新疆農(nóng)牧區(qū)老年肌少癥患者外周血PBMC中TWEAK、Fn14及NF-κB通路基因表達分析

趙艷姣，劉金玲，卓婭·買買提烏斯?jié)M，馮智群，楊星雨，王紅梅

1 新疆醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，烏魯木齊830000；2 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院綜合保健內(nèi)科二病區(qū)；3 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院

隨著社會經(jīng)濟、醫(yī)療水平的提高及人們保健意識的增強，人口平均壽命逐漸延長，老齡化趨勢日益明顯［1］。人類衰老過程常伴隨著骨骼肌質(zhì)量和功能下降，其嚴重下降可致肌肉減少癥（后簡稱肌少癥）。肌少癥為年齡相關(guān)的骨骼肌肌量下降、肌肉力量和（或）軀體功能低下［2］，可增加老年人群認知障礙、骨折、跌倒、住院和全因死亡的風險［3］。目前肌少癥的發(fā)病機制尚未明確，低水平的慢性炎癥狀態(tài)被認為是其重要發(fā)病機制之一，即促炎細胞因子［如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）等］水平升高［4］。腫瘤壞死因子樣細胞凋亡弱誘導(dǎo)物（TWEAK）屬于TNF超家族促炎細胞因子。TWEAK/成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)早期反應(yīng)蛋白14（Fn14）軸與多種生物學(xué)反應(yīng)有關(guān)，包括炎癥、血管生成、骨骼肌萎縮和細胞凋亡等［5］。研究表明，TWEAK可通過激活泛素—蛋白酶體和核因子κB（NF-κB）系統(tǒng)導(dǎo)致蛋白合成減少、水解增強及炎癥因子升高，造成肌萎縮和功能減退［6］。目前國內(nèi)外關(guān)于肌少癥患者TWEAK/Fn14軸及其下游NF-κB通路因子表達變化的研究較少。2022年1—12月，本研究觀察了新疆農(nóng)牧區(qū)老年肌少癥患者外周血單個核細胞（PBMC）中TWEAK、Fn14及NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的表達變化，并分析其與老年肌少癥發(fā)病的相關(guān)性?，F(xiàn)報告如下。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 納入標準：年齡≥65歲；具有本地戶口的常住農(nóng)牧區(qū)居民；能獨立行走，未使用輔具。排除有認知障礙、言語障礙、聽力障礙者，精神疾病患者，有代謝性疾病及重要器官功能衰竭等病史者，近期有手術(shù)史者，服用激素類藥物者，合并感染性疾病者，體內(nèi)配戴心臟起搏器等電子醫(yī)療器械者，惡性腫瘤、肺結(jié)核等消耗性疾病患者。肌少癥診斷標準參考中國老年人肌少癥診療專家共識（2021）及2019年亞洲肌少癥工作組制定的標準［7］。采用多級隨機抽樣方法，于北疆木壘縣、南疆洛浦縣農(nóng)牧區(qū)居住的社區(qū)老年人群中進行抽樣，選取肌少癥患者與健康人群各40例分別納入病例組和對照組。具體抽樣過程及方法見OSID碼圖1。由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的專職人員收集研究對象的性別、年齡、身高、骨骼肌指數(shù)（SMI）、握力、步速、收縮壓、舒張壓、民族、學(xué)歷、婚育史等信息。本研究經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有參與者簽署知情同意書。病例組男29例、女11例，漢族27例、其他民族13例，文化程度為高中及以下16例、高中以上24例，吸煙史12例、飲酒史8例，合并高血壓27例、冠心病11例、糖尿病17例。對照組男23例、女17例，漢族19例、其他民族21例，文化程度為高中及以下22例、高中以上18例，吸煙史10例、飲酒史9例，合并高血壓29例、冠心病8例、糖尿病18例。病例組與對照組年齡、性別、民族、文化程度、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、血生化指標［谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、肌酐（Cr）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）］、握力、步速、吸煙史、飲酒史及合并高血壓、糖尿病、冠心病情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。病例組SMI低于對照組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 病例組與對照組臨床資料比較（n=80， ）

表1 病例組與對照組臨床資料比較（n=80， ）

項目年齡（歲）SBP（mmHg）DBP（mmHg）AST（U/L）ALT（U/L）Cr（μmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）SMI（kg/m2）握力（kg）6 m步速（m/s）病例組75.95 ± 9.69 134.50 ± 19.70 74.55 ± 11.37 22.62 ± 17.18 22.29 ± 21.87 71.83 ± 31.34 1.35 ± 0.57 1.13 ± 0.26 2.08 ± 0.72 6.39 ± 0.60 27.76 ± 9.88 0.92 ± 0.28對照組75.18 ± 8.67 140.85 ± 19.36 75.83 ± 14.75 20.01 ± 6.68 20.44 ± 9.73 69.19 ± 29.93 1.40 ± 0.64 1.27 ± 0.68 2.01 ± 0.97 7.35 ± 1.06 27.17 ± 9.02 1.23 ± 0.99 t P-0.377 1.454 0.433-0.896-0.488-0.385 0.399 1.252-0.331 4.966-0.279 1.890 0.707 0.150 0.666 0.373 0.627 0.701 0.691 0.214 0.742 0.000 0.781 0.062

