泰興市豬源沙門(mén)菌的分離鑒定和耐藥性分析

桂文龍, 李巨銀, 魏 寧, 徐婷婷

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 江蘇 泰州 225300)

沙門(mén)菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病原菌,可以導(dǎo)致不同動(dòng)物發(fā)病,包括引起人類(lèi)發(fā)病。目前,全世界發(fā)現(xiàn)至少有67種O抗原和3 500個(gè)以上沙門(mén)菌血清型[1],而且絕大部分具有致病性。沙門(mén)菌感染可引起豬發(fā)生豬副傷寒,是目前養(yǎng)豬業(yè)中的一種較為常見(jiàn)的重要細(xì)菌性傳染病,主要侵害6月齡以下仔豬,尤以1～4月齡仔豬多發(fā),急性發(fā)病的豬常因敗血癥而死亡,慢性發(fā)病的豬表現(xiàn)為壞死性腸炎,有時(shí)可出現(xiàn)卡他性或干酪性肺炎,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。沙門(mén)菌均為非宿主適應(yīng)型,可通過(guò)食物鏈傳遞給人類(lèi),造成人類(lèi)發(fā)病。因此,研究沙門(mén)菌的流行情況和耐藥性,對(duì)動(dòng)物健康和公共衛(wèi)生具有重要的意義[3]。當(dāng)前,泰興市豬源沙門(mén)菌的感染日趨嚴(yán)重,而針對(duì)泰興市豬源沙門(mén)菌的分布、血清型及其耐藥性尚未有相關(guān)分析。因此,本試驗(yàn)選取江蘇省泰興市部分規(guī)?；i場(chǎng)和屠宰廠的豬糞樣品,進(jìn)行沙門(mén)菌的分離鑒定和藥物敏感性分析,以便為臨床用藥和公共衛(wèi)生安全提供指導(dǎo)和幫助。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 陽(yáng)性參考菌株沙門(mén)菌(BNCC202004001)、質(zhì)控菌株大腸桿菌(ATCC25922、ATCC35218),均由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑 酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、木糖賴氨酸-4瓊脂基礎(chǔ)(Xylose lysine tergitol-4 agar base,XLT-4)、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)(Sodium tetrathiosulfonate brilliant green enrichment liquid base,TTB)、緩沖蛋白胨水(Buffered peptone water,BPW)、Mueller-Hinton 瓊脂、NaCl、甘油、DL2 000 Marker、2×TaqMaster Mix、50×TAE電泳緩沖液和Gold-viewⅠ型核酸染色劑等,均購(gòu)自上海萬(wàn)生昊天生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥敏紙片 氨芐西林(Ampicillin,AMP)、頭孢氨芐(Cephalexin,CL)、頭孢唑啉(Cefazolin,CZ)、頭孢噻肟(Cefotaxime,CTX)、頭孢曲松(Ceftriaxone,CRO)、頭孢吡肟(Cefepime,FEP)、亞胺培南(Imipenem,IPM)、氨曲南(Aztreonam,ATM)、鏈霉素(Streptomycin,S)、卡那霉素(Kanamycin,K)、慶大霉素(Gentamicin,GM)、阿米卡星(Amikacin,AK)、四環(huán)素(Tetracycline,E)、多西環(huán)素(Doxycycline,D)、氟苯尼考(Florfenicol,FL)、萘啶酸(Naphthyric acid,NA)、諾氟沙星(Norfloxacin,NOR)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、依諾沙星(Enoxacin,ENX)、加替沙星(Gatifloxacin,GAT)、復(fù)方新諾明(Compound sulfamethoxazole,SXT)和甲氧芐啶(Trimethoprim,W),共24種藥敏紙片,均購(gòu)自南京全隆生物技術(shù)有限公司,藥敏紙片購(gòu)回后在-20 ℃保存,并在有效期內(nèi)使用。

