LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞補(bǔ)體C3激活和ATP生成代謝的影響

張祺琪,王俊梅,岳子奇,郭逸芯,施麗媛,張曉紅,鄒華圍,彭全輝,薛 白, 王立志,王之盛,胡 瑞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所 肉用牛低碳養(yǎng)殖創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) 四川省牛低碳養(yǎng)殖與安全生產(chǎn)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 成都 611130)

牦牛是青藏高原優(yōu)勢(shì)畜種,是當(dāng)?shù)刂饕男竽廉a(chǎn)業(yè),也是農(nóng)牧民重要經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。高原牧區(qū)漫長(zhǎng)而嚴(yán)寒的冷季使得飼草料缺乏,牦牛在冷季時(shí)因饑餓造成生長(zhǎng)性能降低和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,牧民損失大,養(yǎng)殖生產(chǎn)效益低[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),生長(zhǎng)遲緩牦牛的瘤胃液和血液中LPS濃度高于正常牦牛,瘤胃上皮補(bǔ)體C3、TNF-α等免疫炎癥相關(guān)因子表達(dá)高于正常牦牛,其存在炎癥反應(yīng),導(dǎo)致瘤胃上皮屏障功能受損、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收受阻,生長(zhǎng)遲緩牦牛飼料轉(zhuǎn)化率較正常牦牛組降低38.1%[3-4]。補(bǔ)飼活性酵母、谷氨酰胺緩解瘤胃上皮炎癥反應(yīng)可增強(qiáng)上皮屏障功能,顯著促進(jìn)生長(zhǎng)遲緩牦牛補(bǔ)償生長(zhǎng)[5]。瘤胃是反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)消化、吸收代謝和免疫的重要器官[6]。瘤胃健康是反芻動(dòng)物高效養(yǎng)殖的基礎(chǔ),細(xì)胞ATP生成可為瘤胃上皮細(xì)胞增殖、屏障功能、營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)等提供能量,瘤胃上皮細(xì)胞含有高密度線粒體,能量代謝旺盛[7]。Kong等[8]研究表明,肉牛增重速度、飼料轉(zhuǎn)化率與瘤胃上皮細(xì)胞線粒體氧化磷酸化功能基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)。因此,高效的ATP生成是瘤胃上皮發(fā)育和功能健康的基礎(chǔ),但LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是否抑制牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成尚不清楚。

細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)是響應(yīng)LPS等免疫原啟動(dòng)免疫炎癥反應(yīng)和調(diào)控細(xì)胞能量代謝的重要系統(tǒng)。補(bǔ)體(complement)長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是由肝分泌進(jìn)入血液和淋巴液循環(huán)的一類(lèi)蛋白。當(dāng)細(xì)菌、病毒、內(nèi)毒素(LPS)等外源抗原進(jìn)入血液,首先被宿主抗體識(shí)別、結(jié)合后誘導(dǎo)血液中補(bǔ)體C3激活,C3蛋白分子被血液中轉(zhuǎn)化裂解酶(convertase)裂解為過(guò)敏毒素(anaphylatoxin, C3a)和調(diào)理素(opsonin, C3b)活性肽段,進(jìn)而激活下游補(bǔ)體成分級(jí)聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮激活免疫細(xì)胞、降解抗原蛋白、誘發(fā)炎癥等免疫作用。近年研究發(fā)現(xiàn),免疫細(xì)胞(人T細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)和非免疫細(xì)胞(人腸上皮細(xì)胞[9]、人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞[10]、小鼠脂肪細(xì)胞[11]等)均可合成補(bǔ)體C3蛋白,其通過(guò)細(xì)胞內(nèi)源組織蛋白酶(cathepsin)完成補(bǔ)體C3細(xì)胞內(nèi)激活和自分泌并直接作用于細(xì)胞信號(hào)通路,除了參與細(xì)胞免疫炎癥反應(yīng),還可調(diào)控細(xì)胞脂肪代謝、糖酵解等能量代謝過(guò)程[9]。并基于免疫細(xì)胞研究提出了細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體-能量代謝調(diào)控軸[12]。Wang等[13]和本課題組Hu等[1]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),奶牛和牦牛瘤胃上皮存在補(bǔ)體C3基因表達(dá),但瘤胃上皮細(xì)胞作為非免疫細(xì)胞是否存在LPS刺激下依賴組織蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3激活尚不清楚,由LPS誘導(dǎo)的炎癥是否抑制瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成亦不清楚,因此,本研究利用不同濃度LPS誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞建立炎癥模型,考察LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞補(bǔ)體C3激活關(guān)鍵酶、激活產(chǎn)物C3a和C3b濃度等的影響,以及細(xì)胞ATP生成的影響,為牦牛瘤胃上皮健康調(diào)控提供數(shù)據(jù)支撐和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

