母牛不同發(fā)情階段唾液化合物的比較分析

董智豪,時(shí)玉新,郭冠華,原開(kāi)敏,修豪宇,汪 超,白俊艷,王 棟

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,洛陽(yáng) 471203;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193; 3.內(nèi)蒙古赤峰市敖漢旗農(nóng)牧局,赤峰 024300;4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,太谷 030801; 5.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)春 130118)

準(zhǔn)確、高效的鑒定母牛發(fā)情是奶牛場(chǎng)繁殖管理的重點(diǎn),也是人工授精成功的前提基礎(chǔ)[1]。為此,研發(fā)了人工觀察法[2]、直腸檢查法[3]、激素檢測(cè)[4]以及超聲波法[5]等發(fā)情鑒定方法,這些方法聯(lián)合使用,準(zhǔn)確率高,但耗時(shí)費(fèi)力,且需要較高的技術(shù)水平和責(zé)任心,最重要的是難以解決夜間發(fā)情及時(shí)鑒定問(wèn)題。近年來(lái),基于加速度傳感器研發(fā)的計(jì)步器發(fā)情鑒定方法[6],實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化,解決了夜間發(fā)情無(wú)人值守問(wèn)題。但是,安靜發(fā)情使計(jì)步器鑒定發(fā)情面臨巨大挑戰(zhàn)[7]。另外,還有陰道溫度[8]和陰道黏液電阻監(jiān)測(cè)設(shè)備[9]雖能有效鑒定出安靜發(fā)情牛,但兩種設(shè)備的侵入性易使動(dòng)物應(yīng)激,且黏液電阻值監(jiān)測(cè)法所受影響因素較多,自動(dòng)檢測(cè)難度大,其結(jié)果重復(fù)性難以保證。然而,公母牛交配前的信息交流,為突破安靜發(fā)情的鑒定瓶頸、及時(shí)準(zhǔn)確無(wú)侵入式母牛發(fā)情鑒定技術(shù)研發(fā),提供重要參考。這種母牛釋放出的用來(lái)刺激公牛爬跨的化合物被稱(chēng)為信息素,通過(guò)種內(nèi)信息素交流可能是生物進(jìn)化的結(jié)果[10],這點(diǎn)在昆蟲(chóng)相關(guān)研究中表現(xiàn)尤為明顯[11-16],并且在其它哺乳動(dòng)物繁殖過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[17-20]。

唾液是一種含有無(wú)機(jī)鹽、脂肪酸、蛋白質(zhì)等多種成分的生物體液[21-24],其成分復(fù)雜性也賦予了復(fù)雜的功能,尤其是動(dòng)物發(fā)情時(shí)唾液中的一些化合物在動(dòng)物繁殖過(guò)程中發(fā)揮了化學(xué)信號(hào)(信息素)作用,并對(duì)其繁殖和社會(huì)等行為產(chǎn)生了重要影響[25-26]。目前,從尿液、糞便、陰道黏液中找到的化合物較少,有些研究根據(jù)這些代謝物中檢測(cè)出的化合物,研發(fā)出相關(guān)的發(fā)情鑒定裝置或設(shè)備,但檢測(cè)效率較低(65%～75%)[27-28]。母牛唾液中也發(fā)現(xiàn)了一些發(fā)情相關(guān)化合物,但目前未見(jiàn)以這些化合物作為檢測(cè)目標(biāo)的發(fā)情鑒定方法。在先前的研究中,已經(jīng)對(duì)母牛發(fā)情不同階段唾液中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)一些化合物僅存在于發(fā)情時(shí)的唾液中,并且其中有些化合物能引發(fā)公牛產(chǎn)生性行為[29-31]。但是,目前的研究結(jié)果還存在著一些問(wèn)題,例如,不同研究者通過(guò)不同萃取方法得到的特異性化合物并不完全相同,唾液中存在多種能夠影響公牛性行為的化合物,并且組合使用不同化合物也會(huì)誘使公牛產(chǎn)生性行為。在奶牛糞便相關(guān)文章中,Sankar和Archunan[32]僅在母牛發(fā)情時(shí)鑒定出的化合物,在Mozūraitis等[33]的研究中只是含量上存在差異,這種差異可能是受限于檢測(cè)儀器的精密度,發(fā)情前后該化合物含量過(guò)少而未檢測(cè)到;Sankar和Archunan[32]將來(lái)自不同牛相同階段的糞便混在一起,對(duì)里面化合物種類(lèi)及含量進(jìn)行群體特征的研究,其研究結(jié)果無(wú)法體現(xiàn)不同牛個(gè)體特征,而Mozūraitis等[33]對(duì)牛糞便化合物的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同牛糞便中化合物含量差異較大。目前在牛唾液相關(guān)研究中,同樣缺乏對(duì)母牛個(gè)體特征、安靜發(fā)情母牛發(fā)情時(shí)的這些特異性化合物的變化特點(diǎn)以及與正常發(fā)情母牛有何異同的研究。

