補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷小鼠RhoA/ROCK通路的影響

邢燁鋒,趙武霞,歐志杰,張?zhí)彀?胡玥

(1.南通市通州區(qū)中醫(yī)院檢驗科,江蘇 南通 226300;2.南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院·中西醫(yī)結(jié)合學院,江蘇 南京 210023;3.常熟市中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇 常熟 215516)

缺血性中風約占所有中風的80%,是一種高發(fā)病率和高死亡率的腦血管疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后小膠質(zhì)細胞迅速增殖活化,參與腦缺血再灌注損傷的病理過程[2-3],對缺血后損傷發(fā)揮修復和加劇的雙重作用[4]。P2Y12受體是一種僅限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞代謝的嘌呤受體[5],與神經(jīng)病理和炎癥相關[6]。此外,激活的GTP-RhoA/ROCK2信號通路和提高的磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)水平促進炎癥損傷,在抑制P2Y12受體后可得到改善[6]。清代名醫(yī)王清任《醫(yī)林改錯》中的補陽還五湯在缺血性腦卒中的臨床防治中被廣泛運用[7]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),補陽還五湯可促進小膠質(zhì)細胞抗炎介質(zhì)的分泌,通過減輕炎癥反應以減輕腦損傷[8-9]。然而,補陽還五湯對腦缺血再灌注損傷小鼠P2Y12受體介導的RhoA/ROCK信號通路的影響尚未見報道。因此,本研究擬通過構建腦缺血再灌注損傷小鼠模型,探討補陽還五湯對小膠質(zhì)細胞的極化以及P2Y12受體介導的RhoA/ROCK炎癥信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物

健康C57BL/6J小鼠(SPF級)60只,雄性,6～8周齡,18～22 g,購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。實驗動物許可證號:SYXK(蘇)2018-0049。分籠飼養(yǎng)條件:自由進食、飲水,12 h光照和12 h黑暗交替循環(huán),溫度23～25 ℃,濕度40%～60%,適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學動物保護與倫理委員會批準(倫理編號:A21065),動物的飼養(yǎng)條件和實驗程序均嚴格遵守實驗動物管理委員會和倫理道德委員會規(guī)章制度。

1.2 補陽還五湯溶液制備方法

補陽還五湯由君藥黃芪120 g,臣藥當歸6 g以及佐藥赤芍4.5 g,川芎3 g,桃仁3 g,紅花3 g,地龍3 g組成(生產(chǎn)批號:20220201,安徽桐化堂中藥飲片科技有限公司),符合《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定。取上述各味中藥飲片混合加水浸泡1 h,水煎40 min后取藥液,藥渣同法再次煎煮,合并后濃縮為含生藥2 g·mL-1的補陽還五湯水溶液,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 儀器與試劑

純水儀(型號:Milli-Q Academic A10,美國Milipore公司);熒光顯微鏡[型號:IX73,奧林巴斯(中國)有限公司];高速冷凍離心機(型號:Vlicro CL21R,上海寶賽生物科技有限公司);冷凍切片機[型號:6250,達科為(深圳)醫(yī)療設備有限公司];化學發(fā)光底物(ECL)成像系統(tǒng)(型號:EI600,南京碧云天生物技術有限公司);低溫離心機(型號:CENTRIFUGE 5424R,德國Eppendorf公司);實時熒光定量PCR儀(型號:7500,美國ABI公司);顯影成像儀(型號:Tanon-4600,上海天能公司)。

MRS2395(貨號:M5942,美國Sigma公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑藍(TTC)染色劑(貨號:T819366,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司);Triton X-100(貨號:T8200,北京索萊寶科技有限公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(貨號:C1002,南京碧云天生物技術有限公司);BCA蛋白濃度試劑盒(貨號:P0012,南京碧云天生物技術有限公司);線栓(貨號:9070001701,瑞沃德生命科技有限公司);Trizol(貨號:15596026,美國Thermo公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:11119ES60,上海翌圣生物科技有限公司);SYBR染料(貨號:11201ES03,上海翌圣生物科技有限公司);兔抗Iba1(貨號:LKG5732,日本W(wǎng)ako公司);山羊抗CD206(貨號:ab64693)、P2Y12抗體(貨號:ab300140)、Alexa Fluor 488二抗(貨號:ab150077)、Alexa Fluor 594二抗(貨號:ab150116)、RhoA抗體(貨號:ab187027)、CD16/32抗體(貨號:ab215977)、ROCK抗體(貨號:ab134181)、鼠抗P2Y12抗體(貨號:ab184411)購自英國Abcam公司;p38 MAPK抗體(貨號:8690S)、p-p38 MAPK抗體(貨號:4511)購自美國CST公司;羊抗兔二抗IgG(貨號:S0001)、羊抗鼠二抗IgG(貨號:S0002)購自美國Affinity公司。

