玉葉金花總皂苷指紋圖譜及其肝保護作用的譜效關(guān)系研究Δ

張 穎 ，羅金榮 ，張赟赟 ，陳 鋒 ，何 飛 ，李 嘉 #（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，南寧 530022）

玉葉金花是廣西特色瑤藥，為茜草科植物玉葉金花MussaendapubescensAit.f.的干燥莖和根，具有清熱解毒、利濕消腫、化痰止咳、涼血解暑、生津、拔異物的功效，主要用于治療胃腸感冒、氣管炎、肝炎、小兒疳積、腎炎水腫、咽喉腫痛等癥[1]。由于該藥具有較好的清熱解毒作用，被廣泛應(yīng)用于中成藥制劑（如玉葉解毒顆粒、玉葉清火片等）領(lǐng)域[2]?，F(xiàn)代研究表明，玉葉金花主要含有三萜及其皂苷、單萜、環(huán)烯醚萜、有機酚酸等成分，以及鈣、鎂、鐵等微量元素[3]。其中，mussaendoside G、mussaendoside U 可調(diào)節(jié)機體促炎因子的分泌，具有一定的體外抗炎活性[4]；mussaendoside O 為M 膽堿受體拮抗劑，可減弱核因子κB受體激活蛋白配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成，抑制脂多糖誘導(dǎo)的骨丟失[5]，可顯著抑制加蘭他敏引起的淚腺、唾液腺分泌和卡巴膽堿誘導(dǎo)的豚鼠回腸肌收縮[6]；mussaendoside U能抑制M膽堿能神經(jīng)興奮，可降低回腸平滑肌收縮力，抑制唾液腺分泌[7]。研究指出，玉葉金花總皂苷具有肝保護作用，但具體藥效成分尚不清楚[8]。此外，現(xiàn)有研究對玉葉金花的質(zhì)量控制多限于化學(xué)分析，與藥效結(jié)合的整體性探索有限[4，9]。鑒于此，本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）法，建立不同產(chǎn)地玉葉金花總皂苷的指紋圖譜并測定其中5 種三萜皂苷類成分（mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O）的含量；擬采用四氯化碳（CCl4）致小鼠肝損傷模型評價總皂苷的肝保護作用，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析法進行譜效關(guān)系研究，以期為更好地開發(fā)利用玉葉金花資源提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1260 型HPLC 儀（美國Agilent公司）、Multiskan GO型全波長全自動多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）、DHG 型干燥箱（余姚市金電儀表有限公司）、XS-205型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 對照品（純度均大于95.0%）均由本實驗室自制；D101 型大孔樹脂購自上海麥克林生化科技有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號19J200607，規(guī)格1.5 mg）購自萬邦德制藥集團有限公司；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自凡科維（上海）科技有限公司；乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

10 批玉葉金花藥材（編號S1～S10）采自廣西不同地區(qū)，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為玉葉金花M.pubescensAit.f.的干燥莖和根。10批玉葉金花藥材的來源信息見表1。

表1 10批玉葉金花藥材的來源信息

1.3 實驗動物

SPF級雄性昆明小鼠，體重18～20 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0014。本研究動物實驗方案已通過廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院實驗動物倫理委員會審核，審查受理號為2023030101。

2 方法與結(jié)果

2.1 玉葉金花總皂苷的制備

取10 批玉葉金花藥材各100 g，粉碎，置圓底燒瓶中，以75%乙醇加熱回流提取2 h×2次，合并提取液，回收溶劑得浸膏，加水分散至30 mL；取上述分散物，經(jīng)D101 型大孔樹脂柱，依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫部分，回收溶劑，即得玉葉金花總皂苷（每克總皂苷相當(dāng)于生藥320～385 g）。

2.2 指紋圖譜的建立

采用HPLC 法建立10 批玉葉金花總皂苷樣品的指紋圖譜。

2.2.1 色譜條件

以Techmate C18-ST（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為色譜柱，乙腈（A）-水（B）為流動相進行梯度洗脫（0～25 min，36%A；25～50 min，36%A→38%A；50～60 min，38%A→40%A；60～70 min，40%A→45%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為265 nm；進樣體積為10 μL。