1.4 主要儀器 PCR基因擴(kuò)增儀(K960)、高速離心機(jī)(TGL-16gR)、核酸電泳槽(JY-SCZ7)、紫外分光光度計(jì)(722)、電泳儀(Power Pac Basic)、恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9082MBE)、鼓風(fēng)干燥箱(GZX-914MBE)、電子天平(HZF-A+300)、雙人超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)、冰箱(BCD-238S)、干式恒溫器(MK200-4)、超低溫儲(chǔ)存箱(DW-HL540)、pH計(jì)(FE20)、壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-400)、顯微鏡(DM500)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-100H)和渦旋混合器(MX-S),均由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.5 樣品采集 2021年1月,選取江蘇省泰興市24個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)和2個(gè)屠宰廠,無(wú)菌采集豬糞樣品,每個(gè)豬場(chǎng)各采集30份、每個(gè)屠宰廠各采集90份,共計(jì)900份,每份豬糞樣品1 g左右,分別置于放有0.5 mL BPW的滅菌離心管中,置于含冰袋的泡沫箱內(nèi),密封保存,及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.6 豬源沙門(mén)菌的分離鑒定 將裝有糞便樣品的離心管,于37 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)8 h;取100 μL含樣品的BPW培養(yǎng)基,于37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)6 h;取300 μL含樣品的BPW培養(yǎng)基,加入3 mL TTB,于42 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h,取培養(yǎng)菌液劃線于XLT-4平板,37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察菌落特點(diǎn),并挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢和PCR鑒定。

依照GenBank中已公布的沙門(mén)菌invA基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,引物序列為:invA-F:5′-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3′,invA-R:5′-TCATCGCACCGTCAAAGGAAC-3′。PCR反應(yīng)體系:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,invA-F(10 nmol/L)1 μL,invA-R(10 nmol/L)1 μL,ddH2O 10.5 μL,挑取部分單個(gè)菌落置于 PCR 反應(yīng)管,渦旋振蕩 15 s,離心后進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性 2 min;98 ℃變性 10 s,58 ℃退火 20 s,72 ℃延伸 20 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 6 min[4]。以沙門(mén)菌BNCC202004001作為試驗(yàn)用陽(yáng)性對(duì)照菌株,取 5 μL PCR 反應(yīng)產(chǎn)物,經(jīng) 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳,于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 豬源沙門(mén)菌的血清型鑒定 將PCR分離鑒定結(jié)果為沙門(mén)菌的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng),當(dāng)菌液于600 nm處的光密度(Optical density,OD600 nm)值為 0.9 時(shí),取 200 μL 菌液與 200 μL 80%甘油混合,編號(hào)后保存于-80 ℃超低溫冰箱,每株菌株保存4管備用。取干凈玻片,標(biāo)記2個(gè)試驗(yàn)區(qū)域,1個(gè)試驗(yàn)區(qū)內(nèi)滴加1滴A-F多價(jià)O型血清,另1個(gè)試驗(yàn)區(qū)作為對(duì)照區(qū)域滴加1滴生理鹽水,挑取1滿環(huán)待測(cè)菌液,與A-F多價(jià)O型血清充分混勻,判定結(jié)果,出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陽(yáng)性反應(yīng)。然后,用O2、O3、O4、O7、O8、O9、O10和O11因子分別進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,判定分離菌株的O群的血清型。同樣操作,進(jìn)行多價(jià)鞭毛抗原H的鑒定。根據(jù)國(guó)家沙門(mén)菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[5],最后確定沙門(mén)菌的血清型。