牦牛瘤胃上皮細(xì)胞選自本課題組前期分離并構(gòu)建的永生化牦牛瘤胃上皮細(xì)胞系[14];1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%的EDTA胰酶購(gòu)自上海Gibco公司,LPS(大腸桿菌)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,CCK-8試劑盒購(gòu)自成都Oriscience公司,牛(Bovine)白細(xì)胞介素6(IL-6)、牛(Bovine)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、牛(Bovine)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、牛(Bovine)補(bǔ)體片段3a(C3a)、牛(Bovine)補(bǔ)體片段3b(C3b)和牛(Bovine)檸檬酸(CA) ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自重慶博諾恒生物科技有限公司,SteadyPuer快速RNA提取試劑盒和SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司,Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SurperMix for qPCR試劑盒購(gòu)自上海Yeasen生物公司,DAPI染色液、Mito-Tracker Red CMXRos和增強(qiáng)型線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自上海碧云天生物公司。

1.2 牦牛瘤胃上皮細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

選取凍存牦牛瘤胃上皮細(xì)胞在37 ℃水浴鍋中快速融化,1 000 r·min-1離心3 min,棄上清。加入1 mL完全培養(yǎng)基(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清)重懸后接種于25 cm2細(xì)胞瓶,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)至細(xì)胞密度為90%以上時(shí),消化后傳代。

1.3 LPS誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞炎癥模型建立

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為104·mL-1按100 μL·孔-1的細(xì)胞懸液接種于96孔板,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h,棄上清,用PBS洗2遍。分別加入100 μL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至10、20、40、80、160 μg·mL-1),以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞為對(duì)照組,另以只含有完全培養(yǎng)基的孔為空白組,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),處理細(xì)胞24 h。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率,初步篩選誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞炎癥模型LPS的濃度。

1.4 ELISA法測(cè)定相關(guān)指標(biāo)

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞按照合適密度接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí),分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),處理細(xì)胞24 h。收集各孔細(xì)胞上清和細(xì)胞,用于后續(xù)ELISA檢測(cè) IL-6、IL-1β、TNF-α、C3a和C3b的含量,具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 RNA提取和qPCR

1.5.1 RNA提取和cDNA合成 收集的細(xì)胞樣采用SteadyPure快速RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度以及純度(OD260 nm/OD280 nm≥ 1.8),檢驗(yàn)合格后,取10 μL總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

1.5.2 qPCR引物 參照GenBank上牦牛的IL-6、IL-1β、TNF-α、C3、ME1、LDHA、CTSB、CTSL及β-actin內(nèi)參基因引物序列,通過(guò)上海生工生物工程股份有限公司成都分部設(shè)計(jì)引物并合成,并用RNase-Free ddH2O稀釋至100 μmol·L-1,引物序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的基因引物序列Table 1 Primer sequences for Real-time PCR

