芒柄花素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的抑制作用Δ

林 海 ，易金容 ，饒運(yùn)帷 （.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科，江西 贛州 34000；2.贛州市婦幼保健院麻醉科，江西 贛州 34000）

急性肺損傷是由于各種原因所致肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變而引發(fā)的臨床綜合征，其病理改變包括肺泡上皮細(xì)胞和肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、廣泛性肺水腫、肺不張、肺內(nèi)分流增加、肺順應(yīng)性下降，臨床可表現(xiàn)為急性、進(jìn)行性、發(fā)作性呼吸困難，是一種臨床較為常見的危重癥。該病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床治療以機(jī)械通氣為主，但效果有限，使得患者的病死率居高不下[1―3]。可見，探尋新的急性肺損傷治療方法及藥物十分必要。

中醫(yī)將急性肺損傷歸為“結(jié)胸”“暴喘”“喘脫”等范疇，宜運(yùn)用清熱解毒、宣肺平喘、豁痰開竅、攻里通下等治法[4]。芒柄花素為黃酮類化合物，在黃芪、雞血藤等多種中藥中存在。研究指出，黃芪和雞血藤具有清熱解毒的功效，對(duì)急性肺損傷有一定的改善作用，其主要成分芒柄花素還具有一定的抗炎活性[5]。研究證實(shí)，芒柄花素可通過抗炎、抗氧化作用來減輕高氧介導(dǎo)的急性肺損傷，同時(shí)對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷也有保護(hù)作用[6—7]，但該成分上述作用的具體機(jī)制尚不明確。

磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路在細(xì)胞中廣泛存在，是參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)過程的重要信號(hào)通路?，F(xiàn)有研究證實(shí)，PI3K/Akt與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)：Sun等[8]發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt 信號(hào)通路來減輕肺癌和慢性阻塞性肺疾病的全身性炎癥；Liu 等[9]發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白酶和磷酸鞘氨醇復(fù)合物可通過PI3K/Akt 信號(hào)通路來減輕腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)；另有研究指出，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路與減輕LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷相關(guān)[10]?；诖?，本研究擬通過LPS誘導(dǎo)構(gòu)建體外肺泡上皮細(xì)胞損傷模型，探究芒柄花素對(duì)其凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及潛在機(jī)制，以期為深入研究該化合物用于急性肺損傷的防治提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ZF-288 型凝膠成像系統(tǒng)（上海金鵬科技有限公司），BPN-40RHP 型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），Multiskan Ascent型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、NanoDrop One 型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司），DXS_3 型倒置熒光顯微鏡（上海締倫光學(xué)儀器有限公司），DYCZ-24KF 型四板垂直蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司），7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI 公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)94334，純度≥98%）購自美國Sigma 公司；LPS（批號(hào)J07HS174755，純度≥98%）、LY294002 對(duì)照品（PI3K/Akt 非特異性通路抑制劑，批號(hào)J05GS150604，純度≥98%）、SC79 對(duì)照品（PI3K/Akt 特異性通路激活劑，批號(hào)F08J11F115126，純度≥98%）、1%青-鏈霉素雙抗均購自上海源葉生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司；F-12K 培養(yǎng)基（批號(hào)20220617）、RIPA 裂解液均購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 試劑（批號(hào)分別為C6205060、H2017011、H4001330）均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為Mar2022、Feb2022）均購自北京睿信科技有限公司；Hoechst 33258 染色試劑盒（批號(hào)20220304）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；鼠抗人PI3K、Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗（批號(hào)分別為10017175、10022173、10022023、10021787、20000425）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；鼠抗人磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）單克隆抗體（批號(hào)BJ07207167）購自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 細(xì)胞株

肺癌人肺泡基底上皮細(xì)胞A549購自武漢普諾賽生命科技有限公司，于－80 ℃下凍存，備用。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的A549 細(xì)胞，復(fù)蘇后，接種于F-12K 培養(yǎng)基（含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗）中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)、傳代（密度＞80%），取第4代且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子水平的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組、模型組和芒柄花素不同濃度組（分別為L(zhǎng)PS+6.25 組、LPS+12.5 組、LPS+25組、LPS+50組），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)，模型組細(xì)胞加入1 μg/mL 的LPS 刺激24 h以構(gòu)建體外肺泡上皮細(xì)胞損傷模型[11]，芒柄花素不同濃度組細(xì)胞同時(shí)加入1 μg/mL 的LPS 和6.25、12.5、25、50 μmol/L 的芒柄花素（芒柄花素濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]設(shè)置）。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，采用ELISA法以酶標(biāo)儀測(cè)定其中炎癥因子IL-8、TNF-α水平。