1.8 豬源沙門(mén)菌的藥物敏感性試驗(yàn) 將保存?zhèn)溆玫纳抽T(mén)菌的菌株分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h。挑取 LB 固體培養(yǎng)基平板上的單個(gè)菌落,再接種于 LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃搖床培養(yǎng)至 0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝籟6]。取200 μL LB 液體菌液均勻涂抹接種于 Mueller-Hinton 固體培養(yǎng)基平板,晾干后均勻貼藥敏紙片,37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 20 h。用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑,根據(jù)《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 125—1999)》[7]判定藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 豬源沙門(mén)菌的分離鑒定 分離的豬源沙門(mén)菌在XLT-4固體培養(yǎng)基平板上形成表面光滑、邊緣整齊、大小1～2 mm的黑色菌落,經(jīng)革蘭染色鏡檢可觀察到長(zhǎng)桿狀、紅色的沙門(mén)菌形態(tài);PCR電泳結(jié)果顯示,疑似沙門(mén)菌在566 bp處均有特異性條帶,可鑒定為沙門(mén)菌。經(jīng)統(tǒng)計(jì),共有52株分離菌株判定為豬源沙門(mén)菌,分離率為5.78%(52/900)。其中,在24個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的720份樣品中,分離到沙門(mén)菌49株,分離率為6.81%,且各豬場(chǎng)間分離率存在較大差異,最高的豬場(chǎng)分離率為20.00%,最低的豬場(chǎng)沒(méi)有分離到沙門(mén)菌菌株;在2個(gè)屠宰廠采集的180份樣品中,分離到沙門(mén)菌3株,分離率為1.67%,相比規(guī)?；i場(chǎng)較低。

2.2 豬源沙門(mén)菌的血清型鑒定 結(jié)果顯示,52株沙門(mén)菌分離菌株共鑒定出7種血清型,其中德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(SalmonellaDerby)有19株(占36.54%),里森沙門(mén)菌(SalmonellaRissen)有15株(占28.85%),鼠傷寒沙門(mén)菌(SalmonellaTyphimurium)有6 株(占11.54%),倫敦沙門(mén)菌(SalmonellaLondon)有5株(占9.62%),紐蘭沙門(mén)菌(SalmonellaNewlands)有3株(占5.77%),紐波特沙門(mén)菌(SalmonellaNewport)和羅米他沙門(mén)菌(SalmonellaLomita)各2株(各占3.85%);24個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)中有7個(gè)豬場(chǎng)分離的沙門(mén)菌有2種及以上血清型,而2個(gè)屠宰廠分離的沙門(mén)菌分別只有1種血清型。

2.3 豬源沙門(mén)菌的藥物敏感性試驗(yàn)

2.3.1 豬源沙門(mén)菌的耐藥率 52株豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)24種抗菌藥物的耐藥率差異較大,具體耐藥率及其分布情況如表1和圖1所示,分離菌株對(duì)多西環(huán)素(D)、甲氧芐啶(W)、四環(huán)素(E)、氨芐西林(AMP)和氟苯尼考(FL)5種藥物耐藥率均超過(guò)80.00%,最高的達(dá)98.08%(多西環(huán)素);對(duì)頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲松(CRO)、頭孢吡肟(FEP)和氧氟沙星(OFX)4種藥物完全或中度敏感。從耐藥的抗菌藥物種類(lèi)分析,52株豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、青霉素類(lèi)和酰胺醇類(lèi)抗菌藥物耐藥嚴(yán)重,至少超過(guò)70.00%;對(duì)頭孢菌素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物較為敏感。

圖1 豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率

表1 52株豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率

2.3.2 不同豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性 不同血清型豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)所測(cè)抗菌藥物的耐藥性結(jié)果如表2所示,19 株德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(S.Derby)對(duì)1～20種抗菌藥物耐藥,15株里森沙門(mén)菌(S.Rissen)對(duì)0～12種抗菌藥物耐藥,6 株鼠傷寒沙門(mén)菌(S.Typhimurium)對(duì)6～16種抗菌藥物耐藥,5 株為倫敦沙門(mén)菌(S.London)對(duì)0～10種抗菌藥物耐藥,3株紐蘭沙門(mén)菌(S.Newlands)對(duì)0～3種抗菌藥物耐藥,2株紐波特沙門(mén)菌(S.Newport)對(duì)所測(cè)抗菌藥物均無(wú)耐藥,2 株羅米他沙門(mén)菌(S.Lomita)對(duì)2～4種抗菌藥物耐藥。

表2 不同血清型豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性

2.3.3 不同豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)抗菌藥物的多重耐藥性 52株豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)9類(lèi)抗菌藥物的多重耐藥情況如圖2所示,共有39株豬源沙門(mén)菌具有多重耐藥性,占比75.00%,耐藥的藥物種類(lèi)為3～7類(lèi),有19株菌株對(duì)5類(lèi)以上抗菌藥物多重耐藥,有8株菌株對(duì)4類(lèi)抗菌藥物多重耐藥,有12株菌株對(duì)3類(lèi)抗菌藥物多重耐藥。

