水凝膠負(fù)載bFGF對氧糖剝奪條件下樹突狀細(xì)胞的影響①

宋潼潼 惠文婷 顧逸雯 杜文靖 陳 霞（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130012）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死，常常危及生命。炎癥反應(yīng)在MI 后的左心室重塑中起關(guān)鍵作用。研究表明，在MI 之后，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）從骨髓遷移到缺血區(qū)，在MI和邊界區(qū)域積累，參與調(diào)控?fù)p傷部位的炎癥反應(yīng)［1-2］。因此，基于DCs調(diào)控MI后的炎癥反應(yīng)是改善心梗損傷的可行策略。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能的成纖維細(xì)胞生長因子的成員。近年研究表明，bFGF治療可以通過減少體內(nèi)和體外的氧化應(yīng)激來保護心臟，緩解MI 損傷和心肌細(xì)胞凋亡［3］。然而，由于bFGF的半衰期短，高劑量bFGF 的不當(dāng)給藥伴有各類副作用，包括視網(wǎng)膜病變、低血壓、血管瘤、水腫和血小板減少癥等，因此bFGF 的治療給藥目前僅限于實驗室和臨床試驗［4］。為克服這一問題，人們嘗試開發(fā)多種藥物遞送系統(tǒng)負(fù)載bFGF 進行靶向治療，其中水凝膠載藥系統(tǒng)是最受關(guān)注的方式之一。

水凝膠在組成和機械性能方面與細(xì)胞外基質(zhì)相似。它們能夠在組織再生過程中作為細(xì)胞的支持材料，并允許營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和生長因子的擴散，目前常用于組織工程［5］。本項目中制備的水凝膠緩釋貼片采用的原料是由膠原蛋白衍生而來的明膠，具有豐富度高、成本低、生物相容性好、可降解、抗原性低等優(yōu)點。水凝膠包含親水性三維交聯(lián)結(jié)構(gòu)，能夠吸收大量水分，為了確保其穩(wěn)定性和機械性能，課題組以戊二醛為交聯(lián)劑，通過交聯(lián)反應(yīng)合成水凝膠［6］。

目前，已明確bFGF 可靶向包括內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，發(fā)揮組織損傷修復(fù)作用，但其對DCs 的調(diào)控作用尚不明確。本研究在體外模擬MI 條件建立DC2.4 細(xì)胞氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）模型，初步探究負(fù)載bFGF的緩釋水凝膠貼片對OGD 條件下DC2.4細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 細(xì)胞采用DC2.4 小鼠樹突狀細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司（貨號：CL-0545）。

1.1.2 主要試劑 明膠（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；戊二醛（福晨化學(xué)試劑有限公司）；CCK-8（上海Bimake生物科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)基、無糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco 公司）；TNF-α ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物）；LDH 含量檢測試劑盒、MDA 含量檢測試劑盒、SOD 活力檢測試劑盒（北京索萊寶）。

1.1.3 主要儀器 MCO-170AICUVL-PC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；GC-C0626GC-C03 缺氧小室；D3024R 臺式高速冷凍型微量離心機；Tanon-4200SF顯影儀；Multiskan FC型酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 明膠水凝膠貼片的制備 使用超純水在60 ℃水浴加熱條件下制備不同濃度的明膠水凝膠（10%和20%），待明膠顆粒完全溶解并攪拌均勻后，將液體迅速轉(zhuǎn)入直徑為2 mm，厚度為2 mm 的圓形模具中，在4 ℃條件下進行冷凝。凝固后的水凝膠貼片置于常溫下用戊二醛熏蒸不同時長（24 h、48 h）后，將凝膠在-56 ℃下真空冷凍干燥24 h。

1.2.2 bFGF 裝載 將10 ng/μl bFGF 的PBS 溶 液通過0.22 μm 膜過濾，并在無菌條件下取100 μl 注入水凝膠貼片進行藥物吸附，24 h 左右完成吸附。將凝膠在-56 ℃下真空冷凍干燥24 h。

1.2.3 不同濃度水凝膠貼片溶脹性能檢測 將重量為W0的完全干燥水凝膠樣品浸入pH7.4 的2 ml PBS溶液中，在不同時間點，用濾紙擦干膨脹水凝膠的表面，并稱量其重量Ws。按照公式：溶脹率（SR）%=［（Ws-W0）/W0］×100%，計算水凝膠溶脹性能。

