小菜蛾腸道成團(tuán)泛菌PxG45的分離鑒定及其抗真菌活性

付東冉, 許小霞, 馮淑杰, 金豐良,*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 綠色農(nóng)藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642;2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510642)

小菜蛾P(guān)lutellaxylostella隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)。小菜蛾是寡食性害蟲,食性專一,以十字花科蔬菜為主。為了對(duì)小菜蛾進(jìn)行防治,長(zhǎng)久以來,人們嘗試使用各種廣譜性化學(xué)殺蟲劑。然而化學(xué)農(nóng)藥存在的3R[農(nóng)藥殘留(residue)、抗藥性(resistance)和害蟲再猖獗(resurgence)]效應(yīng)(李振宇等, 2020),使得尋找新生物農(nóng)藥、改良原有生物農(nóng)藥變得尤為重要。其中改良原有生物農(nóng)藥離不開對(duì)宿主響應(yīng)機(jī)制的研究,目前已有報(bào)道指出,昆蟲腸道共生菌很可能在此過程中起到重要作用(Chengetal., 2017; Gichuhietal., 2020; 王爭(zhēng)艷等, 2020)。

昆蟲腸道共生菌是棲息在昆蟲腸道中的微生物,是腸道微生物群落中最主要的成員(Chenetal., 2018),它們對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育(Shaoetal., 2012)、營養(yǎng)吸收(Salemetal., 2014)以及機(jī)體免疫(徐紅星等, 2009)均具有重要影響。多數(shù)情況下,腸道共生菌對(duì)宿主昆蟲是有利的,例如白蟻的腸道菌群可以將木質(zhì)素降解為宿主可利用的物質(zhì),幫助宿主的營養(yǎng)代謝(Aroraetal., 2022);小菜蛾腸道共生菌腸球菌Enterococcussp.可以提高宿主昆蟲對(duì)殺蟲劑毒死蜱的抗性(Xiaetal., 2018);小菜蛾腸道中的蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus可降解20%的茚蟲威,降低小菜蛾在茚蟲威施用后的死亡率(Ramyaetal., 2016)。

成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans是一種革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌,屬于變形菌門(Proteobacteria)γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)泛菌屬Pantoea(Spr?eretal., 1999),是泛菌屬的模式菌。成團(tuán)泛菌廣泛存在于土壤(Omaretal., 1989)、水(de los Angeles Mossoetal., 1994)和植物(Duanetal., 2007)中,同時(shí)成團(tuán)泛菌也是許多昆蟲的腸道共生菌(Gauthieretal., 2015),目前已從臺(tái)灣乳白蟻Coptotermesformosanus(Potrikus and Breznak, 1977)、沙漠蝗Schistocercagregaria(Hunt and Charnley, 1981)、舞毒蛾Lymantriadispar(Brodericketal., 2004)、鉤臂蟻蛉Myrmeleonbore(Nishiwakietal., 2007)、椿象(Pantatomidae)(Prado and Almeida, 2009)等多種昆蟲腸道中分離鑒定出成團(tuán)泛菌。Jin和Kim (2023)發(fā)現(xiàn)通過回補(bǔ)成團(tuán)泛菌可以挽救抗生素處理后薊馬發(fā)育遲緩的現(xiàn)象,證明成團(tuán)泛菌有利于宿主的生長(zhǎng)發(fā)育。另一方面成團(tuán)泛菌在宿主抵御病原微生物侵染的過程中起著重要作用,已有報(bào)道指出,沙漠蝗腸道中的共生菌成團(tuán)泛菌可以通過分泌抗真菌的酚類物質(zhì)幫助宿主抵抗昆蟲病原真菌綠僵菌Metarhiziumanisopliae的侵染(Dillon and Charnley, 1995)。

越來越多的研究證明腸道菌成團(tuán)泛菌在宿主存活和抵抗病原物侵染的過程中起到正向作用。然而截至目前,關(guān)于小菜蛾腸道中泛菌的報(bào)道仍停留在屬的層面(戴楠晶, 2014),鮮有報(bào)道泛菌屬下具體菌種及其在小菜蛾生存免疫等方面起到的作用。本研究從小菜蛾腸道中分離純化出1株腸道菌PxG45,并對(duì)PxG45進(jìn)行菌種鑒定和功能驗(yàn)證。結(jié)合平板對(duì)峙結(jié)果證明PxG45不僅可以抑制昆蟲病原真菌的生長(zhǎng),還對(duì)植物病原真菌具有廣譜性抑制作用。這不僅為腸道共生菌幫助宿主昆蟲抵御病原微生物侵染提供了一個(gè)較好的案例,同時(shí)找到了一個(gè)利用害蟲腸道共生菌的新方法,即將有抑菌作用的腸道菌作為生防菌防治植物病原微生物,為生物防治及新型農(nóng)藥開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與菌株

供試小菜蛾由本實(shí)驗(yàn)室傳代飼養(yǎng)50代以上。飼養(yǎng)條件為溫度(25±1) ℃、相對(duì)濕度65%、光周期16L∶8D。在傳代過程中幼蟲喂食人工飼料,飼料配方參照沈金紅等(2018),成蟲飼喂10%蜂蜜水補(bǔ)充營養(yǎng),卵用浸過蘿卜菜汁的卵卡收集。

供試小菜蛾腸道共生細(xì)菌PxG2由本實(shí)驗(yàn)室分離純化并長(zhǎng)期保存。PxG2屬于腸桿菌屬與PxG45同科不同屬且無致病性,在本研究中作為同型對(duì)照使用。供試?yán)ハx病原真菌球孢白僵菌Beauveriabassiana由中國科學(xué)院動(dòng)物研究所鄒振研究員惠贈(zèng)。球孢白僵菌孢子懸浮液的制備、侵染濃度的確定及侵染方法(飼喂法)的可行性分析參考王冰等(2014)。