1.5.3 qPCR反應(yīng) 分別以不同濃度的LPS(0、10、20、40、80、160 μg·mL-1)誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞的cDNA為模板,根據(jù)qPCR試劑盒進(jìn)行相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系為2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA模板1 μL,2× SYBR Green Pro Taq HS Premix5 μL,加無(wú)菌無(wú)酶的ddH2O至10 μL。qPCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s。每個(gè)檢測(cè)進(jìn)行4次重復(fù)。不同的引物mRNA的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量用2-ΔΔCt(ΔΔCt=目的基因ΔCt值-內(nèi)參基因ΔCt值)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 微量法檢測(cè)ATP含量

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞按照合適密度接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí),分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),處理細(xì)胞24 h。收集各孔細(xì)胞,利用微量法檢測(cè)ATP的含量,具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 線粒體染色熒光強(qiáng)度

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞按照合適密度接種于12孔板中,待細(xì)胞融合至60%～70%時(shí),分別加入1 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),處理細(xì)胞24 h。根據(jù)Mito-Tracker Red CMXRox試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)線粒體染色后,用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20 min,再利用DAPI染色液對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色,利用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 線粒體膜電位檢測(cè)(JC-1)

將消化離心后的牦牛瘤胃上皮細(xì)胞按照合適密度接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí),分別加入2 mL·孔-1LPS溶液(89% 1640培養(yǎng)基+1%三抗+10%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至0、10、20、40、80、160 μg·mL-1),其中0 μg·mL-1為對(duì)照組,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)重復(fù),處理細(xì)胞24 h。消化后用1.5 mL離心管收集,具體操作按照增強(qiáng)型線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。裝載JC-1后利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

獲得的數(shù)據(jù)用EXCEL 2019進(jìn)行初步整理,使用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn),后使用One-way-ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,并以Duncan’s法進(jìn)行多重比較。線粒體染色熒光強(qiáng)度通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行分析,流式細(xì)胞儀測(cè)定的線粒體膜電位變化用FlowJo_V10軟件分析,最后結(jié)果用Graph PadPrism 8.0.0軟件繪制柱狀圖。結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞活力的影響

如圖1所示,通過(guò)LPS不同濃度(0、10、20、40、80、160 μg·mL-1)處理牦牛瘤胃上皮細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力呈極顯著下降趨勢(shì)(P<0.01)。與對(duì)照組相比,LPS濃度為10 μg·mL-1時(shí),顯示極顯著差異(P<0.01)。

不同小寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)間差異極顯著(P<0.01)。下同 Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.01). The same as below圖1 LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of LPS on cell viability of yak rumen epithelial cells

2.2 不同濃度LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞促炎因子分泌的影響

圖2A所示,與對(duì)照組相比,LPS不同濃度組的細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子濃度呈極顯著上升(P<0.01)。由圖2B可知,基因表達(dá)量同濃度趨勢(shì)變化相同,隨著LPS濃度增加,促炎因子基因表達(dá)量逐漸升高(P<0.01)。

2.3 不同濃度LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞補(bǔ)體C3激活的影響

如圖3A所示,與對(duì)照相比,不同LPS濃度處理牦牛瘤胃上皮細(xì)胞后,補(bǔ)體C3的基因相對(duì)表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。圖3B得知,補(bǔ)體C3激活產(chǎn)物補(bǔ)體片段C3a和C3b的含量同樣也隨著LPS濃度上升而極顯著增加(P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3激活關(guān)鍵酶CTSB和CTSL基因表達(dá)量如圖3C,與對(duì)照組相比,CTSB的基因相對(duì)表達(dá)量隨著LPS濃度增加極顯著上調(diào)(P<0.01)。與之相反,CTSL的基因相對(duì)表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

