正壓防護頭罩消毒效果評價方法研究

孟軻音，張珊珊，駱萬博，卜昭陽，姚 騰，萬忠海，杜 鵬，劉 軍

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春 130118）

0 引言

近年來，世界各國頻頻應對傳染性非典型肺炎（severe acute respiratory syndrome，SARS）、高致病性禽流感、埃博拉病毒病、新型冠狀病毒感染等高致病性病原微生物導致的突發(fā)性疫情，為了保證實驗人員健康安全，個體防護裝備的選擇和使用成為了風險評估的重點。正壓防護頭罩因其可有效防護經呼吸道吸入或黏膜接觸導致個體風險的病原及對面部可形成全封閉防護等優(yōu)點[1]逐步取代了給視野帶來不便的護目鏡，被高等級生物安全實驗室的實驗人員廣泛使用。正壓防護頭罩在高等級生物安全實驗室主要應用于核心間的實驗操作中，且非一次性使用產品，這就要求實驗人員在核心間完成實驗操作后需對其進行消毒處理，以備下次實驗使用，而消毒劑的選用及最佳作用時間需要通過消毒效果驗證實驗加以驗證。目前，國內外尚無專門針對高等級生物安全實驗室用正壓防護頭罩消毒效果評價的統(tǒng)一方法。本試驗旨在研究衛(wèi)可消毒劑在不同作用時間對正壓防護頭罩上犬流感病毒（canine influenza virus，CIV）消毒效果的評價方法，探索出一套相對科學完整的正壓防護頭罩消毒效果評價方法，為在高等級生物安全實驗室開展正壓防護頭罩承載不同烈性病原消毒條件的確立實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和細胞株

試驗用CIV H3N2 亞型重組疫苗株[A/Canine/Qiaoke32Q-PR8/2019（H3N2）]和犬腎細胞（madin darby canine kidney cell，MDCK）均由軍事獸醫(yī)研究所病毒學研究室提供。

1.1.2 雞胚

試驗用雞胚為無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雞種蛋，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司，于37 ℃溫室條件孵化至9 日齡。

1.1.3 試劑和材料

試驗用試劑如下：病毒基因組RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；實時定量聚合酶鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒，購自依科賽生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒，購自上海紀寧生物技術有限公司；胎牛血清、DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養(yǎng)基，購自美國Gibco 公司；杜邦衛(wèi)可消毒劑，購自上?？颇綄櫸镉邢薰荆涣姿峋彌_鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS），購自?？寺∩锘瘜W制品（北京）有限公司；0.9%生理鹽水，購自中國國藥集團；引物，購自生工生物工程（上海）有限公司；其他試劑均購自Sigma公司。

試驗用材料如下：正壓防護頭罩，購自美國3M公司；1 mL 噴霧瓶，購自濮陽市魯蒙玻璃制品有限公司；一次性滅菌規(guī)格板，購自上?？颇綄櫸镉邢薰尽?/p>

1.1.4 儀器

試驗用儀器如下：Nano Drop 微量蛋白核酸儀、Thermo 酶標儀，購自賽默飛世爾（上海）科技公司；熒光定量RCR 儀，購自美國伯樂公司；臺式高速離心機，購自德國Sigma 公司；漩渦儀，購自德國IKA 公司；超凈工作臺，購自北京亞泰科隆公司；超純水儀，購自艾柯儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測定

用含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基將CIV 進行連續(xù)10 倍稀釋并吹打混勻，再將稀釋好的病毒接種于96 孔培養(yǎng)板中（每一稀釋度8 個重復孔），之后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。逐日觀察并記錄細胞病變情況，然后用Reed-Muench 法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。

使用雞胚進行病毒滴定時，將病毒液10 倍倍比稀釋后，每個稀釋度接種3 個雞胚，之后在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，然后吸出尿囊液，用1%雞紅細胞檢測血凝結果，計算雞胚半數(shù)感染量（EID50）。

1.2.2 中和劑鑒定試驗

依照《消毒技術規(guī)范》（2002 版）規(guī)定的程序進行中和劑鑒定試驗。本試驗消毒劑為1%衛(wèi)可消毒劑，中和劑為0.1%卵磷脂+2%吐溫80+0.5%硫代硫酸鈉PBS[2]。試驗按樣品不同分為8 組：第1 組為CIV；第2組為衛(wèi)可消毒劑+CIV；第3 組為（衛(wèi)可消毒劑+CIV）+PBS；第4 組為（衛(wèi)可消毒劑+PBS）+CIV；第5 組為PBS+CIV；第6 組為PBS+MDCK；第7 組為（衛(wèi)可消毒劑+PBS）+MDCK；第8 組為MDCK。本試驗消毒劑均作用10 min。將第1～5 組分別接種MDCK，觀察并記錄細胞病變情況，計算各組病毒滴度并進行比較。評判標準為：第2、3 組無病毒檢出或有少量病毒；第4、5 組病毒生長與第1 組相近；第6、7、8 組細胞正常生長，無病毒檢出。每組試驗均重復3 次。