2.3 細(xì)胞活力的檢測(cè)

2.4 基于PI3K/Akt信號(hào)通路的機(jī)制分析

2.4.1 IL-8、TNF-α分泌水平和mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分為對(duì)照組、模型組、芒柄花素組（LPS+25 組）、抑制劑組、芒柄花素+抑制劑組和芒柄花素+激活劑組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何干預(yù)，模型組細(xì)胞加入1 μg/mL 的LPS 刺激24 h以構(gòu)建體外肺泡上皮細(xì)胞損傷模型[11]，LPS+25組細(xì)胞同時(shí)加入1 μg/mL 的LPS 和25 μmol/L 的芒柄花素（芒柄花素濃度參考“2.2”“2.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置，下同），抑制劑組細(xì)胞同時(shí)加入1 μg/mL 的LPS 和20 μmol/L 的PI3K/Akt 通路抑制劑LY294002（抑制劑濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]設(shè)置，下同），芒柄花素+抑制劑組細(xì)胞同時(shí)加入1 μg/mL的LPS、25 μmol/L 的芒柄花素和20 μmol/L 的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002，芒柄花素+激活劑組細(xì)胞同時(shí)加入1 μg/mL 的LPS、25 μmol/L 的芒柄花素和10 μmol/L的PI3K/Akt 通路激活劑SC79（激活劑濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]設(shè)置）。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按“2.2”項(xiàng)下ELISA 法檢測(cè)其中炎癥因子IL-8、TNF-α 水平，以表示其分泌水平。收集各組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定其中IL-8、TNF-α mRNA 表達(dá)水平，具體步驟為：提取各組細(xì)胞總RNA，以超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度，隨后將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系包括cDNA模板1 μL（質(zhì)量濃度為20 ng/μL），SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（質(zhì)量濃度均為10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增條件包括：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，共40 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，結(jié)果以對(duì)照組為參照進(jìn)行歸一化處理。PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

2.4.2 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按“2.4.1”項(xiàng)下方法分組、處理。培養(yǎng)24 h 后，收集各組細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液洗滌5 min×2 次后，置于4 ℃的4%多聚甲醛中固定10 min。取出細(xì)胞，洗滌3 次，以5 mg/L 的Hoechst 33258 染液染色10 min；洗滌3 次，封片，使用熒光顯微鏡觀察、拍照，并按下式計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%（凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色且染色不均，核固縮變?。?。

2.4.3 細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按“2.4.1”項(xiàng)下方法分組、處理。培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞，提取其蛋白，定量后經(jīng)高溫水浴變性。取變性蛋白適量，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉2 h；加入PI3K、Akt、p-Akt、p-PI3K、β-actin 一抗（稀釋比例分別為1∶3 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶1 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育過夜；用TBST 緩沖液洗膜，加入相應(yīng)IgG 二抗（稀釋比例為1∶2 000），孵育2 h；用TBST緩沖液洗膜，顯影后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。使用Image J 1.8.0軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnetts’t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

導(dǎo)入之后得到的數(shù)據(jù)示例如表2所示，需要注意的是，為了方便顯示我們省略了一些屬性。另外，KC是關(guān)于知識(shí)點(diǎn)的詳細(xì)描述，所占篇幅較長(zhǎng)，我們僅以SkillRule代替。

3 結(jié)果

3.1 芒柄花素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+12.5組、LPS+25 組、LPS+50 組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-8、TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

3.2 芒柄花素對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+25組細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。結(jié)合“3.1”項(xiàng)下結(jié)果，本研究最終選擇對(duì)細(xì)胞活力有顯著影響且有較好抑炎效果的25 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)芒柄花素的干預(yù)濃度。

圖2 芒柄花素對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞活力的影響（±s，n＝3）

3.3 芒柄花素基于PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響

3.3.1 芒柄花素對(duì)細(xì)胞炎癥因子IL-8、TNF-α 分泌水平和mRNA表達(dá)水平的調(diào)控作用

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞IL-8、TNF-α 的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+25 組和抑制劑組細(xì)胞IL-8、TNF-α 的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與LPS+25組比較，芒柄花素+抑制劑組細(xì)胞IL-8、TNF-α的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），而芒柄花素+激活劑組細(xì)胞IL-8、TNF-α 的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 芒柄花素基于PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞IL-8、TNF-α 分泌水平和mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n＝3）