1.2.4 水凝膠細(xì)胞毒性檢測 將水凝膠貼片浸入DMEM 培養(yǎng)基中，于24 h后收集浸出液，采用CCK-8法評價水凝膠浸出液對正常生長的DC2.4 細(xì)胞活力的影響。

1.2.5 建立DC2.4 細(xì)胞氧糖剝奪模型 造模前將DC2.4細(xì)胞用正常培養(yǎng)基（DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗），在37 ℃、5%CO2和95%空氣條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至密度為80%～90%時進行OGD造模。OGD 處理時將細(xì)胞置于無糖DMEM 培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中充入94%N2和5%CO2，在37 ℃下培養(yǎng)4 h。

1.2.6 Western blot 造模完成后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），于冰上裂解30 min，在4 ℃，12 000 r/min 條件下離心20 min，取上清，采用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白樣品濃度。蛋白中加入適量5×loading buffer 于金屬浴中加熱變性5 min 后迅速置于冰上。將制備完成的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用Image J軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.7 ELISA 按照標(biāo)準(zhǔn)品濃度每孔加入50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品。在每孔加入10 μl 樣品和40 μl 樣品稀釋液。每孔加入100 μl HRP-conjugate 溶液，37 ℃孵育60 min。吸出孔內(nèi)的液體，用400 μl清洗液清洗，重復(fù)5次。每孔加入50 μl染色劑A和50 μl染色劑B，輕輕吹打混勻，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入50 μl終止液，孔內(nèi)顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。在450 nm波長下測定吸光度，數(shù)據(jù)處理。

1.2.8 LDH 活力檢測 LDH 催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸進一步與2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色，顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。

1.2.9 MDA 含量檢測 MDA 與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532 nm 處有最大吸收峰，進行比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量；同時測定600 nm 下的吸光度，利用532 nm 與600 nm 下吸光度的差值計算MDA含量。

1.2.10 SOD 活力檢測 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-.），可還原氮藍(lán)四唑生成藍(lán)色甲臜，后者在560 nm 處有吸收；SOD可清除O2-.，從而抑制了甲臜的形成；反應(yīng)液藍(lán)色越深，說明SOD活性愈低，反之活性越高。利用560 nm下的吸光度計算SOD活力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用表示，實驗重復(fù)至少3 次，結(jié)果采用Graphpad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本間比較采用t檢驗，多組樣本間的比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同制備條件下水凝膠溶脹性能比較 為篩選水凝膠最適制備條件，課題組配制了濃度為10%和20%的明膠水凝膠，并在室溫下通過戊二醛熏蒸分別交聯(lián)24 h和48 h。將冷凍干燥后的水凝膠貼片置于pH7.4 的PBS 溶液中，分別在3 min、5 min、10 min、20 min后檢測其溶脹率。如圖1A所示，10%的水凝膠溶脹率過高，不適宜用作組織貼片，20%的水凝膠在不同熏蒸時長下溶脹率差異不明顯，因此選擇濃度為20%，戊二醛熏蒸時長24 h 的水凝膠貼片（圖1B）進行后續(xù)實驗。

圖1 不同制備條件下水凝膠溶脹率Fig.1 Hydrated rate of hydrogel under different preparation conditions

2.2 水凝膠細(xì)胞毒性檢測 為明確水凝膠貼片是否影響細(xì)胞正常生長，課題組將20%明膠水凝膠、戊二醛交聯(lián)24 h 的20%明膠水凝膠貼片，分別浸入DMEM 培養(yǎng)基中，于24 h 后收集浸出液，加入正常培養(yǎng)的DC2.4 細(xì)胞中，采用CCK-8 檢測共培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后的細(xì)胞活力。結(jié)果如圖2 所示，與正常培養(yǎng)的對照組相比，20%明膠水凝膠與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 對細(xì)胞活力無明顯影響，使用戊二醛交聯(lián)24 h 的20%明膠水凝膠貼片與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)6 h 均對細(xì)胞活力無明顯影響，共培養(yǎng)12 h、24 h后對細(xì)胞活力僅有輕微抑制作用（P<0.05）。

