SLC5A8基因過(guò)表達(dá)的炎癥性腸病細(xì)胞模型結(jié)構(gòu)及IL-8、TGF-β1表達(dá)變化觀察

趙澤滿，吳育朔，劉雅涵，矯政洧，蔡思源，靳小石

1 河北大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北保定071000；2 河北大學(xué)附屬醫(yī)院普通外科；3 河北大學(xué)附屬醫(yī)院門診部

炎癥性腸?。↖BD）是一種以慢性、復(fù)發(fā)性腸道炎癥為特征的疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，可累及腸道的任何部分，臨床上常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、血便、體質(zhì)量減輕等，還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥［1］。SLC5A8基因作為被發(fā)現(xiàn)的SLC5基因家族中的第8個(gè)成員，其編碼的蛋白是與鈉離子耦聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)短鏈脂肪酸（SCFAs）高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體，在結(jié)腸、回腸中大量表達(dá)［2］。SCFAs能通過(guò)SLC5A8調(diào)控的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)，參與免疫調(diào)節(jié)，因此推測(cè)SLC5A8可能通過(guò)免疫調(diào)控參與了IBD的發(fā)生。2022年1—10月，本研究觀察了SLC5A8基因過(guò)表達(dá)后，脂多糖誘導(dǎo)的IBD細(xì)胞模型結(jié)構(gòu)及IL-8、TGF-β1水平變化，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要材料 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC由某附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)，置于含10%胎牛血清+1%青—鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。脂多糖購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，RPMI1640培養(yǎng)基、青—鏈霉素溶液購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，TRIzol Universal總RNA提取試劑購(gòu)自TIANGEN公司，HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，RT-qPCR引物購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，SLC5A8過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司，Human IL-8 ELISA Kit、Human/Mouse/Rat TGF-β1ELISA Kit購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞分組與模型制作 將FHC細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組及實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP空載質(zhì)粒；模型組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP空載質(zhì)粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h；實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染SLC5A8基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h。

1.3 細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察 棄去細(xì)胞上清液，剩余細(xì)胞用PBS清洗（2 mL），重復(fù)2次；用電鏡固定液固定細(xì)胞，保存于4 ℃冰箱，透射電鏡下觀察三組細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.4 細(xì)胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1檢測(cè) 提取各組FHC細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR法檢測(cè)IL-8、TGF-β1mRNA。以TBP作為內(nèi)參。TBP上游引物序列為5′-TGTATCCACAGTGAATCTTGGTTG-3′，下游引物序列為5′-GGTTCGTGGCTCTCTTATCCTC-3′；IL-8基因上游引物序列為5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′，下游引物序列為5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′；TGF-β1基因上游引物序列為5′-TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC-3′，下游引物序列為5′-GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA-3′。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s；95 ℃ 3～10 s，60 ℃ 10～30 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2－ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。取細(xì)胞上清液入離心管，離心機(jī)離心（2 600 r/min，10 min）去除沉淀物。采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的IL-8、TGF-β1，按試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism9.4軟件作圖。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用最小顯著性差異法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變 對(duì)照組細(xì)胞膜表面微絨毛無(wú)斷裂，無(wú)脫落，緊密連接結(jié)構(gòu)致密呈帶狀；模型組細(xì)胞膜表面微絨毛變稀疏，脫落，緊密連接的細(xì)胞間隙增寬；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞膜表面存在微絨毛脫落，緊密連接結(jié)構(gòu)部分破壞。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化

2.2 各組細(xì)胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組IL-8 mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清中IL-8水平升高，TGF-β1mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平降低（P均＜0.01）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組IL-8 mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清中IL-8水平降低，TGF-β1mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清中TGF-β1水平升高（P均＜0.01）。見表1。

表1 各組細(xì)胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達(dá)比較（）

表1 各組細(xì)胞及培養(yǎng)液上清中IL-8、TGF-β1表達(dá)比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.01。

組別實(shí)驗(yàn)組模型組對(duì)照組TGF-β1 1.21 ± 0.05#0.30 ± 0.04*1.00 ± 0.03 IL-8 mRNA 1.20 ± 0.10#2.46 ± 0.13*1.00 ± 0.05 IL-8 0.70 ± 0.01#2.29 ± 0.00*1.00 ± 0.01 TGF-β1 mRNA 1.40 ± 0.11#0.72 ± 0.06*1.00 ± 0.05

