體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向肥大細(xì)胞分化的方法學(xué)研究①

廖晗婧 郭 冉 羅揚(yáng)淦 盧姿含 郝逗逗 朱枝祥（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

肥大細(xì)胞是引起過(guò)敏性疾病的重要效應(yīng)細(xì)胞，過(guò)敏反應(yīng)又稱為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，主要由患者體內(nèi)肥大細(xì)胞激活而誘發(fā)。目前認(rèn)為肥大細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)主要通過(guò)肥大細(xì)胞表達(dá)IgE 高親和力FcεRⅠ受體，與過(guò)敏原特異性IgE 抗體結(jié)合形成IgE-FcεRⅠ復(fù)合物，過(guò)敏原刺激后，肥大細(xì)胞被活化，導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，從而引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)［1-3］。因此，獲取大量高質(zhì)量的肥大細(xì)胞對(duì)進(jìn)一步研究其在Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)進(jìn)程中的作用及抗過(guò)敏藥物的藥效和作用機(jī)制具有重要意義。

目前過(guò)敏反應(yīng)研究的體外細(xì)胞模型大多使用大鼠腫瘤化RBL-2H3 細(xì)胞株，這種細(xì)胞雖保留了肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的多種功能，能夠用于抗過(guò)敏藥物初步篩選，但仍與原代細(xì)胞有很大差異，不能完全滿足抗過(guò)敏藥物藥效評(píng)價(jià)和機(jī)制研究需求［4-5］。體外原代培養(yǎng)的肥大細(xì)胞具備更完整的成熟肥大細(xì)胞特性，因此獲得大量原代培養(yǎng)的肥大細(xì)胞對(duì)肥大細(xì)胞及抗過(guò)敏藥物研究至關(guān)重要［6］。通過(guò)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取高質(zhì)量的肥大細(xì)胞還缺乏系統(tǒng)性的方法學(xué)研究，已有方法學(xué)研究缺乏細(xì)胞表型和功能鑒定，嚴(yán)重制約了抗過(guò)敏藥物的研發(fā)進(jìn)程［7-9］。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)骨髓造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，利用不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)肥大細(xì)胞分化，比較各種誘導(dǎo)方法對(duì)肥大細(xì)胞分化的影響，初步建立一種高效可行的原代肥大細(xì)胞培養(yǎng)方法，從而為肥大細(xì)胞功能調(diào)節(jié)藥物的藥效和作用機(jī)制研究提供高質(zhì)量的肥大細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF 級(jí)雄性C57BL/6小鼠9 只，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：1100112011044776，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房屏障環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境恒溫恒濕，室溫（24±1）℃，濕度（50±5）%，光照黑暗交替12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批（BUCM-4-2020082503-3075）。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Cytiva 公司；青霉素和鏈霉素混合液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Hank′s 平衡鹽溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京佰瑞達(dá)生物科技有限公司；FITC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD117 抗體、PE 標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD49b 抗體、APC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠FcεRⅠ抗體、7-氨基放線菌素D（7-AAD）死細(xì)胞染色液購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司；干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）、IL-3 購(gòu)自美國(guó)PeproTech 公司；牛血清白蛋白、偶聯(lián)牛血清白蛋白的二硝基苯（DNP-BSA）、抗DNP 的IgE 抗體、β-己糖胺酶底物4-硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；磷脂酶C（phospholipase C，PLC）抑制劑U73122、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制劑Staurosporine購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本三洋公司；DM500倒置顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司；FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；Enspire多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 方法

1.2.1 肥大細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡小鼠全身5 min，超凈臺(tái)無(wú)菌取小鼠股骨骨髓，利用1 ml 注射器吸取含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基將骨髓細(xì)胞沖至15 ml 無(wú)菌離心管，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加5 ml 紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加5 ml 含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，室溫300 g 離心5 min，棄上清；加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，接種至24 孔板（500 μl/孔）；設(shè)置3 種不同刺激孔：SCF 孔（終濃度50 ng/ml）、IL-3 孔（終濃度20 ng/ml）及SCF（終濃度50 ng/ml）和IL-3（終濃度20 ng/ml）聯(lián)合刺激孔，培養(yǎng)基總體積1 ml；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 周，每3.5 d 半量更新培養(yǎng)基，并重新添加1次細(xì)胞因子。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng) 第1、2、3、4 周取上述細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況并進(jìn)行拍照。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)和傳代 第1、2、3、4周重懸細(xì)胞，取各孔細(xì)胞懸液10 μl與等體積臺(tái)盼藍(lán)染色液混合，吸取到細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡下進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞增殖情況按適當(dāng)比例傳代培養(yǎng)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析肥大細(xì)胞 第1、2、3、4 周取各孔部分細(xì)胞至2 ml 離心管，4 ℃、300 g 離心5 min 后棄上清，并利用200 μl 流式染色緩沖液（含0.2%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液，pH=7.2）重懸；各樣本中加入FTIC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD117抗體、PE 標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD49b 抗體、APC 標(biāo)記的大鼠抗小鼠FcεRⅠ抗體和死細(xì)胞染色液7-AAD，終濃度均為1 μg/ml，冰浴染色30 min；加入1 ml 流式染色緩沖液清洗細(xì)胞，4 ℃、300 g 離心5 min 后棄上清，加入400 μl流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面FcεRⅠ和CD117表達(dá)。