圖2 水凝膠細(xì)胞毒性檢測Fig.2 Hydrogel cytotoxicity assays

2.3 負(fù)載bFGF 水凝膠貼片對氧糖剝奪后DC2.4細(xì)胞炎癥因子表達的影響 為明確水凝膠負(fù)載bFGF 對氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞炎癥因子表達的影響，課題組采用Transwell 小室，建立了DC2.4 細(xì)胞和負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片共培養(yǎng)體系。氧糖剝奪4 h 后采用Western blot 法檢測各組DC2.4 細(xì)胞炎癥因子表達情況。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，氧糖剝奪4 h后DC2.4細(xì)胞中IL-1β、Nlrp3蛋白表達明顯升高（P<0.05，P<0.01），bFGF 組與負(fù)載bFGF的水凝膠組顯著降低了IL-1β 表達水平（P<0.05），bFGF 組與負(fù)載bFGF 的水凝膠組顯著降低了Nlrp3表達水平（P<0.05）。以上結(jié)果提示，負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯抑制氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞促炎因子的表達。

圖3 DC2.4細(xì)胞炎癥因子表達Fig.3 Expressions of inflammatory factors in DC2.4 cells

2.4 負(fù)載bFGF 水凝膠貼片對氧糖剝奪后DC2.4細(xì)胞TNF-α 分泌的影響 為明確水凝膠負(fù)載bFGF對氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，課題組采用Transwell 小室，建立了DC2.4 細(xì)胞和負(fù)載bFGF的水凝膠貼片共培養(yǎng)體系。氧糖剝奪4 h后采用ELISA方法檢測各組DC2.4細(xì)胞上清中炎癥因子TNF-α 含量。結(jié)果如圖4 所示，與對照組相比，氧糖剝奪4 h 后DC2.4 細(xì)胞上清中TNF-α 含量明顯增加，負(fù)載bFGF 的水凝膠組明顯減少了細(xì)胞上清中TNF-α含量。以上結(jié)果提示，負(fù)載bFGF的水凝膠貼片可以明顯抑制氧糖剝奪后DC2.4 細(xì)胞促炎因子TNF-α的分泌。

圖4 DC2.4細(xì)胞TNF-α分泌情況Fig.4 TNF-α secretion in DC2.4 cells

2.5 水凝膠負(fù)載bFGF 對OGD 后DC2.4 細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 為明確負(fù)載bFGF 的水凝膠對OGD 后DC2.4 細(xì)胞的保護作用。課題組檢測了OGD后細(xì)胞中SOD和LDH活力，并檢測了細(xì)胞上清中MDA 含量。結(jié)果如圖5 所示，負(fù)載1 μg bFGF 的水凝膠貼片與DC2.4 細(xì)胞共培養(yǎng)，可顯著增加OGD 4 h 后細(xì)胞SOD 活力（P<0.01），并明顯減少細(xì)胞LDH 活力（P<0.05）和細(xì)胞上清中MDA 含量（P<0.01）。以上結(jié)果說明負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以減輕氧糖剝奪對DC2.4細(xì)胞的損傷。

圖5 DC2.4細(xì)胞SOD活力，細(xì)胞上清LDH活力和MDA含量Fig.5 SOD activity in DC2.4 cells，LDH activity and MDA content in cell supernatant

3 討論

MI后大量心肌細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)心肌組織不良重塑，包括心室壁變薄、瘢痕組織形成等，最終導(dǎo)致心力衰竭。傳統(tǒng)的冠狀動脈搭橋手術(shù)和藥理學(xué)方法，雖然可以降低心力衰竭死亡率，但難以恢復(fù)心肌功能。近年來，包括可注射生物材料和心臟貼片在內(nèi)的各種技術(shù)已被開發(fā)出來，以重建梗死心肌的功能［7］。