3.3.2 芒柄花素對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+25組和抑制劑組細(xì)胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05）；與LPS+25組比較，芒柄花素+抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），而芒柄花素+激活劑組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 芒柄花素基于PI3K/Akt 信號(hào)通路對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）

3.3.3 芒柄花素對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，LPS+25 組和抑制劑組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與LPS+25組比較，芒柄花素+抑制劑組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K 的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，而芒柄花素+激活劑組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K 的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 芒柄花素對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

4 討論

急性肺損傷是多種炎癥介質(zhì)、免疫細(xì)胞共同參與的病理過程，由創(chuàng)傷、感染、燒傷及休克等多種因素引發(fā)，具有較高的發(fā)病率及病死率[14]。由于現(xiàn)有治療手段效果有限，故挖掘新的有效治療藥物備受研究者關(guān)注。

本研究首先以LPS誘導(dǎo)A549細(xì)胞構(gòu)建體外肺泡上皮細(xì)胞損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的炎癥因子（IL-8、TNF-α）分泌顯著增多，細(xì)胞活力顯著下降，說明LPS 能促進(jìn)A549 細(xì)胞炎癥因子釋放并抑制細(xì)胞活力，體外急性損傷細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

中醫(yī)藥對(duì)改善急性肺損傷具有積極作用，這種作用可能是通過干預(yù)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥介質(zhì)釋放、免疫細(xì)胞活化等多途徑而實(shí)現(xiàn)的。芒柄花素是一種異黃酮類化合物，作為黃芪、雞血藤等多種中藥的活性黃酮類成分，其具有抗腫瘤、清除自由基、抗炎和改善雌激素水平等藥理活性[5―7]，但其對(duì)LPS致急性肺損傷的作用機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究進(jìn)一步以不同濃度的芒柄花素干預(yù)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25 μmol/L 的芒柄花素可使模型細(xì)胞活力顯著升高，炎癥因子IL-8、TNF-α 的分泌水平顯著降低，提示25 μmol/L 的芒柄花素緩解LPS致細(xì)胞損傷的效果較好，因此將該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)芒柄花素的干預(yù)濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS+25組細(xì)胞IL-8、TNF-α 的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率均較模型組顯著降低，提示芒柄花素能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡并緩解炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果表明，芒柄花素能改善LPS引起的A549細(xì)胞損傷，具有一定的抗炎、抗凋亡作用。

PI3K/Akt信號(hào)通路是一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可在細(xì)胞分化、凋亡、增殖、遷移等多種生物過程中發(fā)揮作用[15]。Liang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可改善大鼠肺缺血再灌注引起的肺損傷，這種作用可能是通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的；Wang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓細(xì)胞2 上表達(dá)的受體可通過PI3K/Akt 信號(hào)通路來改善阿爾茨海默病模型小鼠神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認(rèn)知障礙。PI3K和Akt蛋白是PI3K/Akt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，可參與LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，并可抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬，故該信號(hào)通路成為急性肺損傷研究的關(guān)鍵靶點(diǎn)[15]。本研究結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組顯著上調(diào)，提示LPS誘導(dǎo)能夠激活細(xì)胞的PI3K/Akt 信號(hào)通路；LPS+25 組和抑制劑組細(xì)胞中p-Akt、p-PI3K 蛋白的相對(duì)表達(dá)量均較模型組顯著下調(diào)，提示芒柄花素和非特異性通路抑制劑LY294002均能抑制細(xì)胞的PI3K/Akt信號(hào)通路。

為闡釋芒柄花素對(duì)LPS致A549細(xì)胞炎癥和凋亡的抑制作用機(jī)制，本研究同時(shí)以芒柄花素和非特異性通路抑制劑LY294002對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)（為排除LY294002 對(duì)其他蛋白的抑制作用，本研究同時(shí)設(shè)置了單獨(dú)的抑制劑組），結(jié)果顯示，芒柄花素+抑制劑組細(xì)胞中IL-8、TNF-α 的分泌水平和mRNA 表達(dá)水平，細(xì)胞凋亡率，p-Akt、p-PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于LPS+25 組。為進(jìn)一步反向驗(yàn)證該作用機(jī)制，本研究還以芒柄花素和特異性通路激活劑SC79 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的A549 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，芒柄花素+激活劑組細(xì)胞中上述指標(biāo)的改變受到逆轉(zhuǎn)。這提示芒柄花素可通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來發(fā)揮對(duì)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞炎癥和凋亡的改善作用。

綜上所述，芒柄花素能夠抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡并改善其炎癥反應(yīng)，上述作用與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。但該成分能否通過其他信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)急性肺損傷的改善作用尚未可知，有待進(jìn)一步探究。