圖2 39株豬源沙門(mén)菌菌株對(duì) 9 類(lèi)抗菌藥物的多重耐藥分析

3 討論

本試驗(yàn)采用BPW培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)增菌,利用TTB培養(yǎng)基選擇性增菌,然后劃線于XLT-4培養(yǎng)基平板,挑取典型菌落,進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,可明顯提高沙門(mén)菌檢出率。從泰興市采集的900份豬糞樣品中分離出沙門(mén)菌52株,分離率為5.78%;各采樣地點(diǎn)的分離率差異較大,最高的豬場(chǎng)沙門(mén)菌分離率為20.00%,最低的豬場(chǎng)未分離到沙門(mén)菌菌株;52株菌株中共鑒定出7種血清型,其中德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(S.Derby)和里森沙門(mén)菌(S.Rissen)的分離率分別為36.54%和28.85%,是本試驗(yàn)分離菌株的優(yōu)勢(shì)血清型,而鼠傷寒沙門(mén)菌(S.Typhimurium)占比為11.54%?？傮w來(lái)看,本試驗(yàn)中對(duì)泰興市豬源沙門(mén)菌分離率較高,結(jié)果與張毅等[8]2018年對(duì)四川省規(guī)?；i場(chǎng)沙門(mén)菌的分離率(6.6%)相近;血清型結(jié)果與方忠意等[9]2019年在河南省5個(gè)市生豬屠宰廠抽檢結(jié)果以德?tīng)柋吧抽T(mén)菌為優(yōu)勢(shì)血清型一致,也跟東南亞國(guó)家2017年豬源沙門(mén)菌的優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎沙門(mén)菌、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌數(shù)據(jù)相近[10]。豬源沙門(mén)菌在泰興市養(yǎng)豬業(yè)中感染率較高,且不同養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理水平、藥物預(yù)防不同,導(dǎo)致感染率差異較大,需要各養(yǎng)殖場(chǎng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和注重藥物預(yù)防。

本試驗(yàn)的52株豬源沙門(mén)菌分離菌株對(duì)24種抗菌藥物的耐藥率存在差異,其中對(duì)四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥率最高,尤其是對(duì)多西環(huán)素(D)耐藥率達(dá)到98.08%,其次是磺胺類(lèi)、青霉素類(lèi)和酰胺醇類(lèi)抗菌藥物耐藥嚴(yán)重,對(duì)頭孢菌素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物較為敏感;不同血清型分離菌株的耐藥情況存在一定的差異,其中德?tīng)柋吧抽T(mén)菌(S.Derby)耐藥率最高,其次為鼠傷寒沙門(mén)菌(S.Typhimurium)、里森沙門(mén)菌(S.Rissen)和倫敦沙門(mén)菌(S.London),最低為紐蘭沙門(mén)菌(S.Newlands)、紐波特沙門(mén)菌(S.Newport)和羅米他沙門(mén)菌(S.Lomita);分離菌株的多重耐藥情況也較嚴(yán)重,共有39株豬源沙門(mén)菌菌株對(duì)9類(lèi)抗菌藥物具有多重耐藥性。這與吳荔琴等[11]在廣東省對(duì)2014—2016年廣州市屠宰廠分離的沙門(mén)菌耐藥試驗(yàn)結(jié)果相符合,與張海等[12]2019年在貴州省某規(guī)模化豬場(chǎng)豬源沙門(mén)菌分離菌株的耐藥情況相近。因此,泰興市養(yǎng)殖場(chǎng)平時(shí)要加強(qiáng)對(duì)豬沙門(mén)菌的預(yù)防用藥,注意穿梭用藥和定期更換藥物種類(lèi),必要時(shí)需要結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)綜合考慮預(yù)防和治療方案。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,建議泰興市在治療豬沙門(mén)菌病時(shí),可選擇頭孢菌素類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗菌藥物治療,效果將較為理想,如頭孢吡肟等抗菌藥物。