2.4 不同濃度LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成的影響

2.4.1 LPS對(duì)ATP生成代謝物濃度的影響 如圖4所示,與對(duì)照組相比,LPS處理導(dǎo)致牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP的含量極顯著下降(P<0.01)。在LPS濃度為20 μg·mL-1時(shí),與對(duì)照組相比,ATP的含量極顯著降低(P<0.01)。細(xì)胞無(wú)氧呼吸產(chǎn)物乳酸(LA)濃度極顯著下調(diào)(P<0.01)。三羧酸循環(huán)重要中間代謝產(chǎn)物檸檬酸(CA)的含量隨著LPS濃度增加先上升后又逐漸下降(P<0.01)。

2.4.2 LPS對(duì)線粒體數(shù)量的影響 由圖5A可知,通過(guò)線粒體紅色熒光探針染色后發(fā)現(xiàn),添加不同濃度的LPS,使線粒體熒光強(qiáng)度極顯著下降(P<0.01)。由圖5B統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,LPS濃度在10 μg·mL-1時(shí),線粒體紅色熒光強(qiáng)度極顯著下降(P<0.01)。

2.4.3 LPS對(duì)線粒體膜電位的影響 圖6所示為采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞攻毒24 h后,線粒體膜電位的變化,發(fā)現(xiàn)隨著LPS濃度的升高,產(chǎn)生紅光的聚合物逐漸減少,也就是線粒體膜電位逐漸降低(P<0.01)。在濃度20 μg·mL-1時(shí),與對(duì)照組相比,線粒體膜電位極顯著下降(P<0.01)。

2.4.4 LPS對(duì)ATP生成相關(guān)基因表達(dá)的影響 由圖7A得知,參與有氧呼吸催化丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能的ME1基因表達(dá)隨著LPS濃度的升高極顯著降低(P<0.01),圖7B可知,丙酮酸進(jìn)入無(wú)氧呼吸后促進(jìn)產(chǎn)生乳酸的關(guān)鍵酶LDHA的基因,在添加LPS后極顯著上調(diào)(P<0.01)。如圖7C所示ATP5A和ATP5C1的基因表達(dá)量隨著LPS不同濃度的處理極顯著下調(diào)(P<0.01),在LPS濃度為20 μg·mL-1時(shí),ME1、LDHA、ATP5A和ATP5C1的基因表達(dá)量與對(duì)照組相比均具有極顯著差異(P<0.01)。

3 討 論

前期研究表明,生長(zhǎng)遲緩牦牛瘤胃液和血液中LPS濃度升高導(dǎo)致瘤胃上皮發(fā)生免疫炎癥反應(yīng),損傷瘤胃上皮屏障功能,抑制牦牛飼料轉(zhuǎn)化率和機(jī)體高效生長(zhǎng)[1]。炎癥是機(jī)體受到病原體、有毒化合物或者輻射等刺激時(shí)產(chǎn)生的保護(hù)性反應(yīng),能促進(jìn)受損組織愈合并恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡[15]。LPS可以通過(guò)上調(diào)IL-1β和TNF-α等促炎因子從而建立炎癥模型[16]。奶牛的瘤胃上皮細(xì)胞在高劑量的LPS誘導(dǎo)下能升高促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達(dá)[17]。目前,對(duì)于牦牛瘤胃上皮細(xì)胞炎癥模型的建立未見(jiàn)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),LPS能使牦牛瘤胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞活力顯著下調(diào),并能誘導(dǎo)促炎因子的基因大量表達(dá)和含量增加。表明LPS誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞成功建立炎癥模型。