2.2.2 溶液的制備

（1）混合對照品溶液：精密稱取mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為33.02、53.40、68.28、40.96、88.17 μg/mL的混合對照品溶液，備用。

（2）供試品溶液：取玉葉金花總皂苷，粉碎，精密稱取粉末10 mg至具塞三角瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min，放至室溫，再次稱重后用甲醇補足失重，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。2.2.3 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗：取同一批玉葉金花總皂苷（編號S1），粉碎，取粉末約10 mg，精密稱定，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以11 號峰（峰面積較大且出峰穩(wěn)定）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

（2）穩(wěn)定性試驗：取同一批玉葉金花總皂苷（編號S1），粉碎，取粉末約10 mg，精密稱定，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以11號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于1.0%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（3）重復(fù)性試驗：取同一批玉葉金花總皂苷（編號S1），粉碎，取粉末約10 mg，共6 份，精密稱定，按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，以11號峰為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于2.0%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 指紋圖譜的建立與分析

（1）指紋圖譜的建立和共有峰的標(biāo)定：取10 批玉葉金花總皂苷，粉碎，取粉末，分別按“2.2.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將所得色譜信息導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行色譜峰匹配，以S1樣品圖譜為參照圖譜，共標(biāo)定11個共有峰；采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），采用多點校正法生成疊加圖譜。結(jié)果見圖1。

圖1 10批玉葉金花總皂苷HPLC疊加圖譜及對照指紋圖譜

（2）相對保留時間和相對峰面積的計算：以11 號峰為參照峰，計算得10批玉葉金花總皂苷指紋圖譜中各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n＝10），提示10批樣品的成分種類相對穩(wěn)定；相對峰面積的RSD 為1.37%～2.61%（n＝10），提示10 批樣品各成分的含量差異不大。

（3）相似度評價：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對10 批玉葉金花總皂苷樣品進行相似度評價。結(jié)果顯示，與對照指紋圖譜相比，10 批玉葉金花總皂苷樣品的相似度分別為0.991、0.986、0.989、0.989、0.960、0.980、0.978、0.940、0.991、0.957，提示10 批玉葉金花總皂苷的整體品質(zhì)基本穩(wěn)定。

（4）共有峰指認(rèn)：以混合對照品溶液的色譜圖（按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析所得，圖2）為參照，通過比較各色譜峰的保留時間和紫外吸收光譜特征，共指認(rèn)出5 個共有峰，3、7、8、9、11 號峰依次為mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O。

圖2 混合對照品溶液的HPLC圖

2.3 5種三萜皂苷類成分的定量分析

采用HPLC法進行定量分析。

2.3.1 色譜條件

色譜條件同“2.2.1”項。

2.3.2 溶液的制備

（1）不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液：精密稱取mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為201.12、1 995.40、1 010.75、502.05、2 000.90 μg/mL 的混合對照品貯備溶液。取上述混合對照品貯備溶液5 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容；然后分別取上述混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，用甲醇定容至10 mL，得不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

（2）供試品溶液：制備同“2.2.2（2）”項。

2.3.3 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察：取“2.3.2（1）”項下不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析并記錄峰面積。以各待測成分的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進行線性回歸，得mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O的回歸方程分別為Y＝10 158.9X+254.3（R2＝0.999 5）、Y＝15 616.4X+825.9（R2＝0.999 6）、Y＝6 359.2X+1 033.4（R2＝0.999 8）、Y＝18 062.9X+165.1（R2＝0.999 5）、Y＝16 553.8X－528.7（R2＝0.999 7），上述成分檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為2.01～20.11、19.95～199.54、10.11～101.08、5.02～50.21、20.01～200.09 μg/mL。