1.2.5 肥大細(xì)胞功能測(cè)定 將上述各孔誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的細(xì)胞收集至15 ml 離心管，離心去上清，利用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×106個(gè)/ml，100 μl/孔接種至96 孔板，設(shè)置對(duì)照組、模型組及模型+給藥組；將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，6 h后模型組及模型+給藥組50 μl/孔加入抗DNP 的IgE 抗體，其余孔加入等體積含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育過(guò)夜；棄上清，100 μl/孔加入HBSS緩沖液孵育10 min，模型+給藥組50 μl/孔加入U(xiǎn)73122（終濃度1 μmol/L）或Staurosporine（終濃度1 μmol/L），其余孔加入等體積HBSS，孵育15 min，模型組及模型+給藥組各孔加入50 μl DNP-BSA 至終濃度1 μg/ml，孵育1 h，取出96孔板，每孔吸50 μl細(xì)胞上清至另一96孔板，向上清中50 μl/孔加入4-硝基苯基N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖（pH=4.5 的0.05 mol/L 檸檬酸緩沖液配制，濃度為1 mmol/L）孵育1 h，加入200 μl 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH=10.0）終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀于405 nm處測(cè)定OD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用FlowJo 7 軟件分析流式細(xì)胞檢測(cè)的源文件，分析活細(xì)胞中肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞比例。定量數(shù)據(jù)利用表示，GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及后續(xù)Dunnett 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)3 d 時(shí)，開(kāi)始鋪板的部分細(xì)胞死亡碎片化，SCF 刺激孔僅剩余少量細(xì)胞，IL-3 單獨(dú)刺激孔、SCF和IL-3 聯(lián)合刺激孔有明顯細(xì)胞增殖；1 周時(shí)，SCF 刺激孔細(xì)胞有少量增殖，IL-3 單獨(dú)刺激孔、SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔出現(xiàn)較快細(xì)胞增殖；2 周時(shí)，SCF 刺激孔細(xì)胞仍有少量增殖，IL-3 單獨(dú)刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞增殖很快，體積較大的增殖期細(xì)胞較多；3周時(shí)，SCF 刺激孔細(xì)胞基本停止增殖，IL-3單獨(dú)刺激孔、SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔細(xì)胞增殖仍很快，體積較大的增殖期細(xì)胞較多；4 周時(shí)，SCF 刺激孔細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞碎片增多，IL-3 單獨(dú)刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞增殖仍很快，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞相比IL-3 單獨(dú)刺激孔增殖期細(xì)胞比例更高（圖1）。

圖1 細(xì)胞體外培養(yǎng)照片（×100）Fig.1 Pictures of cultured cells in vitro（×100）

2.2 活細(xì)胞計(jì)數(shù) 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和傳代數(shù)量及比例統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)時(shí)間各刺激組細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果顯示不同細(xì)胞因子處理孔細(xì)胞增殖情況存在較大差異，SCF 刺激孔細(xì)胞增殖速度最慢，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞增殖速度最快。體外培養(yǎng)2 周后，IL-3刺激孔細(xì)胞數(shù)量相比SCF 單獨(dú)刺激孔顯著增加（P<0.05）；體外培養(yǎng)1 周后SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞數(shù)量相較SCF 刺激孔和IL-3 刺激孔顯著增加（P<0.05，圖2）。

圖2 各誘導(dǎo)條件對(duì)活骨髓細(xì)胞總數(shù)的影響Fig.2 Effects of different induction conditions on total numbers of live bone marrow cells

