丙泊酚對高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及其機(jī)制

王平，汪洋，鞏雪敏，薛艷

湖北省婦幼保健院成人內(nèi)科，武漢430070

糖尿病腎病為常見的糖尿病并發(fā)癥，治療主要是控制血糖、血壓及血脂，但治療效果不佳［1-2］。在糖尿病腎病發(fā)病進(jìn)程中，足細(xì)胞損傷起重要的推動作用［3］。足細(xì)胞損傷包括足突融合、足細(xì)胞活力降低、異常遷移及上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）激活等，足細(xì)胞病理改變是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，也是藥物治療的重要靶點［4-5］。丙泊酚是一種可控性好、效果佳的靜脈全身麻醉藥物，也可用于機(jī)械通氣狀態(tài)下的鎮(zhèn)靜治療及持續(xù)重癥癲癇患者的麻醉。研究表明，丙泊酚有抗炎癥損傷作用，還可增強(qiáng)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞活力［6-7］，丙泊酚誘導(dǎo)還能有效改善糖尿病患者的高凝狀態(tài)，降低血清炎癥因子水平，保護(hù)細(xì)胞免疫功能［8-9］，但丙泊酚對高糖環(huán)境下糖尿病腎病足細(xì)胞的作用及其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。核因子κB（NF-κB）與多種疾病進(jìn)展密切相關(guān)。NF-κB受體激活劑可以通過促進(jìn)腎小球氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而誘導(dǎo)糖尿病腎病發(fā)?。?0］。有研究表明，丙泊酚可通過抑制NF-κB信號通路從而減輕腸上皮細(xì)胞炎癥損傷［11］。2022年2月—2023年2月，本研究觀察了丙泊酚對高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用，并基于NF-κB信號通路探討相關(guān)機(jī)制，為糖尿病腎病的體外研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要實驗材料 人腎小球足細(xì)胞（HGPC）接種于DMEM-F12培養(yǎng)基（含10% FBS及1%的青霉素—鏈霉素），于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔2 ～ 3 d更換培養(yǎng)液，待貼壁細(xì)胞密度達(dá)80%時傳代，取第4代對數(shù)期細(xì)胞用于實驗，分組前以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。丙泊酚、D-葡萄糖、NF-κB信號通路抑制劑BAY 11-7082購自上海源葉生物科技有限公司，NF-κB信號通路激活劑Prostratin購自阿拉丁公司，胎牛血清（FBS）、DMEM-F12購自美國Gibco公司，5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EdU）增殖測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β ELISA試劑盒購自泉州市睿信生物科技有限公司，RIPA裂解液購自美國ABW公司，鼠抗人NF-κB p65、p-NF-κB p65、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-actin及堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）購自美國CST公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱（RYX-150型）購自天津泰斯特儀器有限公司，酶標(biāo)儀（Multiskan FC型）購自美國Thermo公司，倒置熒光顯微鏡（MF52-N型）購自廣州市明美光電技術(shù)有限公司，凝膠成像系統(tǒng)（Champ Gd5000型）購自北京森西賽智科技有限公司。

1.2 丙泊酚作用濃度篩選及細(xì)胞分組處理 取第4代對數(shù)期HGPC細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/mL，接種到96孔板。將HGPC細(xì)胞分為正常糖組（加入5 mmol/L D-葡萄糖）、高糖組（加入30 mmol/L D-葡萄糖）及丙泊酚組（加入30 mmol/L D-葡萄糖+25、50、100 μmol/L丙泊酚），干預(yù)24 h后加入CCK-8溶液10 μL孵育2 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值，計算細(xì)胞活力［（OD高糖組或?qū)嶒灲M-OD空白組）/（OD正常糖組-OD空白組）×100%］。正常糖組、高糖組及25、50、100 μmol/L丙泊酚組細(xì)胞活力分別為100.00% ±1.91%、30.52% ± 1.93%、40.80% ± 2.35%、65.65% ± 1.91%、83.01% ± 2.88%，高糖組細(xì)胞活力低于正常糖組，50、100 μmol/L丙泊酚組細(xì)胞活力高于高糖組，選取細(xì)胞活力最佳的100 μmol/L 丙泊酚進(jìn)行后續(xù)實驗。而后取對數(shù)期生長的細(xì)胞分為正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組及丙泊酚+激活劑組，正常糖組給予5 mmol/L D-葡萄糖處理；其余組給予30 mmol/L D-葡萄糖處理，丙泊酚組在此基礎(chǔ)上給予100 μmol/L丙泊酚，抑制劑組給予1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+抑制劑組給予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L BAY 11-7082，丙泊酚+激活劑組給予100 μmol/L丙泊酚和1 μmol/L Prostratin。每組設(shè)置3個重復(fù)。干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測定。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察HGPC細(xì)胞形態(tài)。