（2）精密度試驗：取同一混合對照品溶液[mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的質(zhì)量濃度分別為4.02、39.91、20.22、10.04、40.02 μg/mL，按“2.3.2（1）”項下方法制得]適量，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 峰面積的RSD 分別為0.48%、0.35%、0.51%、0.63%、0.26%（n＝6），表明儀器精密度良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：取玉葉金花總皂苷樣品（編號S1），按“2.3.2（2）”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 峰面積的RSD 分別為0.58%、0.34%、0.46%、0.72%、0.66%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）重復(fù)性試驗：取玉葉金花總皂苷樣品（編號S1），按“2.3.2（2）”項下方法平行制備供試品溶液6 份，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的含量。結(jié)果顯示，上述成分平均含量的RSD 分別為1.77%、1.21%、1.93%、1.82%、1.36%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

（5）加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的玉葉金花總皂苷樣品（編號S1）5 mg，共6 份，加入與已知量相等的各成分對照品，按“2.3.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的平均加樣回收率分別為100.67%、100.10%、99.30%、100.96%、100.79%，RSD 分別為1.83%、1.78%、1.71%、1.25%、1.53%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3.4 樣品測定

取10 批玉葉金花總皂苷樣品，按“2.3.2（2）”項下方法平行制備供試品溶液3 份，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并按外標(biāo)法計算各成分含量，結(jié)果以平均值展示，具體見表2。

表2 10批玉葉金花總皂苷中5種三萜皂苷類成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）

2.4 肝保護作用評價

2.4.1 藥液的配制

分別取10 批玉葉金花總皂苷適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液稀釋，制得所需濃度的藥液；取陽性對照藥聯(lián)苯雙酯適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液稀釋，制得所需濃度的藥液。

2.4.2 玉葉金花總皂苷對小鼠肝功能指標(biāo)和炎癥因子的影響

將小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（聯(lián)苯雙酯，200 mg/kg[10]）、不同批次玉葉金花總皂苷組（即S1～S10 組，劑量分別為104、108、102、115、85、125、115、87、113、124 mg/kg，均相當(dāng)于生藥量40 g/kg[1]），每組10 只。各藥物組小鼠每天灌胃相應(yīng)藥液1 次，連續(xù)7 d，空白組和模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。末次給藥后1 h，模型組和各藥物組小鼠均單次灌胃0.35%CCl4-花生油溶液10 mL/kg 以復(fù)制急性肝損傷模型（以血清ALT、AST 含量較空白組顯著升高為造模成功），空白組小鼠單次灌胃等體積花生油。

造模后，各組小鼠禁食16 h，摘眼球取血，以3 000 r/mim 離心10 min，分離血清；小鼠脫頸椎處死，分離其肝組織，保存于液氮中。取血清樣品，使用酶標(biāo)儀檢測其中ALT、AST 含量。取保存于液氮中的肝組織適量，加生理鹽水制成10%組織勻漿，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，取上清液，使用酶標(biāo)儀檢測其中TNF-α、IL-6、IL-1β含量。上述檢測均嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié)果（表3）顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST含量和肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各藥物組小鼠的上述指標(biāo)均普遍降低，大部分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組小鼠血清中ALT、AST含量和肝組織中TNFα、IL-6、IL-1β含量比較（±s，n＝10）

表3 各組小鼠血清中ALT、AST含量和肝組織中TNFα、IL-6、IL-1β含量比較（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

IL-1β/（pg/mg）12.65±2.34 18.06±5.77a 15.73±4.32b 16.98±6.05c 17.51±5.79b 16.46±4.51c 15.87±4.08b 15.90±6.11c 17.33±7.23b 17.59±4.09c 14.98±4.24c 18.03±7.13 17.94±8.49組別空白組模型組陽性對照組S1組S2組S3組S4組S5組S6組S7組S8組S9組S10組ALT/（U/L）6.33±2.73 149.59±12.81a 32.54±13.26b 100.49±47.64c 50.29±14.84b 45.50±19.39b 49.75±21.25b 40.07±9.68b 53.45±16.70b 45.93±17.57b 44.02±8.86b 62.32±20.95c 95.12±64.08c AST/（U/L）35.92±13.29 161.07±12.01a 100.53±24.95b 157.56±4.99b 127.08±8.50b 137.43±20.35b 145.24±11.33b 97.60±1.88b 147.94±5.51b 129.01±12.70c 115.72±37.69b 149.17±1.56b 156.95±2.51b TNF-α/（pg/mg）61.93±13.55 95.50±20.63a 73.81±18.57b 81.62±22.61c 75.44±17.58b 69.36+13.45b 74.69±16.36b 66.51±10.22b 80.03±20.09c 77.96±15.17b 68.39±23.75c 83.77±19.84 92.13±18.62 IL-6/（pg/mg）12.76±3.63 17.59±7.22a 14.55±5.43b 16.03±8.31b 15.78±5.54b 14.12±6.55b 15.98±5.21c 13.92±6.03c 16.36±6.54 16.23±7.89c 15.01±4.33b 19.88±8.09 14.34±8.11c