2.3 BMMC 分化 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)的第1、2、3、4 周，收集經(jīng)各種誘導(dǎo)條件處理的細(xì)胞進(jìn)行流式分析，F(xiàn)lowJo 軟件分析7-AAD-細(xì)胞中CD117 和FcεRⅠ表達(dá)，結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)，SCF刺激孔、IL-3刺激孔、SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔中7-AAD-CD117+FcεRⅠ+肥大細(xì)胞在7-AAD-細(xì)胞中占比也逐漸升高。細(xì)胞培養(yǎng)4 周流式圖可見(jiàn)，SCF 單獨(dú)刺激孔和IL-3 單獨(dú)刺激孔仍具有明顯分群的雜細(xì)胞，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔中主要為單一細(xì)胞群，根據(jù)統(tǒng)一的設(shè)門標(biāo)準(zhǔn)，BMMC 比例為52%左右，其他細(xì)胞可能為幼稚期肥大細(xì)胞（圖3A）。根據(jù)各刺激孔中活細(xì)胞總數(shù)和7-AAD-CD117+FcεRⅠ+BMMC 比例，計(jì)算各孔中BMMC 總數(shù)，結(jié)果顯示3 種誘導(dǎo)條件均可使BMMC 比例及總數(shù)上升，IL-3 單獨(dú)刺激孔BMMC 比例最高（P<0.05），SCF 和IL-3 聯(lián)合孔BMMC 總數(shù)顯著高于SCF 單獨(dú)刺激孔和IL-3 單獨(dú)刺激孔（P<0.05，圖3B、C）。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析BMMC分化Fig.3 Analysis of BMMC differentiation by flow cytometry

2.4 嗜堿性粒細(xì)胞分化 分析BMMC 分化同時(shí)，本研究也分析了嗜堿性粒細(xì)胞分化，通過(guò)分析7-AAD-細(xì)胞CD49b和FcεRⅠ表達(dá)，分析不同誘導(dǎo)條件下7-AAD-CD49b+FcεRⅠ+嗜堿性粒細(xì)胞在7-AAD-細(xì)胞中的占比，結(jié)果顯示SCF 刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞比例始終非常低；IL-3 刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞比例最高，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)，嗜堿性粒細(xì)胞比例不斷下降；SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔同樣是初期有一定比例嗜堿性粒細(xì)胞，但隨著時(shí)間增長(zhǎng)比例逐漸降低（圖4A）。根據(jù)各種誘導(dǎo)條件刺激孔活細(xì)胞總數(shù)和7-AAD-CD49b+FcεRⅠ+嗜堿性粒細(xì)胞比例，計(jì)算各孔嗜堿性粒細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果顯示在3 種誘導(dǎo)條件下的嗜堿性粒細(xì)胞比例及總數(shù)有顯著差異，IL-3 刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞比例1 周起即顯著高于SCF 刺激孔及SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔（P<0.05）；SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞比例一開(kāi)始顯著高于SCF刺激孔（P<0.05），但4周后嗜堿性粒細(xì)胞比例降低，與SCF 刺激孔差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-3 刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞總數(shù)從1 周起顯著高于SCF 刺激孔（P<0.05）；SCF 和IL-3聯(lián)合刺激孔嗜堿性粒細(xì)胞總數(shù)從1 周起即顯著高于SCF 刺激孔，2 周起顯著高于IL-3刺激孔（P<0.05，圖4B、C）。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分析嗜堿性粒細(xì)胞分化Fig.4 Analysis of basophil differentiation with flow cytometry

2.5 BMMC的釋放功能 根據(jù)流式分析，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔細(xì)胞主要為BMMC，收集該細(xì)胞，利用抗DNP 的IgE 抗體致敏BMMC，加入DNP-BSA 刺激BMMC 釋放顆粒，測(cè)定β-己糖胺酶釋放量評(píng)價(jià)BMMC 釋放功能，結(jié)果顯示誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周后，SCF 和IL-3 聯(lián)合刺激孔BMMC 經(jīng)抗DNP 的IgE抗體致敏和DNP-BSA 刺激后β-己糖胺酶釋放量較對(duì)照組顯著升高（P<0.05）。同時(shí)分析了BMMC 活化和顆粒釋放中需要的PLC 和PKC 抑制劑對(duì)其釋放β-己糖胺酶的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示PLC 抑制劑U73122 和PKC 抑制劑Staurosporine 處理組相比模型組均能顯著抑制β-己糖胺酶釋放（P<0.05，圖5）。

圖5 BMMC釋放β-己糖胺酶分析Fig.5 Analysis of β-hexosaminidase release of BMMC

3 討論

SCF 及其受體c-Kit 在造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要作用，對(duì)肥大細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮不可替代的作用，SCF 或c-Kit 基因突變均會(huì)導(dǎo)致肥大細(xì)胞大幅度減少，皮下注射外源SCF 則會(huì)導(dǎo)致注射部位肥大細(xì)胞大幅度增加［10-12］。IL-3 同樣對(duì)早期造血祖細(xì)胞和部分晚期祖細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮重要作用，體內(nèi)注射IL-3 能夠?qū)е路蚀蠹?xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞顯著增加［13］。目前常用的肥大細(xì)胞原代培養(yǎng)方法有SCF/IL-3 單獨(dú)誘導(dǎo)以及SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)，肥大細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法尚無(wú)確定標(biāo)準(zhǔn)［14-18］，因此本研究比較了不同誘導(dǎo)方式對(duì)肥大細(xì)胞分化的影響，確定肥大細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適宜方法和時(shí)間，初步建立了一種高效可行的原代肥大細(xì)胞培養(yǎng)方法。

