生酮飲食對EGFR/KRAS基因突變型人肺腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的影響及其機(jī)制

鄭友妹，彭倩，張依，原倩影，高永峰，陳紀(jì)濤

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤科 廣東高校生物靶向診治與康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510700

飲食結(jié)構(gòu)的改變對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要［1-2］。生酮飲食是一種由高比例脂肪、極低碳水化合物、適量蛋白質(zhì)構(gòu)成的飲食方案，該方案模擬空腹?fàn)顟B(tài)新陳代謝，誘導(dǎo)酮體產(chǎn)生作為機(jī)體能量的主要來源［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞線粒體功能障礙、酮體分解限速酶3-琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶1（OXCT1）和β-羥基丁酸脫氫酶1（BDH1）基因表達(dá)缺失，可引起酮體供能障礙，抑制腫瘤細(xì)胞生長［4-5］。在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，表皮生長因子受體（EGFR）和Kirsten大鼠肉瘤病毒基因同源物（KRAS）基因突變起到重要的驅(qū)動作用［6］。在前期工作中，我們選擇了兩種經(jīng)典突變型肺癌細(xì)胞模型，EGFR突變型肺癌細(xì)胞株P(guān)C9和KRAS基因突變型細(xì)胞株A549［7-8］，對這兩株細(xì)胞開展酮體β-羥丁酸（β-HB）干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)生酮飲食可抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，同時出現(xiàn)了促進(jìn)PC9細(xì)胞增殖和遷移的表型。有學(xué)者向非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1299無血清培養(yǎng)基中加入β-HB，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞通過OXCT1調(diào)控β-HB代謝，促進(jìn)其自身增殖［9］。查詢公認(rèn)的HPA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)OXCT1基因在A549細(xì)胞中表達(dá)明顯低于PC9細(xì)胞。然而，對于A549、PC9細(xì)胞酮代謝的具體調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。2022年7—8月，本研究建立了A549、PC9細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察生酮飲食對人肺腺癌兩種基因突變型裸鼠移植瘤生長的影響，并探索可能的作用機(jī)制，旨在開發(fā)突變型肺癌的新療法和抗腫瘤酮代謝的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動物與主要材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、PC9購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。24只雌性SPF級BALB/c-nu裸鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體質(zhì)量14 ～ 17 g，鼠齡28 ～ 40 d，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級屏障設(shè)施中。標(biāo)準(zhǔn)化飼料和生酮飲食飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司加工而成。胎牛血清購自澳洲Gibico公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Corning公司。雅培血糖、血酮體試紙及血糖血酮體儀購自康伴保健器械專營店。人肺癌裸鼠皮下移植瘤轉(zhuǎn)錄組測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。本動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與裸鼠皮下移植瘤制作 A549、PC9細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞均處于對數(shù)生長期、細(xì)胞量達(dá)到每只裸鼠接種1×106數(shù)量級時，用胰酶將兩種細(xì)胞分別消化，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL。為保持細(xì)胞活性，將細(xì)胞懸液置于冰上以降低細(xì)胞代謝。接種時先混勻，再用1 mL注射器吸取0.2 mL細(xì)胞懸液緩慢注射到裸鼠右前肢皮下，按壓30 s緩慢拔出針頭以防懸液漏出。

1.3 動物分組及飲食干預(yù) 制作裸鼠移植瘤成功后，瘤體直徑小于2 mm時兩種裸鼠均常規(guī)進(jìn)食，于瘤體直徑達(dá)到2 mm時開始飲食干預(yù)。按照喂養(yǎng)方式將每種裸鼠分為標(biāo)準(zhǔn)飲食組（SD組）和生酮飲食組（KD組），每組6只。SD組和KD組分別采用標(biāo)準(zhǔn)飲食（飼料外觀呈顆粒狀，主要營養(yǎng)成分為5.28%脂肪、22.1%蛋白質(zhì)和52%碳水化合物）和生酮飲食（飼料外觀呈乳糜狀，主要營養(yǎng)成分為69%脂肪、20%蛋白質(zhì)及3%碳水化合物）。連續(xù)飲食干預(yù)30 d。

1.4 裸鼠體質(zhì)量、血糖、血酮體檢測 每天記錄裸鼠一般情況（包括活動、毛色、飲食等）。接種當(dāng)天測量一次裸鼠體質(zhì)量，以后每5 d重復(fù)測量。在飲食干預(yù)第1、10、20、30天采集尾靜脈血5 μL檢測血糖和血酮體，檢測儀器為雅培超越立妥血糖儀。