2.5 玉葉金花總皂苷肝保護作用的譜效關(guān)系分析

采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法[11]，以各組肝損傷小鼠血清中ALT、AST含量和肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1β含量為母序列，以玉葉金花總皂苷指紋圖譜的11個共有峰峰面積為子序列，設(shè)分辨系數(shù)ρ為0.5，計算各共有峰峰面積與各藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度。結(jié)果（表4）顯示，各共有峰峰面積與ALT、AST、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量的關(guān)聯(lián)度分別為0.602～0.757、0.585～0.833、0.593～0.795、0.618～0.820、0.607～0.804，關(guān)聯(lián)度均較大的依次為11、9、8 號峰；各共有峰對上述指標(biāo)的貢獻大小不一，提示玉葉金花總皂苷的肝保護作用是通過不同成分協(xié)同實現(xiàn)的，11、9、8 號峰對應(yīng)成分（即mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C）可能是玉葉金花總皂苷發(fā)揮肝保護作用的主要藥效成分。

表4 玉葉金花總皂苷指紋圖譜各共有峰與肝保護藥效指標(biāo)的關(guān)聯(lián)度

3 討論

本研究參照相關(guān)文獻[12]建立了玉葉金花總皂苷HPLC 指紋圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均較好。相似度評價結(jié)果表明，不同批次玉葉金花總皂苷樣品的化學(xué)成分組成一致性較好，含量差異不大。通過與混合對照品比對，指認(rèn)了其中5個共有峰，分別為mussaendoside O（11 號峰）、mussaendoside G（9 號峰）、mussaglaoside C（8 號峰）、mussaendoside U（7 號峰）、mussaendoside H（3 號峰）。含量測定結(jié)果顯示，10 批玉葉金花總皂苷樣品中，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O 的平均含量分別為0.01～0.05、0.10～0.21、0.10～0.18、0.03～0.08、0.20～0.40 mg/g。

血清ALT、AST含量是評估肝損傷的常用指標(biāo)。當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)輕微損傷時，細(xì)胞發(fā)生裂解，大量的ALT、AST等轉(zhuǎn)氨酶便會游離出來，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞外及血清中的轉(zhuǎn)氨酶含量急劇升高，故上述指標(biāo)含量的上升程度可反映肝細(xì)胞的受損程度[13]。研究發(fā)現(xiàn)，肝病患者體內(nèi)促炎因子的含量較高，其中TNF-α、IL-6、IL-1β等由肝巨噬細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞分泌，是重要的炎癥因子[14]。因此，本研究以血清中ALT、AST含量和肝組織中TNFα、IL-1β、IL-6含量為指標(biāo)，初步評價了玉葉金花總皂苷的肝保護作用。結(jié)果顯示，玉葉金花總皂苷具有一定的肝保護作用，可能通過抑制小鼠炎癥因子的釋放來減輕CCl4所致的急性肝損傷。本研究進一步采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對玉葉金花總皂苷肝保護作用的譜效關(guān)系進行了評價，結(jié)果表明，玉葉金花總皂苷的肝保護作用是多種成分共同作用的結(jié)果，其中mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C可能是其主要藥效成分。

綜上所述，本研究建立了玉葉金花總皂苷HPLC 指紋圖譜，各批樣品成分一致性較好，含量差異不大；10批樣品中，mussaendoside H、mussaendoside U、mussaglaoside C、mussaendoside G、mussaendoside O的平均含量不一；10批樣品均有一定的肝保護作用，mussaendoside O、mussaendoside G、mussaglaoside C 可能是其主要藥效成分。