為促進(jìn)母牛唾液中揮發(fā)性化合物應(yīng)用于發(fā)情鑒定,本研究通過(guò)采用SPME方法提取母牛不同發(fā)情階段的唾液,獲取其它可能作為發(fā)情標(biāo)記的化合物;探究母牛個(gè)體間化合物的含量差異,以及呈現(xiàn)的個(gè)體特征與群體特征是否一致;探究安靜發(fā)情母牛唾液中存在的特異性化合物含量與正常發(fā)情母牛的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物選擇與樣品采集

預(yù)選擇石家莊天泉良種奶牛有限公司的25頭健康、產(chǎn)后15～35 d的可繁荷斯坦母牛進(jìn)行樣品采集,飼喂全混合日糧(total mixed rations, TMR),并保證每頭牛能自由、清潔飲水。在發(fā)情鑒定時(shí),根據(jù)活動(dòng)量變化和母牛外部表現(xiàn)初步進(jìn)行發(fā)情鑒定,再對(duì)具有發(fā)情表現(xiàn)的母牛采用直腸檢查和B超檢測(cè)進(jìn)行發(fā)情確認(rèn);對(duì)于安靜發(fā)情母牛,因其無(wú)明顯發(fā)情表現(xiàn),故根據(jù)產(chǎn)后時(shí)間進(jìn)行行為跟蹤,一旦觀察到母牛趴臥時(shí)陰道流出清亮黏液,再采用直腸檢查和B超檢測(cè)等方法,通過(guò)卵泡的發(fā)育狀態(tài)判斷其是否發(fā)情。發(fā)情時(shí)樣品采集于母牛卵泡發(fā)育至成熟大小(約1.5 cm),根據(jù)發(fā)情當(dāng)天時(shí)間,選擇發(fā)情前第2～4 天采集到的樣品作為發(fā)情前樣品,發(fā)情后第4天采集發(fā)情后樣品。使用針管從?？谇怀槿⊥僖?并將其放入10 mL的凍存管中。最終共采集到9頭母牛(4頭正常發(fā)情牛和5頭安靜發(fā)情牛)不同發(fā)情階段(發(fā)情前、發(fā)情時(shí)、發(fā)情后)的唾液樣品,并暫時(shí)保存在牧場(chǎng)的-20 ℃冰箱,后轉(zhuǎn)移至-40 ℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2 樣品檢測(cè)方法及流程

試驗(yàn)樣品采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(SPME-GC-MS)聯(lián)用法進(jìn)行檢測(cè)分析。首先利用相似相溶原理制的固相微萃取纖維,對(duì)母牛代謝物中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行富集,故固相微萃取纖維的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要,這是本試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。固相微萃取纖維主要從膜成分(種類(lèi))和膜厚度(規(guī)格)兩方面進(jìn)行選擇。按膜成分的性質(zhì)大致可分為非極性、中等極性和極性3種,市面上常見(jiàn)的纖維根據(jù)成分又可分為PDMS(非極性)、PDMS/DVB(非極性)、CAR/PDMS(中等極性)、PDMS/DVB/CAR(中等極性)、CW/DVB(極性)、PA(極性)等6種。本研究打算從不同性質(zhì)的纖維中各選一個(gè)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),再?gòu)闹羞x出最適合本試驗(yàn)使用的纖維,根據(jù)前人的研究[34],PDMS提取效率遠(yuǎn)低于的PDMS/DVB,而CW/DVB對(duì)于極性化合物的提取效率低于PA。所以選擇兩個(gè)效果較好的纖維,再加上CAR/PDMS以及PDMS/DVB/CAR進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。種類(lèi)確定之后需要選擇規(guī)格,相同種類(lèi)的纖維有不同規(guī)格的膜厚度,不同種類(lèi)的纖維規(guī)格也不一樣,總的來(lái)說(shuō)膜厚度在10～100 μm之間。膜厚度對(duì)化合物富集的影響存在以下特點(diǎn):膜越厚富集分子量小的化合物能力越強(qiáng),反之,膜越薄富集分子量大的化合物能力越強(qiáng)。從前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),牛代謝物中大部分為小分子化合物(相對(duì)分子質(zhì)量<1 000),故選擇膜厚度較厚的纖維進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)[34]。