1.4 MCAO造模、分組與給藥

將小鼠隨機分為假手術(Sham)組、模型(MCAO)組、補陽還五湯低劑量(BYHW-L)組、補陽還五湯高劑量(BYHW-H)組、補陽還五湯高劑量+MRS2395(BYHW-H+MRS2395)組,每組6只。參考文獻的實驗方法構建MCAO模型[10],Sham組線栓不阻塞大腦中動脈。BYHW-L組、BYHW-H組在缺血24 h后每日分別給予補陽還五湯低、高劑量(6.5、26 g·kg-1)[11]處理,BYHW-H+MRS2395組小鼠除每日灌胃26 g·kg-1補陽還五湯外,將MRS2395溶于5%DMSO中,600 μg·d-1,腹腔注射,從術后前1 d開始,每日給藥3次,共6 d。Sham組和MCAO組給予等體積生理鹽水灌胃,共7 d。

1.5 神經(jīng)功能評分

分別在術后清醒第0、24、48、72 h和第7天,參考Zea-Longa神經(jīng)功能缺損評分標準[10],評估小鼠神經(jīng)功能受損程度。評分標準:無神經(jīng)功能缺陷,0分;提尾時阻塞側(cè)前爪不能完全伸展,1分;行走時向阻塞側(cè)轉(zhuǎn)圈,2分;行走時向阻塞側(cè)傾倒,3分;意識喪失,不能自主行走現(xiàn)象,4分。評分越高說明神經(jīng)損傷越嚴重。

1.6 TTC染色

術后第7天,摘眼球取血后斷頭取腦,將腦組織切成約2 mm厚的冠狀位腦片,置于1%TTC染色液中37 ℃避光孵育染色30 min,每5 min翻動1次使染色均勻,并拍照記錄。經(jīng)染色后有線粒體存活的正常組織呈玫瑰紅色,梗死區(qū)域呈灰白色,且界限分明,易于剝離。用Image Pro Plus軟件分析小鼠腦組織梗死體積和整個腦組織體積。梗死比=梗死體積/整個腦體積×100%。

1.7 免疫熒光雙染色

取小鼠腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,用檸檬酸鈉抗原修復液微波加熱10 min進行抗原修復,5%牛血清白蛋白(BSA)封閉后,分別加入M1型小膠質(zhì)細胞表面標記物兔抗Iba1(貨號:LKG5732)/鼠抗CD16/32(1∶200) (貨號:ab215977),M2型小膠質(zhì)細胞表面標記物兔抗Iba1/山羊抗CD206(1∶100) (貨號:ab64693)以及兔抗Iba1/鼠抗P2Y12 (1∶200) (貨號:ab300140),并4 ℃孵育過夜。第2天,加熒光二抗在37 ℃下孵育1 h,并用DAPI避光孵育10 min,封片置于暗盒中4 ℃保存。在熒光顯微鏡下觀察樣品。

1.8 qPCR檢測

使用滅菌器械取各組小鼠腦組織,用Trizol進行RNA提取,參考RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書得到組織cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆谩２捎胵PCR法進行擴增反應,然后運用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量,PCR引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成提供,引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.9 蛋白提取及Western blot分析

取各組小鼠腦組織缺血區(qū)域,-80 ℃保存?zhèn)溆?。磨碎的腦組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解,采用BCA測定法定量蛋白濃度,將Loading buffer加入蛋白中,100 ℃變性10 min。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白質(zhì)樣品,并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉后,分別加入鼠抗P2Y12(1∶500) (貨號:ab184411)、RhoA(1∶5 000) (貨號:ab187027)、ROCK(1∶1 000) (貨號:ab134181)、p38 MAPK(1∶1 000) (貨號:8090S)和GAPDH 一抗(1∶1 000) (貨號:ab8245),4 ℃孵育過夜。次日洗膜后,加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h,再次洗膜后顯影成像,使用Image Lab軟件進行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 補陽還五湯促進MCAO模型小鼠神經(jīng)功能的恢復

Longa評分越高,神經(jīng)損傷越嚴重,結(jié)果如表2所示。Sham組小鼠無神經(jīng)功能損傷,第0、24、48、72 h及第7天的神經(jīng)功能評分均為0分;而第7天MCAO組評分顯著升高(P<0.01),提示術后存在神經(jīng)功能損傷。術后持續(xù)給藥7 d后,與MCAO組相比,BYHW-H組神經(jīng)功能評分下降(P<0.05),提示高劑量補陽還五湯促進神經(jīng)功能恢復;與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組并無顯著性差異,但是評分低于BYHW-H組。