3 討論

調(diào)查顯示，IBD發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈持續(xù)增高趨勢(shì)［3］。IBD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因仍不十分清楚，所以需要對(duì)IBD機(jī)制做更加深入的研究。SIVAPRAKASAM等［4］的研究顯示，IBD是由于宿主免疫系統(tǒng)和微生物群之間的共生關(guān)系被破壞而導(dǎo)致腸道慢性炎癥，各種因素會(huì)改變腸道微生物群，導(dǎo)致腸道菌群生態(tài)失調(diào)，其中以飲食和膳食纖維兩個(gè)因素較為關(guān)鍵。

SLC5A8可通過(guò)影響?zhàn)つっ庖呦到y(tǒng)的耐受反應(yīng)從而調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)定。有研究表明，SLC5A8基因通過(guò)影響結(jié)腸組織與腸系膜淋巴結(jié)中的CD4+T淋巴細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫［5］。CD4+T淋巴細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-10、IL-8及IL-12等因子影響IBD的發(fā)生和發(fā)展［6-7］。SLC5A8基因的表達(dá)產(chǎn)物是Na+-單羧酸偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其主要功能將細(xì)菌發(fā)酵的短鏈脂肪酸（SCFA）轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。Na+-單羧酸偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在腸道黏膜組織、尤其是在丁酸含量較高的結(jié)腸黏膜組織中含量最多。SCFA主要是由細(xì)菌在結(jié)腸中發(fā)酵膳食纖維并產(chǎn)生，主要包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，它們不僅可以作為結(jié)腸細(xì)胞能量來(lái)源，還具有抑制免疫細(xì)胞活化的功能，其中以丁酸鹽的抗炎效果最為明顯［8-10］。丁酸可以通過(guò)SLC5A8轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞，然后通過(guò)促進(jìn)抗炎因子表達(dá)及抑制促炎因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用［11］。IBD患者由于腸道環(huán)境失調(diào)，影響了丁酸的產(chǎn)生、氧化和吸收［12］。本研究實(shí)驗(yàn)組利用脂多糖構(gòu)建IBD細(xì)胞模型后，再轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)SLC5A8質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)炎癥因子表達(dá)呈下降趨勢(shì)，抗炎因子表達(dá)呈上升趨勢(shì)。因此，我們推測(cè)SLC5A8基因可能參與抑制IBD的發(fā)生發(fā)展。

腸道黏膜損傷是IBD患者的主要特征之一，所以促進(jìn)腸道黏膜愈合可能成為減輕IBD患者臨床癥狀、抑制疾病復(fù)發(fā)的新方向［13］。腸道黏膜損傷的出現(xiàn)預(yù)示著腸上皮屏障破壞。腸黏膜愈合是由上皮細(xì)胞增殖和分化完成的，巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞共同參與調(diào)節(jié)［14］。本研究透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與模型組相比，細(xì)胞膜表面微絨毛脫落減少，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞較少?？梢酝茰y(cè)出SLC5A8基因可能通過(guò)維持腸道黏膜的完整性，保護(hù)IBD腸道黏膜。

IL-8作為一種促炎細(xì)胞因子，通過(guò)介導(dǎo)多種信號(hào)通路，在許多炎癥性疾病包括IBD中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［15-16］。WALANA等［17］應(yīng)用IL-8拮抗劑G31P治療DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型，顯著減低了血清IL-8水平，上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)，抑制了炎癥的發(fā)展，減輕了結(jié)腸纖維化。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中IL-8 mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清中IL-8水平低于模型組，推測(cè)SLC5A8基因可能通過(guò)抑制IL-8的表達(dá)來(lái)干預(yù)IBD。

人體腸黏膜系統(tǒng)中存在著多種的免疫細(xì)胞亞群，其活性受到細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，其中包括TGF-β1［18］。TGF-β1是一種由多種類型細(xì)胞產(chǎn)生的具有多重效應(yīng)的細(xì)胞因子，可控制腸黏膜免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞的活化、生長(zhǎng)、增殖和分化。TGF-β1可促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞（Th）17和Th9分化的能力，從而在一些炎癥性疾病中發(fā)揮作用［19］。炎癥T淋巴細(xì)胞及其相關(guān)促炎細(xì)胞的積累是IBD患者的顯著特征之一，與IBD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［20］。本研究中實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)及培養(yǎng)液上清TGF-β1水平上調(diào)，提示SLC5A8基因干預(yù)IBD的機(jī)制可能還與上調(diào)TGF-β1分泌、進(jìn)一步影響T細(xì)胞免疫有關(guān)。

綜上所述，SLC5A8基因過(guò)表達(dá)有助于維持IBD細(xì)胞模型的結(jié)構(gòu)，抑制炎癥細(xì)胞因子IL-8表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子TGF-β1表達(dá)，從而有助于減輕IBD的炎癥反應(yīng)。以上研究結(jié)果為IBD的治療提供了新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。