1.5 瘤體體積、質(zhì)量檢測及臟器病理組織觀察飲食干預(yù)第30天，頸椎脫臼法處死裸鼠后取材測量瘤重，將腫瘤組織送北京諾禾致源科技股份有限公司完成測序。采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長短徑、計(jì)算腫瘤體積和抑瘤率。抑瘤率=（SD組平均體積-KD組平均體積）/SD平均體積×100%。分別切取裸鼠的腫瘤、心、肝、肺、腎和腦組織，甲醛固定后，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察病理組織變化。

1.6 A549、PC9細(xì)胞中酮代謝關(guān)鍵基因OXCT1和BDH1檢測 通過人類蛋白質(zhì)圖譜項(xiàng)目（HPA）數(shù)據(jù)庫檢索酮代謝關(guān)鍵基因OXCT1、BDH1在RNA Cell line模塊的表達(dá)，進(jìn)一步通過Lung Cancer模塊找出A549、PC9細(xì)胞株，比較OXCT1和BDH1在兩種細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。

1.7 KD組與SD組A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤差異表達(dá)基因篩選及分析 在完成基因表達(dá)定量分析后，篩選KD組與SD組A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤的差異表達(dá)基因。按照常用經(jīng)驗(yàn)值，差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)為|log2（FoldChange）|≥1及校正P≤0.05。采用火山圖直觀展示每個比較組合的差異基因分布情況；采用熱圖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和差異數(shù)據(jù)的具像化展示；采用clusterProfiler軟件對差異基因集進(jìn)行KEGG通路富集分析，KEGG通路富集以校正P＜0.05作為顯著性富集的閾值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；重復(fù)測量資料比較采用重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組荷瘤裸鼠體質(zhì)量、血糖、血酮體比較 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)裸鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KD組血糖水平略低于SD組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第10天開始，兩種荷瘤裸鼠KD組血酮體水平均高于SD組（P均＜0.05）。見表1 ～ 3。

表1 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)A549、PC9細(xì)胞荷瘤裸鼠體質(zhì)量比較（g，）

表1 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)A549、PC9細(xì)胞荷瘤裸鼠體質(zhì)量比較（g，）

組別KD組A549細(xì)胞PC9細(xì)胞SD組A549細(xì)胞PC9細(xì)胞體質(zhì)量第0天第6天第12天第18天第24天第30天16.91 ± 1.27 17.49 ± 1.48 18.74 ± 1.80 19.79 ± 2.12 18.95 ± 1.53 20.48 ± 1.70 19.60 ± 1.69 20.99 ± 1.95 19.64 ± 1.81 20.96 ± 2.04 19.86 ± 1.92 21.58 ± 2.65 20.9 ± 1.33 21.82 ± 0.98 18.67 ± 1.17 18.98 ± 1.51 19.20 ± 1.44 19.98 ± 1.28 19.31 ± 1.12 20.11 ± 1.28 21.04 ± 1.26 21.86 ± 1.43 21.04 ± 1.37 21.81 ± 1.12

表2 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)A549細(xì)胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

表2 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)A549細(xì)胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

注：與同時點(diǎn)SD組相比，*P＜0.05。

組別KD組第1天第10天第20天第30天SD組第1天第10天第20天第30天血糖血酮體6.04 ± 0.32 6.30 ± 0.56 4.92 ± 0.96 4.88 ± 0.57 0.80 ± 0.04 1.30 ± 0.23*1.44 ± 0.50*1.18 ± 0.40*0.79 ± 0.05 0.90 ± 0.12 0.7 ± 0.00 0.84 ± 0.15 6.06 ± 0.33 6.58 ± 0.48 5.60 ± 0.37 5.80 ± 0.35

表3 兩組飲食干預(yù)不同時點(diǎn)PC9細(xì)胞荷瘤裸鼠血糖、血酮體水平比較（mmol/L，）

注：與同時點(diǎn)SD組相比，*P＜0.05。

血酮體血糖5.26 ± 0.13 5.52 ± 0.28 4.54 ± 0.54 4.96 ± 0.72 0.81 ± 0.05 1.00 ± 0.32*1.34 ± 0.38*0.94 ± 0.15*組別KD組第1天第10天第20天第30天SD組第1天第10天第20天第30天0.83 ± 0.04 0.90 ± 0.10 0.66 ± 0.05 0.58 ± 0.13 5.84 ± 0.48 6.00 ± 0.96 5.36 ± 0.61 4.92 ± 0.34

2.2 兩組瘤體大小、重量及臟器病理改變比較 與SD組相比，KD組A549細(xì)胞裸鼠移植瘤體積變小、質(zhì)量變輕，KD組PC9細(xì)胞移植瘤體積增大、質(zhì)量增加（P均＜0.05）。KD組A549、PC9細(xì)胞移植瘤的抑瘤率分別為58%、-133%。見圖1、表4。HE結(jié)果顯示兩種荷瘤裸鼠各臟器未見明顯病理改變。