表2 各組神經(jīng)功能評分

TTC染色結(jié)果如圖1所示,術后第7天,取小鼠大腦經(jīng)TTC染色,結(jié)果顯示正常組織呈玫瑰紅色,梗死區(qū)域呈灰白色。與Sham組相比,MCAO組梗死體積明顯較大(P<0.01);與MCAO組相比,BYHW-L、BYHW-H組梗死體積減小(P<0.05,P<0.01);且BYHW-H組與BYHW-H+MRS2395組梗死體積并無顯著性變化。綜上所述,補陽還五湯可促進MCAO模型小鼠神經(jīng)功能的恢復。

圖1 補陽還五湯對MCAO小鼠腦梗死體積的影響

2.2 補陽還五湯促進小膠質(zhì)細胞從促炎向抗炎的表型轉(zhuǎn)化

如圖2所示,術后第7天,小鼠大腦組織免疫熒光染色結(jié)果顯示:與Sham組比較,MCAO組M1型小膠質(zhì)細胞的標記物CD16表達顯著上升(P<0.001);與MCAO組比較,BYHW-L、BYHW+H組CD16表達水平下降(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明補陽還五湯抑制M1型小膠質(zhì)細胞的增加。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組的CD16表達水平并無顯著性變化。同時檢測腦組織中M2型小膠質(zhì)細胞。與Sham組相比,MCAO組小膠質(zhì)細胞的M2型標記物CD206表達明顯降低(P<0.01);與MCAO組比較,BYHW-L、BYHW+H組CD206表達水平上升(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果表明補陽還五湯促進M2型小膠質(zhì)細胞的增加。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組的CD206表達水平無顯著變化。

注:A.小膠質(zhì)細胞的M1型標記物CD16;B.小膠質(zhì)細胞的M2型標記物CD206;與Sham組比較,##P<0.01,###P<0.001;與MCAO組比較,

小鼠MCAO術后第7天,采用qPCR進一步檢測補陽還五湯對小膠質(zhì)細胞標記物mRNA表達的影響。如圖3所示,與Sham組相比,MCAO組小鼠腦組織中M2型小膠質(zhì)細胞標記物CD206 mRNA和IL-10 mRNA表達增加(P<0.01,P<0.05),Arg-1 mRNA表達顯著減少(P<0.001);與MCAO組比,BYHW-L、BYHW-H組CD206 mRNA、IL-10 mRNA(P<0.05,P<0.01)和Arg-1 mRNA(P<0.01)表達均上升。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組中3者表達水平無顯著差異。與Sham組相比,MCAO組TGF-β mRNA表達明顯上升(P<0.001);TGF-β mRNA的表達在BYHW-L、BYHW-H組中比在MCAO組中明顯降低(P<0.01),給予MRS2395后TGF-β mRNA表達與BYHW-H組相似,與其余3組變化趨勢不同,可能與P2Y12受體相關[12]。另外,與Sham組相比,MCAO組小鼠腦組織中M1型小膠質(zhì)細胞標記物CD16 mRNA和CD86 mRNA表達增加(P<0.01);與MCAO組比,BYHW-L、BYHW-H組CD16 mRNA表達均顯著下降(P<0.05,P<0.01),同時,BYHW-H組CD86 mRNA表達顯著下降(P<0.01)。綜上所述,補陽還五湯可能促進缺血/再灌注損傷后小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化,更深入的機制需進一步探索。

2.3 補陽還五湯對P2Y12介導的RhoA/ROCK通路的影響

為驗證MRS2395對小膠質(zhì)細胞P2Y12受體的抑制作用,對小鼠大腦組織進行免疫熒光雙染色,如圖4顯示,在MCAO模型中,小膠質(zhì)細胞中表達的P2Y12顯著上升(P<0.01),并且其表達可被抑制劑MRS2395顯著抑制(P<0.01),且BYHW-H也對小膠質(zhì)細胞中P2Y12表達有顯著的抑制作用(P<0.01)。

注:與Sham組比較;##P<0.01;與MCAO組比較,

MCAO術后第7天,Western blot檢測小鼠大腦組織蛋白表達。結(jié)果顯示,與Sham組相比,MCAO組P2Y12、RhoA、ROCK蛋白表達及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著上升(P<0.001);與MCAO組相比,BYHW-L、BYHW-H組P2Y12、RhoA、ROCK蛋白表達及p-p38 MAPK/p38 MAPK比值顯著降低(P<0.05,P<0.01)。與BYHW-H組相比,BYHW-H+MRS2395組中各指標影響無顯著差異,如圖5。

