各組細胞EMT相關蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

FN 0.30 ± 0.02#0.30 ± 0.03#0.11 ± 0.01&0.50 ± 0.02&0.50 ± 0.04*0.08 ± 0.01組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組E-鈣黏蛋白0.51 ± 0.06#0.50 ± 0.05#0.74 ± 0.09&0.20 ± 0.02&0.20 ± 0.02*0.80 ± 0.05 N-鈣黏蛋白0.30 ± 0.03#0.30 ± 0.03#0.11 ± 0.02&0.70 ± 0.04&0.80 ± 0.03*0.10 ± 0.01波形蛋白0.43 ± 0.04#0.40 ± 0.04#0.30 ± 0.05&0.81 ± 0.04&0.80 ± 0.04*0.20 ± 0.03

2.5 各組細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達比較 模型組p-NF-κB p65蛋白表達高于對照組（P＜0.05）。二甲雙胍組和BAY 11-7082組p-NF-κB蛋白表達低于模型組（P均＜0.05）。抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達低于二甲雙胍組，激活劑組p-NF-κB p65蛋白表達高于二甲雙胍組（P均＜0.05）。見表3。

表3 各組細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（）

表3 各組細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，與二甲雙胍組相比，&P＜0.05。

p-NF-κB p65 0.21 ± 0.02#0.20 ± 0.03#0.10 ± 0.02&0.40 ± 0.02&0.42 ± 0.02*0.10 ± 0.01組別二甲雙胍組BAY 11-7082組抑制劑組激活劑組模型組對照組NF-κB p65 0.11 ± 0.02 0.10 ± 0.01#0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.10 ± 0.02 0.10 ± 0.01

3 討論

急性肺損傷作為呼吸系統(tǒng)常見疾病，病理特征多表現(xiàn)為肺泡水腫和肺間質損害，可由創(chuàng)傷、燒傷、感染和休克引發(fā)，發(fā)病急、預后差［9］。因缺乏有效治療方法，急性肺損傷發(fā)病率及病死率較高，受到學者們的廣泛關注［10］。急性肺損傷會導致較為嚴重的并發(fā)癥，因此研發(fā)藥物減輕急性肺損傷對于治療肺臟疾病具有重要意義［11］。二甲雙胍是臨床常用的雙胍類口服降糖藥［12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除了具有降糖作用外，二甲雙胍還能有效減輕細胞或組織損傷。盛琦等［13］指出，二甲雙胍可減輕H2O2誘導的細胞損傷。WANG等［14］的研究表明，二甲雙胍能夠減輕脂多糖誘導的急性肺組織損傷。但二甲雙胍的肺保護作用機制尚不明確。

本研究結果顯示，H2O2處理后A549細胞活力明顯降低，而中高濃度二甲雙胍處理后細胞活力得到恢復，提示H2O2對細胞活力有抑制作用，而二甲雙胍能夠逆轉這一作用。后續(xù)實驗結果表明，H2O2誘導后細胞生長明顯受到抑制，遷移率、MDA水平上升，SOD水平下降，提示H2O2促進細胞遷移并加劇了氧化損傷。在經過二甲雙胍或BAY 11-7082處理后，上述指標變化被顯著扭轉，提示二甲雙胍和BAY 11-7082都可以抑制H2O2誘導的A549細胞遷移，具有減輕氧化損傷的作用。肺纖維化后肺泡結構損壞，上皮細胞及巨噬細胞受損，并釋放出大量促纖維化因子，促進Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生EMT。研究顯示，急性肺損傷早期E-鈣黏蛋白表達水平降低，波形蛋白表達水平升高［15］。本研究結果表明，H2O2誘導能夠抑制E-鈣黏蛋白表達，促進N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN蛋白表達，二甲雙胍或BAY 11-7082處理后，E-鈣黏蛋白表達增高，而N-鈣黏蛋白、波形蛋白及FN表達降低，提示二甲雙胍和BAY 11-7082可能是通過上調E-鈣黏蛋白的表達和下調N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN的表達，從而抑制H2O2誘導的A549細胞遷移并減輕氧化損傷。

NF-κB信號通路在細胞分化、凋亡、遷移過程中均發(fā)揮重要生物學功能。研究顯示，NF-κB信號通路在急性肺損傷炎癥過程中也發(fā)揮重要作用［16］。研究證實，下調NF-κB信號通路蛋白表達能夠通過降低氧化應激損傷和炎癥反應從而減輕急性肺損傷［17］。裴彩霞等［18］研究發(fā)現(xiàn)，桔梗皂苷D能夠作用于NF-κB信號通路從而減輕脂多糖誘導的急性肺損傷。另有研究顯示，在脂多糖誘導的急性肺損傷中，二甲雙胍能夠發(fā)揮保護作用［19］。CHEN等［20］研究認為，二甲雙胍可能通過抑制NF-κB信號通路來發(fā)揮抗炎作用。本研究檢測了各組細胞中的NF-κB信號通路相關蛋白，結果顯示，模型組p-NF-κB p65蛋白表達高于對照組；二甲雙胍組和BAY 11-7082組p-NF-κB蛋白表達低于模型組；抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達低于二甲雙胍組，激活劑組p-NF-κB p65蛋白表達高于二甲雙胍組，提示二甲雙胍和BAY 11-7082可能抑制了NF-κB通路的信號轉導，二甲雙胍可能是通過抑制NF-κB信號通路，上調E-鈣黏蛋白表達，下調N-鈣黏蛋白、波形蛋白、FN表達，從而抑制H2O2誘導的A549細胞遷移并減輕氧化損傷。

綜上所述，二甲雙胍可減輕H2O2誘導的人肺泡上皮細胞A549氧化損傷，可能與其抑制NF-κB信號通路、抑制細胞遷移和EMT有關。但本研究僅對二甲雙胍與NF-κB信號通路的作用進行了觀察，二甲雙胍抑制細胞遷移和EMT是否與其他通路相關仍有待進一步研究。