細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體系統(tǒng)激活在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性的免疫調(diào)節(jié)作用[18]。補(bǔ)體C3是免疫系統(tǒng)中的重要組成,C3基因敲除小鼠能顯著下調(diào)腎缺血再灌注損傷誘發(fā)的IL-1和IL-6等促炎因子表達(dá)和組織炎癥反應(yīng)[19]。補(bǔ)體C3激活是指細(xì)菌、病毒、LPS與宿主抗體結(jié)合后誘導(dǎo)補(bǔ)體C3裂解為C3a和C3b活性肽段的過(guò)程[20]。早期研究認(rèn)為,炎癥狀態(tài)下補(bǔ)體C3激活發(fā)生在血液中,C3轉(zhuǎn)化裂解酶(convertase)是激活關(guān)鍵酶。而Liszewski等[9]首次發(fā)現(xiàn),在人的免疫細(xì)胞T細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3的激活不同于血液中利用C3轉(zhuǎn)化裂解酶(convertase)激活,而是被細(xì)胞內(nèi)源組織蛋白酶L所激活。小鼠原代腸上皮細(xì)胞和人腸上皮細(xì)胞系Caco2胞內(nèi)補(bǔ)體C3由組織蛋白酶B和組織蛋白酶L激活[21],抑制CTSL和CTSB活性后能緩解補(bǔ)體過(guò)度激活導(dǎo)致的腸道炎癥損傷[22]。本試驗(yàn)中,LPS誘導(dǎo)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥后,補(bǔ)體C3大量激活,其下游補(bǔ)體片段C3a和C3b含量顯著增加,且補(bǔ)體C3在LPS濃度為20 μg·mL-1時(shí)表達(dá)量為最大值。說(shuō)明炎癥能促進(jìn)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞補(bǔ)體C3激活并使其裂解成蛋白片段C3a和C3b而發(fā)揮作用。研究表明不同類(lèi)型的細(xì)胞中激活補(bǔ)體C3的組織蛋白酶亞型不同,人T細(xì)胞中激活補(bǔ)體C3的組織蛋白酶L卻不能激活人肺上皮細(xì)胞內(nèi)的補(bǔ)體C3[9,23]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)不同濃度的LPS處理后,牦牛瘤胃上皮細(xì)胞中組織蛋白酶L逐漸降低,而組織蛋白酶B則是顯著升高的。說(shuō)明在牦牛瘤胃上皮細(xì)胞中CTSB可能是激活細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3的關(guān)鍵組織蛋白酶類(lèi)型。上述結(jié)果表明,牦牛瘤胃上皮細(xì)胞存在補(bǔ)體C3細(xì)胞內(nèi)激活過(guò)程,且組織蛋白酶B可能是激活牦牛瘤胃上皮細(xì)胞胞內(nèi)補(bǔ)體C3的主要蛋白酶。

A. LPS對(duì)補(bǔ)體C3基因相對(duì)表達(dá)量的影響;B. LPS對(duì)補(bǔ)體C3激活產(chǎn)物C3a和C3b濃度的影響;C. LPS對(duì)組織蛋白酶B和L基因相對(duì)表達(dá)量的影響A. Effect of LPS on the gene expression of complement C3; B. Effect of LPS on the concentrations of complement C3 activated products C3a and C3b; C. Effect of LPS on the gene expression of cathepsin B and cathepsin L圖3 LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞補(bǔ)體C3激活的影響Fig.3 Effects of LPS on complement C3 activation in rumen epithelial cells of yak

A. LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成濃度的影響;B. LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞乳酸生成濃度的影響;C. LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞檸檬酸生成濃度的影響A. Effects of LPS on concentration of ATP produced by yak rumen epithelial cells; B. Effects of LPS on concentration of LA produced by yak rumen epithelial cells; C. Effects of LPS on concentration of CA produced by yak rumen epithelial cells圖4 LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成的影響Fig.4 Effects of LPS on ATP production in rumen epithelial cells of yak

藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核;紅色熒光表示線粒體 Blue fluorescence represents the nucleus;Red fluorescence indicates the mitochondria圖5 LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞的線粒體數(shù)量的影響Fig.5 Effect of LPS on mitochondrial number of yak rumen epithelial cells