本研究顯示SCF 單獨(dú)誘導(dǎo)可促進(jìn)肥大細(xì)胞分化，提高肥大細(xì)胞比例，但對(duì)肥大細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞增殖促進(jìn)作用較弱，獲得的肥大細(xì)胞總數(shù)較少，表明SCF 單獨(dú)誘導(dǎo)可能僅能促進(jìn)晚期肥大細(xì)胞祖細(xì)胞增殖和分化，獲得的肥大細(xì)胞純度和數(shù)量均有限。IL-3單獨(dú)誘導(dǎo)相較于SCF 單獨(dú)誘導(dǎo)不僅促進(jìn)了肥大細(xì)胞分化，提升肥大細(xì)胞比例，同時(shí)也促進(jìn)了肥大細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞增殖，培養(yǎng)4 周獲得的肥大細(xì)胞總數(shù)是SCF 單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)的10 倍，可能由于IL-3 對(duì)能夠分化為肥大細(xì)胞祖細(xì)胞的早期造血細(xì)胞增殖和分化具有促進(jìn)作用。SCF 和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)相對(duì)于SCF單獨(dú)誘導(dǎo)肥大細(xì)胞純度和總數(shù)均有顯著提高；SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)相對(duì)于IL-3 單獨(dú)誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的肥大細(xì)胞純度有所降低，但總數(shù)是IL-3 單獨(dú)誘導(dǎo)的100 倍，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)能夠促進(jìn)多個(gè)層次造血祖細(xì)胞增殖和分化為肥大細(xì)胞，顯著提高獲得的肥大細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量。雖然SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)4 周獲得的肥大細(xì)胞中有較多幼稚細(xì)胞，但獲得的肥大細(xì)胞純度和數(shù)量非常可觀。

IL-3能夠誘導(dǎo)嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生［13］。本研究同時(shí)分析了嗜堿性粒細(xì)胞分化，結(jié)果表明SCF 單獨(dú)誘導(dǎo)未提高嗜堿性粒細(xì)胞比例和總數(shù)。IL-3單獨(dú)誘導(dǎo)可較強(qiáng)地促進(jìn)骨髓細(xì)胞向嗜堿性粒細(xì)胞分化，嗜堿性粒細(xì)胞比例最高的時(shí)間為誘導(dǎo)后第1周。隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，嗜堿性粒細(xì)胞比例不斷下降，總數(shù)增加幅度也非常有限，可能由于IL-3 僅能促進(jìn)晚期造血祖細(xì)胞分化為嗜堿性粒細(xì)胞，同時(shí)嗜堿性粒細(xì)胞存活時(shí)間較短。SCF 和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)各時(shí)間點(diǎn)嗜堿性粒細(xì)胞比例均低于IL-3單獨(dú)誘導(dǎo)，SCF和IL-3聯(lián)合誘導(dǎo)的嗜堿性粒細(xì)胞總數(shù)在第2 周后高于IL-3單獨(dú)誘導(dǎo)，但數(shù)量遠(yuǎn)低于肥大細(xì)胞。因此，SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞4 周可獲得大量高純度的肥大細(xì)胞。

獲得大量高純度的肥大細(xì)胞后，本研究進(jìn)一步利用抗DNP 的IgE 抗體致敏和DNP-BSA 刺激肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)釋放的β-己糖胺酶活性評(píng)價(jià)肥大細(xì)胞功能［14-15］，結(jié)果表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞4 周獲得的肥大細(xì)胞經(jīng)抗DNP 的IgE抗體致敏和DNP-BSA 刺激后，β-己糖胺酶釋放量較對(duì)照組顯著升高，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的肥大細(xì)胞具有完整功能。另外本研究分析了PLC 抑制 劑U73122 和PKC 抑制劑Staurosporine 對(duì)肥大細(xì)胞β-己糖胺酶釋放的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示兩種陽(yáng)性抑制劑均能顯著抑制肥大細(xì)胞釋放β-己糖胺酶，表明SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 周的肥大細(xì)胞可用于抗過(guò)敏藥物的藥效和作用機(jī)制研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)SCF 和IL-3 聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞4 周能夠獲得大量高純度且功能完整的肥大細(xì)胞，可用于后續(xù)通過(guò)調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞功能用于抗過(guò)敏藥物的藥效和作用機(jī)制研究。