圖1 兩組飲食干預(yù)第30天A549、PC9細(xì)胞荷瘤裸鼠移植瘤外觀

表4 兩組A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（）

表4 兩組A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、抑瘤率比較（）

注：與同種細(xì)胞裸鼠移植瘤SD組相比，*P＜0.05。

組別KD組A549細(xì)胞PC9細(xì)胞SD組A549細(xì)胞PC9細(xì)胞腫瘤體積（mm3）腫瘤質(zhì)量（g）抑瘤率（%）232.81 ± 85.79*1632.96 ± 240.85*0.13 ± 0.05*0.94 ± 0.30*58-133 357.52 ± 103.92 761.55 ± 277.82 0.23 ± 0.08 0.33 ± 0.20

2.3 A549、PC9細(xì)胞中OXCT1、BDH1基因表達(dá)比較 HPA數(shù)據(jù)庫查詢及分析結(jié)果顯示，在A549細(xì)胞中，BDH1 RNA nTPM為2.3，OXCT1 RNA nTPM為2.3；在PC9細(xì)胞中，BDH1 RNA nTPM為16.2，OXCT1 RNA nTPM為19.5。OXCT1、BDH1基因在PC9細(xì)胞中的表達(dá)高于A549細(xì)胞。

2.4 KD組與SD組A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤的差異表達(dá)基因

2.4.1 兩組酮代謝關(guān)鍵基因表達(dá)比較 KD組A549細(xì)胞移植瘤中OXCT1基因（11.79 ± 2.98）表達(dá)低于SD組（57.01 ± 16.42），P＜0.05。KD組PC9細(xì)胞移植瘤中OXCT1基因（311.00 ± 90.00）表達(dá)高于SD組（88.00 ± 11.36），P＜0.05。A549荷瘤裸鼠SD組、KD組腫瘤中BDH1基因表達(dá)量分別為44.00 ±3.33、53.33 ± 3.78；PC9荷瘤裸鼠SD組、KD組腫瘤中BDH1基因表達(dá)量分別為203.00 ± 9.33、226.33 ±17.56。BDH1基因在KD組和SD組兩種細(xì)胞移植瘤中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4.2 差異表達(dá)基因及聚類分析 SD組和KD組A549細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因2 998個，與SD組相比，KD組中有1 600個基因表達(dá)下調(diào)，1 398個基因表達(dá)上調(diào)。SD組和KD組PC9細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因1 229個，與SD組相比，KD組中有648個基因表達(dá)下調(diào)，581個基因表達(dá)上調(diào)。見OSID碼圖1。不同飲食干預(yù)條件下，A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤中基因表達(dá)存在明顯差異，且A549和PC9細(xì)胞荷瘤裸鼠相比，其腫瘤組織中基因表達(dá)也存在差異。見OSID碼圖2。

2.4.3 差異表達(dá)基因KEGG信號通路富集分析結(jié)果 SD組和KD組A549細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞周期、ECM受體相互作用、細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性的配體—受體相互作用、腫瘤信號通路、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)信號通路、JAKSTAT信號通路、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染等信號通路。SD組和KD組PC9細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞周期信號通路、IL-17信號通路、Relaxin信號通路、阿米巴病、蛋白質(zhì)消化和吸收通路、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、p53信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、AGE-RAGE和NF-κB等信號通路。見表5 ～ 6。

表5 兩組A549細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析結(jié)果（校正P值排序前10位）

表6 兩組PC9細(xì)胞移植瘤差異表達(dá)基因KEGG信號通路分析結(jié)果（校正P值排序前10位）

3 討論

2021年NCCN指南V1版肺癌治療方案指出，EGFR突變作為腫瘤發(fā)病重要的驅(qū)動因子，30%以上的肺癌患者存在該基因突變；V5版指出KRAS是非小細(xì)胞肺癌常見的致癌突變，在中國人群發(fā)生率約為9.8%，僅次于EGFR突變。針對EGFR、KRAS的藥物療效更好，患者容易耐受，可明顯延長患者生存期，這也是肺癌患者治療前盡量做基因突變檢測的原因。但隨著靶向藥的反復(fù)使用，除了治療費(fèi)用昂貴外，患者逐漸出現(xiàn)獲得性耐藥，一定程度上限制了其在臨床上的應(yīng)用［10-11］。因此，繼續(xù)探索肺癌治療有效手段，有望讓更多患者從中受益。