A. LPS對(duì)參與有氧呼吸促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)能的關(guān)鍵因子ME1基因表達(dá)的影響;B. LPS對(duì)丙酮酸進(jìn)入無(wú)氧呼吸促進(jìn)其產(chǎn)生乳酸的關(guān)鍵因子LDHA基因表達(dá)的影響;C. LPS對(duì)牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP合成酶亞基基因表達(dá)的影響A. Effects of LPS on the expression of ME1 gene involved in aerobic respiration and promoting cell productivity; B. Effects of LPS on the expression of LDHA gene, a key factor of pyruvate entering anaerobic respiration to promote lactic acid production; C. Effects of LPS on ATP synthase subunit gene expression in yak rumen epithelial cells圖7 LPS對(duì)ATP生成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of LPS on gene expression related to ATP production

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3激活可調(diào)控細(xì)胞ATP生成。人免疫細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3激活參與細(xì)胞能量代謝調(diào)控,誘導(dǎo)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體(GLUT1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(LAT1)表達(dá)增強(qiáng)[24]。在非免疫細(xì)胞中,補(bǔ)體C3激活可促進(jìn)小鼠脂肪細(xì)胞中甘油三酯的合成[10],反復(fù)刺激誘導(dǎo)滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生炎癥后發(fā)現(xiàn),C3a與線粒體上的C3aR受體結(jié)合后抑制線粒體呼吸產(chǎn)生ATP,使能量生成受阻[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),補(bǔ)體C3激活后,促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的關(guān)鍵酶LDHA的基因表達(dá)量顯著增加,而參與有氧呼吸促進(jìn)三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶ME1表達(dá)量顯著降低。這與Hu等[1]前期的研究中,生長(zhǎng)遲緩牦牛瘤胃上皮的LDHA和ME1表達(dá)趨勢(shì)一致。并且補(bǔ)體C3被激活后,牦牛瘤胃上皮細(xì)胞ATP5A和ATP5C1表達(dá)隨之降低,且ATP含量也同樣顯著下調(diào)。線粒體是細(xì)胞呼吸代謝和產(chǎn)生能量的重要場(chǎng)所,線粒體膜電位是反映ATP生成的重要指標(biāo)[26]。本研究中,通過(guò)對(duì)線粒體熒光強(qiáng)度及線粒體膜電位檢測(cè)發(fā)現(xiàn),線粒體數(shù)量及線粒體膜電位均顯著下調(diào)。上述結(jié)果提示,LPS刺激在抑制牦牛瘤胃上皮細(xì)胞有氧呼吸作用和抑制線粒體ATP生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。瘤胃上皮通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能將營(yíng)養(yǎng)小分子轉(zhuǎn)運(yùn)入血液供機(jī)體利用,瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)揮發(fā)性脂肪酸,氮和Na+、Mg+、K+及Ca2+等的轉(zhuǎn)運(yùn)都離不開(kāi)線粒體ATP生成后被NA+/K+-ATP酶利用,形成電勢(shì)差將鈉離子泵出細(xì)胞外進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[7,27],說(shuō)明瘤胃上皮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能與ATP的生成密切相關(guān)。因此LPS誘導(dǎo)C3激活和炎癥反應(yīng),可能通過(guò)抑制ATP生成導(dǎo)致瘤胃上皮功能健康問(wèn)題,限制飼料轉(zhuǎn)化率和機(jī)體生長(zhǎng)效率,本研究為通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控炎癥下瘤胃上皮ATP生成,促進(jìn)瘤胃健康和機(jī)體生長(zhǎng)提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究利用LPS誘導(dǎo)建立了牦牛瘤胃上皮細(xì)胞炎癥模型。炎癥狀態(tài)下,牦牛瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體C3主要被細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶CTSB激活,裂解產(chǎn)物C3a和C3b濃度增加,并抑制線粒體ATP合成酶亞基ATP5A和ATP5C1基因表達(dá),下調(diào)有氧呼吸關(guān)鍵酶ME1基因表達(dá)量,降低線粒體膜電位,抑制ATP生成代謝。因此LPS誘導(dǎo)炎癥可抑制瘤胃上皮細(xì)胞ATP生成,從而導(dǎo)致瘤胃健康問(wèn)題。