所以,利用PDMS/DVB(65 μm)、CAR/PDMS(75 μm)、PA(85 μm)以及PDMS/DVB/CAR(80 μm)對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行檢測(cè),并根據(jù)對(duì)同一樣本的4種富集結(jié)果,從提取到的化合物總量以及種類(lèi)兩方面進(jìn)行分析:從檢測(cè)的化合物總峰面積(含量)來(lái)看,檢測(cè)到其中CAR/PDMS在3個(gè)時(shí)期最高(發(fā)情前為5.52×108,發(fā)情時(shí)為1.07×109,發(fā)情后為7.60×108),PA最低(3.8×107,2.94×107,3.24×107),PDMS/DVB(1.55×108,2.10×108,1.60×108)以及DVB/CAR/PDMS(1.96×108,1.98×108,1.34×108)二者檢測(cè)到的含量處于中游,由此可見(jiàn),CAR/PDMS檢測(cè)到的化合物總量顯著高于其它3種纖維;從化合物富集種類(lèi)數(shù)量來(lái)看,DVB/CAR/PDMS富集的化合物種類(lèi)最多(發(fā)情前92種,發(fā)情時(shí)88種,發(fā)情后81種),其余3種分別為:PDMS/DVB(76、75、75種)、CAR/PDMS(78、67、79種)、PA(68、72、60種),相較于峰面積成倍的差異,化合物種類(lèi)上的差異并不明顯。綜合考慮后選擇CAR/PDMS纖維用于后續(xù)唾液檢測(cè)試驗(yàn)。

將冷凍保存的唾液2 mL轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中解凍,然后轉(zhuǎn)移至用磁性吸附金屬蓋封閉的20 mL棕色磁性吸附螺口頂空瓶(蓋和瓶均購(gòu)自北京華威思科科技有限公司)中。用固相微萃取方法(solid-phase microextraction,SPME)萃取唾液中揮發(fā)出的化合物。升高溫度有助于提高方法的靈敏度(揮發(fā)的物質(zhì)可能更多),但有些化合物可能對(duì)更高的溫度敏感,從而被頂空瓶中的空氣氧化。鑒于此,每個(gè)樣品預(yù)熱至約38 ℃(接近奶牛體溫)15 min。每次富集前,在270 ℃下在GC注射器中凈化SPME纖維8 min,消除SPME纖維中的化合物殘留。隨后SPME注射器的針頭刺穿小瓶隔膜,將纖維暴露于頂空瓶中,并停置于樣品上方幾毫米處,并在38 ℃下富集化合物1 h。

使用Y156氣相-超高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號(hào):Q-Exactive GC,Thermo Fisher,美國(guó))進(jìn)行對(duì)樣品中化合物進(jìn)行分離鑒定,使用WAX氣相色譜柱(長(zhǎng)度30 m;內(nèi)徑0.25 mm;膜厚0.25 μm)進(jìn)行色譜分離;GC條件設(shè)定:以氦氣作為載氣,進(jìn)樣口溫度設(shè)定為200 ℃,色譜柱溫度開(kāi)始時(shí)設(shè)置為40 ℃,運(yùn)行2 min,然后以4 ℃·min-1的速度增加至132 ℃,最后以10 ℃·min-1增加至230 ℃,運(yùn)行15 min,檢測(cè)器溫度控制為250 ℃。質(zhì)譜條件設(shè)定為:電子電離(離子源);電子轟擊能量:70 eV;離子源溫度:200 ℃。

通過(guò)將揮發(fā)性化合物的色譜與質(zhì)譜數(shù)據(jù)與計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST、wiley9、Home Flavor(自建庫(kù)))中提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)后,確定化合物的種類(lèi)。