膳食結(jié)構(gòu)在人類疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起到很重要的作用［12-13］。生酮飲食最早用于腦部疾?。ㄈ绨d癇）的治療，因療效顯著而被確立為一種食療方案［14］。隨著研究不斷深入，許多學(xué)者將生酮飲食與代謝性疾病的治療聯(lián)系在一起［15-16］。腫瘤被認(rèn)為是一種代謝性疾病，能量代謝重編程使腫瘤獲得迅速的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移［17-18］。目前研究發(fā)現(xiàn)，酮體在肝臟脂肪酸氧化分解的主要產(chǎn)物β-HB通過與Hcar2（一種G蛋白偶聯(lián)受體）結(jié)合并激活Hopx表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯來抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長［19］。生酮飲食除了對葡萄糖/胰島素信號發(fā)揮抑制作用外，還可以通過降低氧化應(yīng)激、線粒體代謝和炎癥反應(yīng)抑制腫瘤的增殖［20］。雖然目前生酮飲食抗腫瘤治療相關(guān)研究已經(jīng)取得巨大進(jìn)展，然而其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明。

β-HB作為生酮飲食產(chǎn)生的主要脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，常用于體內(nèi)外腫瘤細(xì)胞酮體代謝相關(guān)研究［21-22］。前期研究中我們對突變型肺癌細(xì)胞株開展β-HB干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)生酮飲食可抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移，但可促進(jìn)PC9細(xì)胞增殖和遷移的表型（數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）。為了進(jìn)一步探索潛在機(jī)制，本研究建立A549、PC9細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，分別采用生酮飲食和標(biāo)準(zhǔn)飲食干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)KD組裸鼠血酮體明顯升高，符合生酮飲食治療動物模型數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)。體質(zhì)量直接反映動物的整體狀態(tài)，兩組相比無明顯差異，病理檢查顯示飲食干預(yù)對裸鼠臟器無明顯病理損害，說明生酮飲食對裸鼠無明顯副作用。腫瘤體積和瘤重測量結(jié)果表明，生酮飲食可抑制A549移植瘤生長但促進(jìn)PC9細(xì)胞移植瘤生長，這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。此外，我們前期實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)生酮飲食能夠抑制A549細(xì)胞增殖［23］，這說明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信且具有良好的重復(fù)性。

據(jù)文獻(xiàn)報道，向無血清的培養(yǎng)基中加入β-HB能夠促進(jìn)肺癌H1299細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞中OXCT1表達(dá)升高，且可以通過激活NF-κB信號通路來促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的生長和遷移［24］。HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，PC9細(xì)胞中OXCT1基因表達(dá)高于A549細(xì)胞，腫瘤組織測序結(jié)果進(jìn)一步印證數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果。據(jù)此，我們推測生酮飲食干預(yù)后，PC9細(xì)胞和PC9細(xì)胞移植瘤的生長明顯加快，可能與酮體代謝增強(qiáng)相關(guān)，具體機(jī)制尚未闡明，這也是下一步需要探究的問題。有研究發(fā)現(xiàn)對EGFR突變型非小細(xì)胞肺癌靶向治療容易產(chǎn)生獲得性耐藥，降脂藥物和分子靶向藥物聯(lián)合使用不僅可以增強(qiáng)體外治療效果，還可以減緩體內(nèi)腫瘤的生長［25］，這提示對人EGFR基因突變型肺腺癌可采用與降低血脂的藥物聯(lián)合治療方案。

從差異基因表達(dá)和聚類分析結(jié)果來看，兩種裸鼠移植瘤基因表達(dá)存在明顯差異，且每種荷瘤裸鼠采取不同的飲食干預(yù)，同樣明顯影響腫瘤組織中基因的表達(dá)。針對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，生酮飲食對A549細(xì)胞移植瘤的生長抑制作用可能與差異表達(dá)基因富集信號通路中細(xì)胞周期阻滯和JAK-STAT信號通路激活相關(guān)［26］。在PC9細(xì)胞移植瘤測序結(jié)果中，許多差異表達(dá)基因均富集在重要的腫瘤信號通路，例如IL-17、Relaxin、AGE-RAGE和NF-κB等信號通路［27-29］，提示生酮飲食干預(yù)促進(jìn)PC9細(xì)胞增殖可能與以上信號通路激活有關(guān)，具體的作用機(jī)制還需要大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究選擇兩種經(jīng)典基因突變型肺癌細(xì)胞株P(guān)C9、A549作為研究對象，在前期體外實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)生酮飲食干預(yù)可導(dǎo)致突變型細(xì)胞株出現(xiàn)相反增殖表型。接下來通過對腫瘤組織開展轉(zhuǎn)錄組測序分析，找到荷瘤裸鼠不同干預(yù)條件下腫瘤組織中存在差異表達(dá)的酮代謝關(guān)鍵酶和活化信號通路。以上研究結(jié)果提示生酮飲食對EGFR、KRAS突變型肺癌均有一定調(diào)控作用，有望為突變型肺癌的治療提供參考。