1.2 外周血PBMC中TWEAK/Fn14及其下游NF-κB信號通路基因檢測 采集兩組空腹靜脈血至少5 mL，入EDTA抗凝的采血管中，充分混勻后立即進行梯度離心，分離血清與PBMC。將PBMC添加1 mL的TRIzol試劑，儲存于-80 ℃冰箱。采用實時熒光定量PCR法檢測PBMC中的TWEAK、Fn14、IκB激酶α（IKKα）、IκB激酶β（IKKβ）、NF-κB p65 mRNA。通過TRIzol法提取收集好的PBMC總RNA，進行cDNA合成。使用Primer5軟件設(shè)計TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κB p65基因及內(nèi)參基因GAPDH引物序列，見表2。PCR體系包括Evagreen 2×qPCR Master Mix 10 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、cDNA 2 μL、RNase-free Water 6.8 μL，總反應(yīng)體積為20 μL。PCR條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min、1個循環(huán)，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。采用SYBR法進行熒光定量檢測，以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

表2 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用t檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗。以性別、年齡作為協(xié)變量，采用協(xié)方差分析，比較肌少癥組、對照組相關(guān)基因的表達差異。相關(guān)性分析采用偏相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血PBMC中TWEAK/Fn14及其下游NF-κB信號通路分子表達比較 病例組外周血PBMC中TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ mRNA表達均高于對照組（P均＜0.05）。見表3。校正性別、年齡后，協(xié)方差分析結(jié)果顯示，病例組外周血PBMC中TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ mRNA表達高于對照組（P均＜0.05）。見表4。

表3 兩組外周血PBMC中TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κB p65 mRNA表達比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別病例組對照組NF-κB p65 1.578 ± 0.987 1.374 ± 1.306 n 40 40 TWEAK 1.364 ± 0.644*1.073 ± 0.464 Fn14 2.938 ± 2.195*1.743 ± 1.464 IKKα 2.149 ± 1.332*1.459 ± 0.959 IKKβ 1.987 ± 1.174*1.456 ± 0.902

表4 校正性別、年齡后兩組外周血PBMC中TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ、NF-κB p65 mRNA表達比較

2.2 病例組外周血PBMC中TWEAK、Fn14表達與NF-κB信號通路基因表達的相關(guān)性 校正性別、年齡后，外周血PBMC中TWEAK、Fn14 mRNA表達呈正相關(guān)（r=0.424，P＜0.01），與IKKα、IKKβ mRNA表達無相關(guān)性；Fn14 mRNA表達與IKKα、IKKβ mRNA表達均呈正相關(guān)（r分別為0.264、0.284，P均＜0.05）；IKKα、IKKβ mRNA表達與NF-κB p65 mRNA表達均呈正相關(guān)（r分別為0.724、0.660，P均＜0.01）。

3 討論

骨骼肌的正常結(jié)構(gòu)和功能在很大程度上取決于肌肉微環(huán)境的穩(wěn)定性。炎性細胞因子是肌肉微環(huán)境的重要組成部分，如TNF-α、IL-6是分解反應(yīng)的重要介質(zhì)［8］。隨著衰老過程，人體會出現(xiàn)慢性低度炎癥狀態(tài)，即老年人普遍存在無癥狀、持續(xù)性、非特異性的輕微炎癥狀態(tài)，為非特異性的C反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6水平輕微升高，導(dǎo)致慢性病、衰弱、殘疾和過早死亡的風險增加［9］。研究表明，慢性低度炎癥可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響肌肉蛋白質(zhì)的合成和分解，導(dǎo)致肌肉質(zhì)量、力量和功能的減弱［10］。

TWEAK是一種促炎細胞因子，屬于TNF超家族配體，在其C末端結(jié)構(gòu)域被蛋白水解切割成可溶形式［11］，并作為三聚分子發(fā)出信號。TWEAK的膜結(jié)合和可溶性形式都具有生物活性。通常TWEAK的眾多生物學(xué)反應(yīng)是通過與Fn14結(jié)合而發(fā)生。Fn14是一種屬于TNF受體超家族（TNFRSF）的Ⅰ型跨膜受體，F(xiàn)n14僅富含一個半胱氨酸的重復(fù)序列，是該家族成員中最小的［12］。與TNFRSF其他成員相似，F(xiàn)n14的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域包含一個TRAF結(jié)合位點，在TWEAK刺激時允許下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［13］。正常情況下，F(xiàn)n14在大多數(shù)細胞和組織中表達水平相對較低，然而在組織損傷和各種病理狀況下，F(xiàn)n14表達急劇增加［14］。ENWERE等［15］研究表明，不同水平的TWEAK可促進或抑制肌原性分化，低水平的TWEAK能夠促進成肌細胞融合，高水平時則抑制肌原性分化。在嚴重損傷或慢性疾病時，持續(xù)的TWEAK/Fn14激活會導(dǎo)致肌萎縮［16］。多項動物模型實驗結(jié)果顯示，TWEAK、Fn14表達增加可抑制骨骼肌再生和生長［17-20］。一項研究表明，與非肌少癥患者相比，調(diào)整混雜因素后，高水平的TWEAK（＞1 276.48 pg/mL）可使肌少癥的發(fā)生風險增加13.4倍［21］。本研究參與者均為老年人，且合并慢性疾病，依據(jù)上述理論，F(xiàn)n14表達會高于正常生理狀態(tài)，病例組外周血PBMC中TWEAK、Fn14 mRNA表達高于對照組；且協(xié)方差分析提示，在校正年齡、性別后病例組TWEAK、Fn14 mRNA亦高于對照組；另外，F(xiàn)n14作為TWEAK的特異性受體，偏相關(guān)分析（校正性別、年齡）提示二者表達呈正相關(guān)，進一步證實老年人肌少癥與外周血PBMC中TWEAK、Fn14 mRNA高表達相關(guān)。