1.3 樣品中化合物的相對(duì)定量

為了在一定程度上消除操作條件以及儀器狀態(tài)帶來(lái)的系統(tǒng)誤差,通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的相對(duì)含量。本研究采用氘代乙酸-d{4}(99.5%,北京伊諾凱科技有限公司)作為內(nèi)標(biāo)物,使用甲醇作為溶劑,向待測(cè)樣品中加入20 μL 5 mg·mL-1的氘代乙酸。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics軟件(版本26;IBM SPSS Inc., Chicago, USA)運(yùn)行Wilcoxon配對(duì)檢驗(yàn)[35],比較發(fā)情前后和發(fā)情時(shí)樣品中化合物含量的差異;利用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較正常發(fā)情牛和安靜發(fā)情牛不同階段的化合物含量。顯著性差異分析水平為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛不同發(fā)情階段唾液中化合物氣相色譜結(jié)果

通過(guò)SPME-GC-MS法檢測(cè)奶牛唾液樣品,得到相應(yīng)色譜圖(圖1)。色譜圖出峰情況顯示,母牛發(fā)情不同階段所有唾液樣品都得到有效檢測(cè),各樣品化合物成分大致相同,但是含量間存在不同程度差異,有些成分甚至達(dá)到顯著差異,說(shuō)明不同發(fā)情階段母牛唾液存在化合物成分差異。

2.2 不同奶牛中的共有化合物含量分析

本研究對(duì)每頭牛唾液樣品進(jìn)行了色譜檢測(cè),通過(guò)研究分析檢測(cè)結(jié)果,篩選出40個(gè)共有化合物,分析這些化合物在發(fā)情周期不同階段的含量差異,以尋找能夠作為母牛發(fā)情標(biāo)記的化合物,指示母牛發(fā)情。共有化合物信息見(jiàn)表1。

表1顯示,母牛唾液中的40個(gè)共有化合物含量差異較大,例如,發(fā)情時(shí)2-甲基-1-戊醇含量高達(dá)2 425.51 μg·mL-1,而鄰氨基苯乙酮含量低至1.4 μg·mL-1,這種量的差異或許說(shuō)明了各化合物生理意義存在重要差異;平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差差異也很大,說(shuō)明不同母牛間相同發(fā)情階段該化合物存在較大個(gè)體差異。為找出能作為母牛發(fā)情標(biāo)記的化合物,對(duì)40個(gè)共有化合物進(jìn)行了含量配對(duì)分析,并進(jìn)行了含量特征分析。配對(duì)分析后共找出23個(gè)化合物,分為兩種類(lèi)型,一種化合物發(fā)情時(shí)含量顯著高于發(fā)情前后,另一種發(fā)情時(shí)顯著高于發(fā)情前,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 配對(duì)分析篩選出的23個(gè)化合物結(jié)構(gòu)與含量分析

表2篩選出的23個(gè)化合物共分為7類(lèi),分別是醇類(lèi)、酮類(lèi)、酯類(lèi)、砜類(lèi)、烯烴類(lèi)、苯環(huán)類(lèi)、雜環(huán)類(lèi),其中,醇、酮類(lèi)數(shù)量較多,可能是發(fā)情母牛吸引公牛的重要性信息信號(hào)源。有些化合物間存在相似結(jié)構(gòu),可能在公母畜交流中發(fā)揮相似的生物學(xué)功能,例如,1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇和1-己醇等醇類(lèi)均為直鏈一元醇,不同分子間僅相差一個(gè)或多個(gè)CH2原子團(tuán);6-甲基-2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和7-甲基-6-辛烯-2-酮等酮類(lèi)的羰基均在2號(hào)位,并且側(cè)鏈基團(tuán)在末位(圖2)。

上述配對(duì)檢驗(yàn)表明,母牛唾液中發(fā)情特異化合物的含量在發(fā)情時(shí)顯著高于發(fā)情前期(P<0.05),但還不知道正常發(fā)情和安靜發(fā)情牛是否存在差異,為此進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析了23個(gè)化合物在正常發(fā)情和安靜發(fā)情時(shí)的差異,并比較了這些成分在正常發(fā)情和安靜發(fā)情牛中發(fā)情期顯著增加的比例,結(jié)果如圖3所示。