早有研究指出，bFGF的心肌內(nèi)給藥可誘導(dǎo)血管新生，改善心肌功能。但bFGF 治療方法最重要的局限性是其生物學(xué)半衰期過短，因此，需要將bFGF持續(xù)性遞送到細(xì)胞靶標(biāo)以達到預(yù)期的效果。為此，緩釋蛋白遞送系統(tǒng)提供了可行策略。本研究中利用水凝膠的高溶脹能力負(fù)載治療劑量的bFGF。由于整個負(fù)載過程是在室溫下，pH7.4 的PBS 溶液中進行的bFGF 的活性損失可以最小化。本研究采用的載藥水凝膠貼片是由明膠制成，明膠是一種天然的，可生物降解的動物蛋白，由膠原蛋白通過酸或堿催化的水解產(chǎn)生，廣泛用于化妝品，制藥和食品配方中［8］。負(fù)載bFGF 的明膠水凝膠已被證明可以用于鼓膜再生、改善缺血皮瓣存活率、促進傷口愈合等［9-11］。通過檢測其細(xì)胞毒性作用，明確了本研究中制備的明膠水凝膠貼片對細(xì)胞正常生長無明顯影響，安全性有一定保障，適宜用于后續(xù)體外或體內(nèi)試驗。

使用水凝膠的一個值得關(guān)注的方面是根據(jù)預(yù)期應(yīng)用適當(dāng)調(diào)整其機械性能，這是通過實施不同的策略來實現(xiàn)的，包括酶交聯(lián)、物理交聯(lián)、化學(xué)修飾和化學(xué)交聯(lián)［12］?；瘜W(xué)交聯(lián)產(chǎn)生的共價鍵的強度能夠提供生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用所需的機械力，包括組織工程和藥物遞送［13］。為了使明膠水凝膠具備藥物遞送所需的機械力，本課題組使用戊二醛熏蒸的方法對其進行化學(xué)交聯(lián)。戊二醛是一種有效的雙功能交聯(lián)劑，水溶性強，高效且經(jīng)濟［14］。本研究也驗證了戊二醛交聯(lián)對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示戊二醛熏蒸過后的明膠水凝膠對細(xì)胞活力無明顯抑制，具有一定的安全性。

心肌梗死后梗死區(qū)域的DCs 浸潤顯著增加［15］。DCs 在觸發(fā)自身免疫中具有核心作用。據(jù)報道，組織損傷后，骨髓和脾前體以及循環(huán)單核細(xì)胞分化為DCs，這些細(xì)胞對炎癥部位的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生各種影響，例如引發(fā)抗原特異性免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)耐受和慢性炎癥。研究表明，在AMI之后，DCs從骨髓遷移到缺血區(qū)，在MI 和邊界區(qū)域積累（在MI 后7 d 達到峰值），DCs相關(guān)的促炎作用與AMI后更嚴(yán)重的不良左心室重塑有關(guān)［16］。因此，調(diào)控DCs 功能可對心梗損傷修復(fù)發(fā)揮有利作用。本項研究，為在體外模擬心肌梗死環(huán)境，建立了OGD 細(xì)胞模型，揭示了負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯抑制OGD 后DCs 促炎因子的表達。

越來越多的研究證實，氧化應(yīng)激參與心肌梗死的病理進展。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為含有羥基的自由基、超氧化物、NO 等的活性氧過度積累，當(dāng)以活性氧為代表的氧化物量超過SOD 等抗氧化劑的抗氧化能力時，就會引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷，并伴有炎癥、肌細(xì)胞凋亡和間質(zhì)纖維化等［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片可以明顯增加OGD后DC2.4細(xì)胞SOD活力，減少膜脂過氧化產(chǎn)物MDA 的含量及LDH 酶活力，改善了氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，本載藥系統(tǒng)后續(xù)有望在心梗體內(nèi)模型中發(fā)揮調(diào)控免疫反應(yīng)的作用。

本研究目前有幾個局限性。首先，本載藥系統(tǒng)的生物相容性、降解能力等需要進一步驗證，同時有必要添加其他生物材料來改善其溶脹性能。此外，課題組進行了細(xì)胞實驗，以證實負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片對DCs 表達炎癥因子的影響，但需要使用動物模型進行進一步研究。例如，將負(fù)載bFGF 的水凝膠貼片遞送至心肌梗死部位，探究其對心梗后DCs 功能和免疫微環(huán)境的調(diào)控作用?？傮w而言，含有bFGF 的水凝膠顯示出調(diào)控心梗后炎癥反應(yīng)的巨大前景，未來課題組將進一步改善其性能，使其在臨床應(yīng)用中發(fā)揮作用。