1.2.3 病毒載體及環(huán)境對病毒活性的影響試驗

將試驗分為8 組。選取正壓防護頭罩較平整位置分別圈定8 塊3 cm×3 cm 的正方形小塊，用移液器各吸取200 μL CIV 懸液均勻涂抹其上，分別靜置30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min后[3]，用含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基浸濕的棉簽涂抹采樣，每塊往返取樣各10 次。采樣后，將棉簽采樣端剪入含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中分別接種MDCK，觀察并記錄細胞病變情況，計算病毒滴度。每組試驗重復3 次。

1.2.4 病毒滅活試驗

1.2.4.1 病毒載體模型建立

將正壓防護頭罩剪裁成面積為4 cm×4 cm 的若干片，并將市購3 cm×3 cm 滅菌規(guī)格板放置在裁剪后的正壓防護頭罩上備用。

1.2.4.2 病毒浸染與采樣

將試驗按消毒時間不同分為8 組，每組取200 μL CIV 懸液，用移液器輕輕均勻涂抹于病毒載體模型上，各噴灑800 μL 衛(wèi)可消毒劑，分別作用30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min，達到作用時間后分別加入中和劑，用含2% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基浸濕的棉簽涂抹采樣，每組往返取樣各10 次。采樣后，將棉簽采樣端剪入含2%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，旋渦振蕩1 min 備用。再用0.9%生理鹽水浸濕的棉簽涂抹采樣，每組往返取樣各10次后，將棉簽采樣端剪入0.9%生理鹽水，旋渦振蕩1 min，備用。

1.2.4.3 病毒回收率測定

本試驗采用RT-qPCR 法和ELISA 法驗證病毒回收率。取樣方法依照1.2.3 節(jié)采樣方法進行。RT-qPCR試驗及引物設計依據(jù)GB/T 27539—2011《動物流感檢測A 型流感病毒通用熒光RT-PCR 檢測方法》進行；ELISA 試驗根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.4.4 消毒效果驗證

將1.2.4.2 節(jié)采集的樣本按1.2.1 節(jié)方法分別接種MDCK 和雞胚，觀察并記錄細胞和雞胚病變情況，計算TCID50和EID50。每組試驗重復3 次。

2 結果

2.1 中和劑鑒定試驗結果

試驗結果顯示，試驗組2 和試驗組3 未有病毒檢出；試驗組4 和試驗組5 病毒滴度（TCID50）對數(shù)值與CIV 原液病毒滴度（TCID50）對數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義；試驗組6、試驗組7 和試驗組8 細胞正常生長（見表1）。表明0.1%卵磷脂+2%吐溫80+0.5%硫代硫酸鈉PBS 能有效中和1%衛(wèi)可消毒劑，且對細胞生長無影響。

表1 中和劑鑒定試驗結果（N=3）

2.2 病毒載體及環(huán)境對病毒活性的影響試驗結果

試驗結果顯示，在同一環(huán)境條件下，CIV 在正壓防護頭罩上作用30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min 后病毒滴度（TCID50）對數(shù)值分別為5.95、5.96、5.94、5.95、5.96、5.95、5.93，與CIV 原液病毒滴度（TCID50）對數(shù)值差異無統(tǒng)計學意義（如圖1 所示）。表明該試驗環(huán)境及正壓防護頭罩載體本身對CIV 活性無顯著性影響。

圖1 CIV 病毒滴度對數(shù)值

2.3 病毒滅活試驗結果

2.3.1 病毒回收率測定結果

接種細胞前樣本回收ELISA 試驗結果顯示，試驗組1、試驗組2、試驗組3 的CIV M1 蛋白質量濃度分別為12.31、9.01、8.95 ng/mL，其他5 個試驗組的CIV M1 蛋白質量濃度均為0.00；RT-qPCR 試驗結果顯示，試驗組1、試驗組2、試驗組3、試驗組4、試驗組5、試驗組6、試驗組7、試驗組8 的循環(huán)數(shù)閾值（cycle threshold，Ct）分別為6.31、6.33、6.64、6.30、6.32、6.33、6.31、6.32，與CIV 原液的Ct 差異無統(tǒng)計學意義。經計算，瞬時平均回收率為96.12%（如圖2 所示）。

圖2 接種細胞前樣本回收率檢測結果

接種雞胚前樣本回收ELISA 試驗結果顯示，試驗組1、試驗組2、試驗組3、試驗組4 的CIV M1 蛋白質量濃度分別為13.01、10.01、9.51、8.71 ng/mL，其他4 個試驗組的CIV M1 蛋白質量濃度均為0.00；RT-qPCR 試驗結果顯示，試驗組1、試驗組2、試驗組3、試驗組4、試驗組5、試驗組6、試驗組7、試驗組8 的Ct 分別為6.01、6.02、5.97、5.99、6.00、6.01、5.98、6.03，與CIV 原液Ct 差異無統(tǒng)計學意義。經計算，瞬時平均回收率為95.98%（如圖3 所示）。