圖3顯示,23個(gè)發(fā)情時(shí)含量顯著高于發(fā)情前化合物在不同母牛發(fā)情期呈現(xiàn)個(gè)體分泌差異,其中,有8個(gè)化合物(1-戊醇、吡咯、1-己醇、3-己烯-1-醇、苯乙醇、6-甲基-2-庚酮、6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環(huán)己烯和2-戊基呋喃)在9頭牛(4頭正常發(fā)情,5頭安靜發(fā)情)中均表現(xiàn)出發(fā)情特異性(發(fā)情時(shí)含量高于發(fā)情前、后),可能是母牛發(fā)情標(biāo)記物。另外,有8個(gè)化合物(1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、甲酸辛酯、鄰氨基苯乙酮、3-羥基丁酮、1-丙醇、2-羥基苯甲酸甲酯、二甲基硫醚、亞磺酰基雙甲烷)均在牛正常發(fā)情時(shí)含量升高,僅在部分牛安靜發(fā)情時(shí)含量升高;相反,6-甲基-5-庚烯-2-酮和1-丁醇雖然在牛安靜發(fā)情時(shí)含量均升高,但是,在正常發(fā)情牛中僅部分個(gè)體含量升高,其是否能作為發(fā)情標(biāo)記物,有待進(jìn)一步研究。

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)(續(xù)表1 Continued)

表2 發(fā)情時(shí)顯著高于發(fā)情前的23個(gè)化合物的分類(lèi)

圖2 發(fā)情時(shí)顯著高于發(fā)情前期的23個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structural formulas of 23 compounds significantly higher during estrus than that before estrus

圖4為篩選出的23個(gè)化合物在不同牛中的含量變化趨勢(shì)。圖4顯示,在所有牛中表現(xiàn)出發(fā)情特異性的化合物共8個(gè),均存在較大個(gè)體差異,發(fā)情時(shí)均高于發(fā)情前、后,例如,1號(hào)正常發(fā)情牛發(fā)情時(shí)1-戊醇、1-己醇、2-戊基呋喃的含量遠(yuǎn)高于其他牛,這些發(fā)情特異化合物或許是吸引公牛的性信息素。另外,2-甲基-1-戊醇、2,6,6-三甲基-2-環(huán)己烯-1,4-二酮、3-甲基-1-丁醇、二甲基砜、亞磺酰基雙甲烷等5種化合物均在牛發(fā)情時(shí)含量升高,盡管在母牛發(fā)情后未全部下降,但可能不影響采用這些化合物去進(jìn)行發(fā)情牛鑒定。此外,對(duì)于1-辛烯-3-醇、7-甲基-6-辛烯-2-酮、1-丙醇、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、1-丁醇、二甲基硫醚、2-羥基苯甲酸甲酯、甲酸辛酯、鄰氨基苯乙酮等化合物,雖然發(fā)情時(shí)含量顯著高于發(fā)情前后,但是,僅在部分奶牛中表現(xiàn)出上述特征,可能無(wú)法單獨(dú)應(yīng)用于母牛發(fā)情監(jiān)測(cè),或許可通過(guò)幾種化合物組合指示發(fā)情。另外,有些化合物與發(fā)情特異化合物結(jié)構(gòu)相似,可能也具有類(lèi)似于信息素的生理學(xué)作用,例如1-丙醇、1-丁醇等。

為揭示23個(gè)化合物在正常發(fā)情和安靜發(fā)情牛唾液的含量差異,對(duì)兩類(lèi)牛不同發(fā)情階段化合物含量進(jìn)行方差分析(表3)。結(jié)果顯示,正常發(fā)情牛中大部分化合物平均含量高于安靜發(fā)情牛,并且,這種特征體現(xiàn)在不同發(fā)情階段。但是,正常發(fā)情?；衔锖科骄鶖?shù)的標(biāo)準(zhǔn)差大于安靜發(fā)情牛,說(shuō)明正常發(fā)情牛發(fā)情特異化合物的個(gè)體差異大于安靜發(fā)情牛。這些化合物含量在正常發(fā)情和安靜發(fā)情牛發(fā)情前差異不顯著(P>0.05);而發(fā)情時(shí),正常發(fā)情牛中6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環(huán)己烯和2-羥基苯甲酸甲酯兩個(gè)化合物含量顯著高于安靜發(fā)情牛(P<0.05);發(fā)情后,正常發(fā)情牛中3-己烯-1-醇、苯乙醇、1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘、6-(2,2,2-三氯-1-羥乙基)-1-甲基環(huán)己烯和2-羥基苯甲酸甲酯3個(gè)化合物顯著高于安靜發(fā)情牛(P<0.05)。綜上,發(fā)情時(shí)和發(fā)情后在正常發(fā)情牛和安靜發(fā)情牛間都存在一些差異化合物,但是,在發(fā)情時(shí)差異顯著的化合物僅有兩個(gè)(P<0.05)。所以,大部分化合物含量在正常發(fā)情與安靜發(fā)情牛唾液中的差別較小,安靜發(fā)情與否對(duì)于檢測(cè)發(fā)情并無(wú)影響。