1.4 細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β檢測 采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β，按試劑盒說明書操作。

有鑒于此，在小學(xué)數(shù)學(xué)教學(xué)過程中滲透德育的時候，教師要對課堂教學(xué)進(jìn)行充分的預(yù)設(shè)，預(yù)設(shè)課堂教學(xué)中的各種困境與生成。并以此為基礎(chǔ)，找準(zhǔn)德育滲透的切入點，“見縫插針”式地滲透德育。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心，無血清培養(yǎng)基對細(xì)胞重懸，制成懸液，調(diào)整濃度為1×105/mL。將Transwell小室放入24孔板中，取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入600 μL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出下室，棄上清，PBS洗滌3次，加入4%甲醇進(jìn)行固定，晾干，0.1%結(jié)晶紫染色，10 min后，PBS洗滌3次，將Transwell小室置于顯微鏡上，每孔隨機(jī)選5個不同區(qū)域，在顯微鏡下觀察拍照，Image J圖像分析軟件計算遷移細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時，兩兩比較采用Dunnett′s t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

文創(chuàng)產(chǎn)品即文化創(chuàng)意產(chǎn)品，簡單地說它就是源于文化主題并經(jīng)由創(chuàng)意轉(zhuǎn)化的具有市場價值的產(chǎn)品，以往對城市文創(chuàng)產(chǎn)品的研究較少。城市結(jié)合自身文化資源的文化特征與文化符號，可以創(chuàng)造性地設(shè)計開發(fā)出一系列城市文創(chuàng)產(chǎn)品，在將產(chǎn)品銷售給顧客的同時推動當(dāng)?shù)匚幕目焖倨占?。為了更好地進(jìn)行城市文創(chuàng)產(chǎn)品營銷，需要注意以下一些事項。

1.7 細(xì)胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白檢測 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，置冰上30 min，之后離心取上清，按照每孔20 μg蛋白樣品量上樣。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入稀釋后的一抗NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、Vimentin（1∶20 000）、N-cadherin（1∶5 000）、β-actin（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次。加入堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗稀釋液，孵育2 h，棄液，TBST洗滌3次。凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞增殖率測算 取各組干預(yù)24 h的細(xì)胞，EdU染色，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，15 min后牛血清白蛋白（BSA）洗滌，用0.3%聚乙二醇辛基苯基醚去除BSA，靜置10 min，洗滌3次；每孔加Click反應(yīng)液200 μL，室溫避光孵育30 min，洗滌3次；加入Hoechst染液，孵育10 min，用3% BSA洗滌3次；裝片，隨機(jī)選取3個視野，顯微鏡下拍照，用Image J軟件處理圖片，分析并計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

糖尿病腎病起病較為隱匿，易發(fā)展成為終末期腎病，嚴(yán)重危害患者健康。隨著對糖尿病腎病的研究不斷深入，足細(xì)胞生物功能障礙被認(rèn)為是推動糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。足細(xì)胞是一種高度特化的細(xì)胞，功能多樣，其受到外部刺激發(fā)生損傷后出現(xiàn)活力降低、異常遷移及EMT等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生［12］。因此，研究足細(xì)胞生物學(xué)功能可為臨床治療糖尿病腎病提供一定的理論依據(jù)。