圖3 接種雞胚前樣本回收率檢測結果

試驗表明，未滅活病毒回收率和病毒整體回收率均能有效得到保障，進一步確保了正壓防護頭罩消毒效果驗證方法的可靠性。

2.3.2 消毒效果驗證

試驗結果顯示，衛(wèi)可消毒劑作用CIV 30 s、1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、10 min、15 min 分別接種細胞后，病毒滅活對數(shù)值分別為4.01、4.54、4.79、6.00、6.00、6.00、6.00、6.00（如圖4 所示），即消毒時間超過3 min 后，可百分之百滅活病毒；接種雞胚后，病毒滅活對數(shù)值分別為3.35、4.34、4.67、4.86、6.00、6.00、6.00、6.00（如圖5 所示），即消毒時間超過4 min 后，可百分之百滅活病毒。

圖4 樣本接種在細胞中消毒效果驗證結果

圖5 樣本接種在雞胚中消毒效果驗證結果

綜上表明，1%衛(wèi)可消毒劑滅活正壓防護頭罩上CIV 的最佳作用時間為4 min。

3 討論

高等級生物安全實驗室是專門從事烈性病原研究的實驗室，是指防護等級為三級和四級的實驗室[4]。實驗期間，為了防止生物因子泄漏及保證實驗人員安全，實驗室需在達到很高氣密性的同時，還要通過空調和自控系統(tǒng)使其始終保持相對大氣環(huán)境一定數(shù)值的負壓[5]。長時間在負壓環(huán)境中工作會對實驗人員健康帶來不利影響，因此在高等級生物安全實驗室開展實驗工作需限制其最長工作時間，一般為4 h。這就要求實驗工作除了應有合理的實驗設計、熟練的操作技術外，與之配套的個體防護裝備的穿脫、消毒滅菌等環(huán)節(jié)也應科學合理，這樣才能有效節(jié)約實驗人員在高等級生物安全實驗室的工作時間。本研究提出的正壓防護頭罩消毒效果評價方法正是解決此問題的一個關鍵環(huán)節(jié)。

為了建立一套可供同行參考的科學嚴謹?shù)恼龎悍雷o頭罩消毒效果評價方法，本研究將可能對消毒效果產生影響的諸多因素進行了逐一研究，包括中和劑鑒定試驗、病毒載體及環(huán)境對病毒活性影響試驗、病毒滅活試驗（包括病毒回收率測定、消毒效果驗證）等。在消毒效果驗證試驗中，中和劑的選擇至關重要[6]，選擇正確有效的中和劑能瞬時終止消毒劑消毒功能，以確保此時間節(jié)點評價消毒劑作用效果的準確性，而中和劑的選擇則是依據(jù)消毒劑成分來確定的，本試驗選擇的是衛(wèi)可消毒劑，成分中含氯＞10%，因此根據(jù)《消毒技術規(guī)范》（2002 版），選擇含0.1%卵磷脂+2%吐溫80+0.5%硫代硫酸鈉PBS 作為中和劑。另外，試驗載體及外界環(huán)境因素及采樣方法對試驗本身也可能產生巨大影響[7]，本試驗為了模擬實驗人員退出核心間時對正壓防護頭罩噴灑消毒的過程，同時盡量減少和消除其他因素對試驗的影響，進行了反復驗證，即將正壓防護頭罩進行剪裁，作為試驗載體，在其上放置一次性無菌規(guī)格板以減少實驗誤差，在規(guī)格板中涂抹病毒后，用微量型噴灑器噴灑消毒劑。另外，在選擇病毒毒株上也進行了充分考慮，選擇了既可在細胞中增殖，又可在雞胚中增殖的CIV 疫苗株作為試驗毒株，成功復刻正壓防護頭罩噴灑消毒的環(huán)境。

衛(wèi)可消毒劑對病毒的殺滅原理是瞬時破壞病毒的蛋白結構[8]，繼而影響病毒的復制，但短時間內不會破壞核酸結構，因此本試驗選用RT-qPCR 法及ELISA 法對樣本回收率進行驗證[9-10]。ELISA 試驗結果表明，CIV M1 蛋白質量濃度隨滅活時間的增加而降低，與病毒滴度測定結果趨勢一致，說明活病毒回收率基本能夠得到保障；經RT-qPCR 試驗結果計算的病毒接種細胞和雞胚瞬時平均回收率均達95%以上，差異無統(tǒng)計學意義，進一步確保了正壓防護頭罩消毒效果驗證方法的可靠性。

為確保首次開展正壓防護頭罩消毒效果驗證方法探索的經濟性和安全性，本試驗未選用在高等級生物安全實驗室操作高致病性病原微生物。在本試驗成功建立正壓防護頭罩消毒效果評價方法的基礎上，下一步將繼續(xù)在高等級生物安全實驗室開展烈性病原消毒效果驗證本研究，為正壓防護頭罩確立最佳消毒條件。