3 討 論

本研究從牛唾液中檢測(cè)到40個(gè)共有化合物,從中篩選出23個(gè)發(fā)情期含量顯著高于發(fā)情前的化合物,這些化合物大多具有不同的氣味(表4)。以水為對(duì)照的研究表明,有氣味的物質(zhì)比水更能吸引奶牛[36],有氣味的化合物可能是奶牛性信息素的候選物質(zhì)。通過(guò)母牛卵巢切除試驗(yàn)證明,母牛尿液中性信息素主要來(lái)源于卵巢[37],推測(cè),唾液中所含性信息素也由卵巢分泌,而母牛卵巢在不同發(fā)情階段都受到相關(guān)激素調(diào)控,所以其釋放信息素可能也受到相關(guān)激素的調(diào)控,但是具體是何種激素及如何調(diào)控,需進(jìn)行更加深入的研究。

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

表3 不同時(shí)期正常發(fā)情牛和安靜發(fā)情牛唾液中23個(gè)化合物含量的對(duì)比分析Table 3 Comparison analysis of the contents of 23 compounds in saliva between normal estrus cows and silent estrus cows at different periods μg·mL-1

表4 23個(gè)化合物的理化性質(zhì)Table 4 Physicochemical properties of 23 compounds

Sankar等[38]將采集的不同娟姍(Jersey)奶牛唾液樣品混合,利用乙醚浸提后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),乙酸、丙酸、戊酸、三甲胺、4-甲基苯酚等5個(gè)化合物僅存在于發(fā)情階段,這些化合物可使公牛產(chǎn)生興奮性,引起公牛表現(xiàn)性行為;Aniita和G?ncü[39]混合不同荷斯坦奶牛唾液,利用自動(dòng)頂空富集法富集其中的揮發(fā)性化合物,對(duì)其分析檢測(cè)發(fā)現(xiàn),發(fā)情時(shí)僅3-(2-甲氧基乙基)-2-(2-吡啶)-1H-吲哚的含量顯著高于發(fā)情前和發(fā)情后(P<0.05)。本研究?jī)H在部分牛中檢測(cè)到上述娟姍牛發(fā)情相關(guān)的3種化合物(乙酸、丙酸和三甲胺),但未檢測(cè)到在上述荷斯坦牛發(fā)情相關(guān)化合物,這主要是因?yàn)樯鲜鲅芯績(jī)H檢測(cè)發(fā)情不同階段化合物的有無(wú),篩選出的化合物種類(lèi)少,而本研究兼顧了發(fā)情特異化合物質(zhì)和量上的差異,檢測(cè)出了更多的發(fā)情特異化合物,但發(fā)情特異化合物還可能與牛品種、試驗(yàn)條件、試驗(yàn)季節(jié)、化合物富集方法有關(guān),不同品種、不同養(yǎng)殖條件、不同季節(jié),母牛唾液揮發(fā)性化合物可能也存在較大區(qū)別,后續(xù)試驗(yàn)有必要針對(duì)這些條件進(jìn)行更深入細(xì)致的研究。