2.2 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（）

表1 各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（）

注：與正常糖組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與丙泊酚組相比，&P＜0.05。

組別正常糖組高糖組丙泊酚組抑制劑組丙泊酚+抑制劑組丙泊酚+激活劑組TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&TNF-α 2.43 ± 0.48 9.23 ± 0.11*5.23 ± 0.10#5.01 ± 0.03#3.23 ± 0.10&7.95 ± 0.06&IL-6 4.13 ± 0.15 12.63 ± 0.31*7.62 ± 0.32#7.43 ± 0.22#5.25 ± 0.14&10.74 ± 0.41&IL-1β 3.24 ± 0.13 10.97 ± 0.19*6.27 ± 0.12#6.25 ± 0.08#3.98 ± 0.09&9.53 ± 0.21&

丙泊酚是一種臨床常用麻醉藥，可減輕細(xì)胞炎癥，增強(qiáng)細(xì)胞活力。研究表明，丙泊酚聯(lián)合阿托伐他汀能夠抑制核苷酸寡聚結(jié)構(gòu)域樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3炎癥小體，減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷［13］；對無抽搐電休克治療的老年精神分裂患者使用丙泊酚復(fù)合依托咪酯進(jìn)行全麻誘導(dǎo)安全有效，能延長腦癲癇運動發(fā)作時間，減少對認(rèn)知功能的影響和不良反應(yīng)的發(fā)生［14］。吳雙等［15］研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可增強(qiáng)缺氧復(fù)氧條件下腸上皮細(xì)胞活力。LIU等［16］研究發(fā)現(xiàn)，異丙酚可能通過上調(diào)肺組織SIRT1蛋白表達(dá)，通過抑制焦亡來減輕急性肺損傷。另有研究表明，丙泊酚可減輕糖尿病大鼠腎缺血再灌注損傷［17］，還可通過抑制Wnt信號誘導(dǎo)的EMT降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力［18］。

2.4 各組遷移細(xì)胞數(shù)比較 正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組、丙泊酚+激活劑組遷移細(xì)胞數(shù)分別為100.33 ± 2.52、447.67 ±5.03、262.33 ± 3.51、250.67 ± 12.74、137.33 ±5.69、351.67 ± 2.89。高糖組遷移細(xì)胞數(shù)高于正常糖組，丙泊酚組、抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)低于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組遷移細(xì)胞數(shù)降低，丙泊酚+激活劑組細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)升高（P均＜0.05）。見OSID碼圖3。

2.5 各組細(xì)胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 高糖組E-cadherin蛋白表達(dá)低于正常糖組，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)高于正常糖組（P均＜0.05）；丙泊酚組和抑制劑組E-cadherin蛋白表達(dá)高于高糖組，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)低于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+抑制劑組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低，丙泊酚+激活劑組E-cadherin蛋白表達(dá)減少，N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組細(xì)胞中EMT及NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較（）

注：與正常糖組相比，*P＜0.05；與高糖組相比，#P＜0.05；與丙泊酚組相比，&P＜0.05。

組別正常糖組高糖組丙泊酚組抑制劑組丙泊酚+抑制劑組丙泊酚+激活劑組p-NF-κB p65 0.23 ± 0.02 0.65 ± 0.03*0.35 ± 0.03#0.33 ± 0.02#0.19 ± 0.03&0.58 ± 0.02&E-cadherin 0.77 ± 0.02 0.21 ± 0.02*0.45 ± 0.02#0.43 ± 0.02#0.65 ± 0.02&0.26 ± 0.02&N-cadherin 0.21 ± 0.02 0.75 ± 0.02*0.35 ± 0.02#0.33 ± 0.02#0.13 ± 0.02&0.54 ± 0.01&Vimentin 0.22 ± 0.01 0.84 ± 0.02*0.46 ± 0.01#0.41 ± 0.02#0.17 ± 0.02&0.65 ± 0.01&NF-κB p65 0.73 ± 0.02 0.75 ± 0.04*0.77 ± 0.02#0.75 ± 0.02#0.73 ± 0.02&0.77 ± 0.02&

3 討論

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)比較 干預(yù)24 h后，正常糖組細(xì)胞胞體呈透明狀，樹突狀，相鄰?fù)黄鹣嗷ソ徊孢B接；高糖組細(xì)胞足突間交叉連接減少，胞體縮小，細(xì)胞間隔增大；丙泊酚組和抑制劑組足細(xì)胞足突較高糖組增多，胞體變大，細(xì)胞間隔縮小；丙泊酚+抑制劑組足細(xì)胞足突較丙泊酚組增多，胞體變大，細(xì)胞間隔進(jìn)一步縮?。槐捶?激活劑組足細(xì)胞足突較丙泊酚組足突減少，胞體變小，細(xì)胞間隔進(jìn)一步增加。見OSID碼圖1。