注:與Sham組比較;###P<0.001;與MCAO組比較,

3 討論

中風死亡率很高,其中缺血性中風患者占總中風人數(shù)的80%以上[1]。由于缺血性中風復雜的病理生理過程和中風治療的局限性[13],數(shù)百萬中風幸存者面臨罹患偏癱等殘疾的風險。補陽還五湯是治療中風的經(jīng)典名方,有補氣活血,化瘀通絡的功效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明該方可以從減輕炎癥反應、修復神經(jīng)和降低氧化應激等多方面防治腦卒中[14],相關信號通路涉及經(jīng)典的PI3K/AKT通路[15]、AMPK/mTOR通路[16]、Notch信號通路[17]等。

小膠質(zhì)細胞是正常或受損大腦必不可少的常駐免疫細胞,而腦缺血后小膠質(zhì)細胞不受控制或過度激活是有害的[18]。有研究表明,小膠質(zhì)細胞在刺激下被極化而呈現(xiàn)某種表型,常見的表型有2類,即經(jīng)典激活型M1表型,以及替代激活型M2表型。在腦缺血再灌注損傷等病理狀態(tài)下,M1型小膠質(zhì)細胞被過度活化,將加速分泌白細胞介素-β(Interleukin-β,IL-β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等炎癥因子,進一步擴大炎癥反應,加深神經(jīng)損傷程度;與之相對應,M2型小膠質(zhì)細胞為抗炎表型,可抑制炎癥反應[19]。本研究中,補陽還五湯干預7 d后,高劑量和低劑量組均能減少CD16+小膠質(zhì)細胞,即M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)量,同時增加CD206+小膠質(zhì)細胞,即M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量。此外,補陽還五湯也可調(diào)控小膠質(zhì)細胞標記物mRNA的表達。以上結(jié)果表明腦缺血再灌注損傷后,補陽還五湯的干預可促進小膠質(zhì)細胞M1到M2的表型轉(zhuǎn)化。

P2Y12是腦小膠質(zhì)細胞中豐富的嘌呤能受體,也是小膠質(zhì)細胞的特異性標志物[20]。在動物實驗中,腦損傷或注射ATP/ADP引發(fā)的P2Y12激活可以調(diào)節(jié)早期小膠質(zhì)細胞的反應,而P2Y12缺乏或抑制具有神經(jīng)保護作用。敲除小膠質(zhì)細胞中的P2Y12或給予P2Y12的抑制劑都顯示出改善腦缺血后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元活性和緩解神經(jīng)元損傷的作用[21]。此外,抑制P2Y12能夠預防M1型和M2型小膠質(zhì)細胞向高濃度的ADP區(qū)遷移,可抑制促炎因子的釋放[22]。在MCAO模型中,通過抑制小膠質(zhì)細胞中依賴于P2Y12的通路可保護小鼠免受MCAO引起的缺血性損傷和神經(jīng)損傷的影響[23-24]。綜上所述,抑制小膠質(zhì)細胞P2Y12受體的激活,可減少神經(jīng)元死亡,避免血腦屏障破壞而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

RhoA是小分子G蛋白家族的一員,參與許多細胞功能,包括細胞骨架重排、細胞運動、吞噬作用和細胞內(nèi)運輸[25]。RhoA在非活性形式(GDP結(jié)合)和活性形式(GTP結(jié)合)之間循環(huán),其活性形式與下游效應分子相互作用調(diào)節(jié)細胞功能。RhoA最匹配的下游效應分子是Rho激酶(ROCK),在各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中觀察到了RhoA/ROCK通路的激活,如中風和腦部炎癥[26],抑制RhoA/ROCK信號可以減輕神經(jīng)炎癥和缺血后的神經(jīng)元損傷[27-28]。研究表明,P2Y12參與的小膠質(zhì)細胞活化中,抑制ROCK后可降低p38 MAPK的磷酸化水平,激活的RhoA/ROCK/p38 MAPK信號通路被P2Y12拮抗劑逆轉(zhuǎn)[6,29],減輕神經(jīng)病理損傷。

本研究中,MCAO可引發(fā)P2Y12介導RhoA/ROCK通路相關蛋白的高表達,而補陽還五湯的干預可降低其表達。MRS2395為P2Y12受體抑制劑,然而在本研究中,BYHW-H+MRS2395組與BYHW-H組相比并無顯著差異,提示特異性拮抗P2Y12受體并不能抑制補陽還五湯的神經(jīng)保護作用,表明在P2Y12介導的RhoA/ROCK通路之外,補陽還五湯還可通過其他途徑發(fā)揮神經(jīng)保護作用,體現(xiàn)了中藥復方多靶點多途徑作用的特點,但具體機制仍需要進一步深入探索。