有關(guān)昆蟲(chóng)信息素的研究發(fā)現(xiàn),不同性信息素分子間存在相似的結(jié)構(gòu)特征[40],Sankar和Archunan[32]在母牛糞便中檢測(cè)的乙酸、丙酸,結(jié)構(gòu)高度相似,也能夠促進(jìn)公牛產(chǎn)生性行為,說(shuō)明生物分泌的一些結(jié)構(gòu)相似的化合物可能發(fā)揮著相似的功能。并且,一些性信息素成分間存在協(xié)同作用,例如,用乙酸、丙酸和1-碘十一烷同時(shí)或兩兩組合刺激公牛,公牛的性行為強(qiáng)于單獨(dú)用其中一種刺激公牛產(chǎn)生的反應(yīng)[32]。研究還發(fā)現(xiàn),用結(jié)構(gòu)相似的乙酸和丙酸共同刺激公牛產(chǎn)生的性行為反應(yīng)強(qiáng)于用兩種酸分別與1-碘十一烷組合刺激公牛,說(shuō)明結(jié)構(gòu)相似的性信息素間協(xié)同發(fā)揮的作用可能更強(qiáng)[32]。本研究發(fā)現(xiàn),23個(gè)化合物在發(fā)情時(shí)含量顯著高于發(fā)情前,其中1-戊醇和1-己醇在所有牛中都表現(xiàn)出發(fā)情特異性,可能在母牛發(fā)情時(shí)起到性信息素作用,而具有相似結(jié)構(gòu)的1-丙醇、1-丁醇沒(méi)有在所有母牛表現(xiàn)出發(fā)情特異性,也可能具有相同作用。并且,結(jié)構(gòu)相似的不同化合物在同一頭牛中含量差異較大,例如,1號(hào)正常發(fā)情牛發(fā)情時(shí)唾液中1-丙醇和1-丁醇含量較高(4 479.7、5 484.1 μg·mL-1),而1-戊醇和1-己醇含量較低(597.62、328.3 μg·mL-1),這種含量上的差異可能與化合物沸點(diǎn)高低關(guān)系較小(表3),但主要源于母牛分泌1-丙醇和1-丁醇更多,而分泌的1-戊醇和1-己醇較少。在母牛糞便檢測(cè)到乙酸含量高于丙酸[33],又有研究檢測(cè)到,乙酸對(duì)公牛的刺激效果強(qiáng)于丙酸[32],說(shuō)明結(jié)構(gòu)相似的不同化合物分泌量可能和其性信息素作用大小有關(guān)。

本研究對(duì)比分析了正常發(fā)情和安靜發(fā)情奶牛唾液中的揮發(fā)性化合物成分,發(fā)現(xiàn)正常發(fā)情和安靜發(fā)情奶牛中,23個(gè)發(fā)情標(biāo)志化合物在發(fā)情時(shí)含量均顯著高于發(fā)情前,但是,正常發(fā)情牛僅有兩種化合物顯著高于安靜發(fā)情牛(P<0.05),據(jù)此推測(cè),可能在正常牛中檢測(cè)到的發(fā)情特異化合物也可用于安靜發(fā)情牛的發(fā)情檢測(cè)。

那么,如何利用這些可能作為發(fā)情的標(biāo)記化合物檢測(cè)奶牛發(fā)情是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。公牛是通過(guò)與母牛相互接觸進(jìn)行發(fā)情鑒定的,但是,僅通過(guò)接觸母牛體液中的發(fā)情特異化合物,公牛也可產(chǎn)生性行為[32],說(shuō)明這些化合物可以反映母牛繁殖生理狀態(tài),為此可研發(fā)一些發(fā)情鑒定設(shè)備。但在實(shí)際應(yīng)用中,利用一種或少數(shù)性信息素的發(fā)情檢測(cè)效果不盡人意,例如,Wiegerinck等[27]開(kāi)發(fā)出一套基于乙酸和丙酸含量檢測(cè)的發(fā)情鑒定設(shè)備,對(duì)母牛糞便進(jìn)行檢測(cè),判斷母牛是否發(fā)情,檢出率僅為70%。本研究分析發(fā)情母牛唾液相關(guān)化合物成分和含量發(fā)現(xiàn),發(fā)情時(shí)顯著升高的23個(gè)化合物在不同牛中含量差別較大,同時(shí),乙酸、戊酸、三甲胺等發(fā)情相關(guān)化合物僅在部分牛中檢測(cè)到,說(shuō)明奶牛唾液的化合物成分和含量存在個(gè)體差異,這種差異可能影響了Wiegerinck等[27]開(kāi)發(fā)設(shè)備的發(fā)情檢出率。這給我們啟示,集成更多發(fā)情標(biāo)記化合物的智能化檢測(cè)設(shè)備或許能夠大大提高母牛發(fā)情檢出率。至于集成哪些化合物進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)還需更加深入的研究,相關(guān)研究或許能突破奶牛安靜發(fā)情鑒定瓶頸。

4 結(jié) 論

母牛發(fā)情時(shí)用以吸引公牛的性信息素為突破安靜發(fā)情鑒定瓶頸的自動(dòng)化鑒定技術(shù)研發(fā)提供思路。從母牛唾液檢測(cè)出的發(fā)情特異性化合物可作為發(fā)情候選標(biāo)記用于發(fā)情鑒定,且其含量在兩種發(fā)情狀態(tài)母牛間差異較小,為同時(shí)實(shí)現(xiàn)正常發(fā)情和安靜發(fā)情鑒定提供重要參考。