2.3 各組細(xì)胞增殖率比較 正常糖組、高糖組、丙泊酚組、抑制劑組、丙泊酚+抑制劑組、丙泊酚+激活劑組細(xì)胞增殖率分別為54.48% ± 0.68%、9.19% ±0.29%、32.2% ± 0.89%、31.14% ± 0.83%、48.7% ±0.65%、19.39% ± 0.62%。高糖組細(xì)胞增殖率低于正常糖組，丙泊酚組、抑制劑組細(xì)胞增殖率高于高糖組（P均＜0.05）；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組細(xì)胞增殖率升高，丙泊酚+激活劑組細(xì)胞增殖率降低（P均＜0.05）。見OSID碼圖2。

兔抗人Glut-1多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單抗、兔抗人p-Akt多克隆抗體及兔抗人PI3K-p85亞單位多克隆抗體(均由上海賽默飛世爾公司生產(chǎn))。

觀察組經(jīng)護(hù)理干預(yù)后無痛、輕度疼痛例數(shù)明顯多于對照組,中、重度疼痛例數(shù)明顯少于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

目前，關(guān)于丙泊酚在糖尿病腎病中的作用鮮有報道。本研究通過高糖刺激足細(xì)胞建立體外糖尿病腎病模型，觀察丙泊酚對足細(xì)胞損傷的干預(yù)作用。本研究結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞足突間交叉連接減少，胞體縮小，細(xì)胞間隔增大，細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及遷移細(xì)胞數(shù)增加，細(xì)胞增殖率降低；與高糖組比較，丙泊酚組和抑制劑組足細(xì)胞足突較高糖組增多，胞體變大，細(xì)胞間隔縮小，細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及遷移細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞增殖率升高。這提示丙泊酚可維持高糖刺激的足細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞炎癥、遷移及EMT。

NF-κB信號通路是由NF-κB、NF-κB受體及免疫調(diào)節(jié)蛋白等組成的高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)、增殖及遷移等多種生物學(xué)進(jìn)程［19］。研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體C5B蛋白可通過抑制NF-κB信號通路，減輕腎小球炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖［20］；小檗堿可能通過AKT/NF-κB信號通路減輕高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷、抑制足細(xì)胞凋亡、減弱足細(xì)胞遷移能力［21］。另有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過阻斷NF-κB信號通路抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞活力及炎癥因子釋放［22］。但丙泊酚是否可通過NF-κB信號通路影響糖尿病腎病足細(xì)胞的功能尚未可知。本研究結(jié)果顯示，與正常糖組比較，高糖組細(xì)胞p-NF-κB p65蛋白表達(dá)升高；與高糖組比較，丙泊酚組和抑制劑組p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低；與丙泊酚組比較，丙泊酚+抑制劑組足細(xì)胞足突增多，胞體變大，細(xì)胞間隔縮小，細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、N-cadherin、Vimentin、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)及遷移細(xì)胞數(shù)降低，E-cadherin表達(dá)及細(xì)胞增殖率升高，丙泊酚＋激活劑組與丙泊酚+抑制劑組趨勢相反。這提示丙泊酚可能是通過阻斷NF-κB信號通路，維持高糖刺激下足細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞炎癥、遷移及EMT。

在材料、生物、環(huán)境等科學(xué)領(lǐng)域，構(gòu)效關(guān)系研究在宏觀、介觀及微觀層面展開，本文討論的是分子尺度的化合物構(gòu)效關(guān)系。

綜上，丙泊酚可維持高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞正常形態(tài)，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移和EMT，這些作用可能與抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。下一步可深入探究丙泊酚干預(yù)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的其他作用機(jī)制，為丙泊酚的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。但本研究為臨床前研究，尚未進(jìn)行動物實驗驗證，且丙泊酚作為麻醉劑和鎮(zhèn)定劑，在治療糖尿病腎病的同時可能會由于過量使用而導(dǎo)致心臟或呼吸抑制等問題，其適用劑量仍需要進(jìn)一步探索。