低水平的慢性炎癥狀態(tài)已被認為是肌少癥的重要發(fā)病機制之一。在相關(guān)信號通路中，NF-κB是維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。ZHANG等［22］研究表明，TNF-α、IL-6等炎癥因子可通過誘導(dǎo)NF-κB，加快肌肉蛋白降解，導(dǎo)致肌少癥發(fā)生。RATAJCZAK等［23］發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路是TWEAK/Fn14的下游靶點。NF-κB是主要的促炎轉(zhuǎn)錄因子，它不僅可以介導(dǎo)炎性細胞因子的作用，還可增加其表達［24］。在哺乳動物細胞中，NF-κB以二聚體形式參與炎癥、細胞凋亡、細胞增殖等多種進程，最常見的是NF-κB p50/p65和NF-κB p50/p50［25］。NF-κB可通過經(jīng)典途徑和替代途徑被激活。TNF-α激活經(jīng)典途徑是通過激活I(lǐng)KK復(fù)合物觸發(fā)κB抑制劑（IκB）快速磷酸化，使p65/RelA和p50滯留在細胞質(zhì)中，而NF-κB轉(zhuǎn)錄因子（如p65/RelA、p50和c-Rel）穿梭到細胞核發(fā)揮作用［26］。非經(jīng)典途徑是前體蛋白p100被IKKa同二聚體磷酸化，介導(dǎo)p100水解成p52，p52與RelB結(jié)合易位到細胞核［27］?？梢奍KK復(fù)合物可激活NF-κB通路，該復(fù)合物包含IKKα、IKKβ及IKKγ/NEMO［28］。研究表明，在衰老過程中NF-κB表達增加，老年人肌肉中炎癥相關(guān)的NF-κB蛋白表達水平是年輕人的4倍［29］。JIN等［30］發(fā)現(xiàn)，針刺治療可減少衰老骨骼肌中NF-κB p65的激活，從而改善肌萎縮。動物實驗結(jié)果顯示，香煙煙霧暴露導(dǎo)致的肌萎縮小鼠IKK、NF-κB p65 mRNA顯著升高［31-32］。本研究結(jié)果顯示，病例組外周血PBMC中IKKα、IKKβ mRNA高于對照組，在校正性別、年齡后上述結(jié)果不變，證實老年人肌少癥與外周血PBMC中IKKα、IKKβ mRNA高表達相關(guān)。經(jīng)偏相關(guān)分析顯示，F(xiàn)n14 mRNA與IKKα、IKKβ mRNA表達均呈正相關(guān)，IKKα、IKKβ mRNA表達與NF-κB p65 mRNA表達也呈正相關(guān)；IKKα、IKKβ可激活NF-κB通路發(fā)揮作用，這提示TWEAK/Fn14與NF-κB的激活相關(guān)。本研究中兩組NF-κB p65 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是經(jīng)典途徑激活后的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子不只p65/RelA一種，同時還有p50、c-Rel等因子，同時也不能排除IKKa可激活非經(jīng)典途徑發(fā)揮作用，因此后續(xù)研究中需觀察其他因子的表達差異。此外，目前關(guān)于人類肌少癥的上述研究數(shù)據(jù)相對較少，仍需大樣本研究進一步分析。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，新疆農(nóng)牧區(qū)老年肌少癥患者外周血PBMC中TWEAK、Fn14、IKKα、IKKβ mRNA高表達，TWEAK、Fn14 mRNA表達與IKKα、IKKβ mRNA表達有相關(guān)性，TWEAK、Fn14可能通過調(diào)節(jié)IKK激活NF-κB炎癥通路，參與老年人肌少癥的發(fā)生發(fā)展。然而本研究為橫斷面研究，只能提示相關(guān)性，且樣本量不大，尚需擴大樣本量進一步進行前瞻性研究來驗證以上結(jié)果，并開展細胞和動物實驗研究相關(guān)機制。