供試植物病原真菌希金斯炭疽菌Colletotrichumhigginsianum、刺盤孢炭疽菌C.camelliae、茄鏈格孢菌Alternariasolani和丁香假單胞菌楊梅致病變種Pseudomonassyringaepv.myricae菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院馮淑杰副教授惠贈(zèng),尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種Fusariumoxysporumf. sp.cubenserace 4和稻瘟病菌Magnaportheoryzae菌株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院李云峰教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;2×Rapid Taq Master Mix和D2000 Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒TB Green Premix Ex TaqⅡ 購自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。本研究使用的其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 PxG45的分離純化與菌種鑒定

隨機(jī)選取10頭健康小菜蛾3齡第1天幼蟲,使用75%酒精對(duì)其進(jìn)行體表消毒,后用無菌蒸餾水洗滌3次洗去殘留酒精。使用消毒的鑷子解剖小菜蛾幼蟲腸道置于200 μL PBS中。將解剖的腸道研磨成勻漿,涂布于Luria-Bertani固體培養(yǎng)基(LB)上,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h時(shí)挑取培養(yǎng)基上的單菌落接種到新的LB固體培養(yǎng)基上重復(fù)純化5次以上。將純化后的細(xì)菌接種到LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,以1∶1 000比例(v/v)接種到LB液體培養(yǎng)基中,在37 ℃ 200 r/min條件下培養(yǎng)12 h得到種子液,再將種子液以1∶100比例(v/v)接種到新的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600=1.0獲得活化的PxG45菌株。使用平板劃線法(Coleetal., 2004)將PxG45接種至LB固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)12 h觀察菌落形態(tài)(佘小漫等, 2021)。使用光學(xué)顯微鏡觀察革蘭氏染色結(jié)果(徐德峰等, 2013)對(duì)PxG45菌株進(jìn)行分類。通過超薄切片制樣方法(Haegemanetal., 2009)使用透射電子顯微鏡對(duì)PxG45的內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取活化的PxG45的基因組DNA,提取后的DNA作為PCR擴(kuò)增模板。利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增PxG45的16S rDNA基因。PCR反應(yīng)體系: 2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL,DNA模板1 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,加滅菌ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè),切膠回收純化并送往擎科生物技術(shù)公司(廣州)進(jìn)行測(cè)序。使用SeqMan(DNAStar)對(duì)測(cè)序所得的16S rDNA基因序列進(jìn)行拼接,將拼接好的序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫,并與NCBI中rDNA/ITS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比較(Altschuletal., 1990)。選擇親緣關(guān)系相近的10種細(xì)菌的16S rDNA基因序列,使用Clustal x1.8方法(Thompsonetal., 1997),結(jié)合Mega 7.0軟件(Tamuraetal., 2013),采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)(Saitou and Nei, 1987)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以確定PxG45系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。同時(shí)根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第9版)對(duì)PxG45菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定,鑒定PxG45可利用碳氮源。

1.4 PxG45對(duì)小菜蛾幼蟲存活率的影響測(cè)定

將1.3節(jié)中2次接種的PxG45以8 000 r/min離心2 min,棄上清收集菌體,使用滅菌ddH2O清洗3次。用ddH2O將菌體進(jìn)行重懸,調(diào)整菌懸液至OD600=1.0,同型對(duì)照菌PxG2菌懸液獲得方法同上。去除1.1節(jié)人工飼料配方中的防腐劑,其他成分不變,制備不含防腐劑的人工飼料。將OD600=1.0的PxG45和PxG2兩種菌懸液分別加入到不含防腐劑的人工飼料(250 μL∶1 g)中,充分?jǐn)嚢杌靹颉?/p>

將健康小菜蛾3齡第1天幼蟲放入無菌培養(yǎng)皿,3個(gè)培養(yǎng)皿為一個(gè)處理,每個(gè)培養(yǎng)皿15頭蟲。饑餓處理3 h后飼喂混有PxG45和PxG2的無防腐劑人工飼料,并以混有ddH2O(250 μL)的無防腐劑人工飼料(1 g)作為假處理對(duì)照。每隔12 h記錄3組活蟲數(shù),直至3組活蟲數(shù)不變,計(jì)算存活率,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。增設(shè)1組混有ddH2O(250 μL)的正常人工飼料(1 g,含防腐劑),平行對(duì)比PxG45在小菜蛾幼蟲生存過程中所起作用與防腐劑是否有顯著差異。

1.5 PxG45對(duì)球孢白僵菌的生物測(cè)定

使用僅含PxG45菌懸液(OD600=1.0)的人工飼料(250 μL∶1 g)持續(xù)飼喂小菜蛾3齡第1天幼蟲12 h,以添加ddH2O(250 μL)的人工飼料(1 g)作為對(duì)照,12 h時(shí)更換僅添加球孢白僵菌孢子懸浮液(1×107CFU/mL)的人工飼料進(jìn)一步飼喂2組小菜蛾。每隔12 h記錄1次活蟲數(shù)量,直至2組活蟲數(shù)不變,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。為獲得小菜蛾無腸道菌種群,我們向剛孵化的小菜蛾幼蟲飼喂抗生素復(fù)合物(1 mg/mL左氧氟沙星、1 mg/mL環(huán)丙沙星和2 mg/mL甲硝唑)直至發(fā)育到3齡第1天;隨后解剖小菜蛾腸道,取內(nèi)容物涂板LB固體培養(yǎng)基;30 ℃培養(yǎng)24 h;與正常飼喂條件下所得內(nèi)容物的涂板結(jié)果進(jìn)行比較,參照Li等(2021)的方法進(jìn)一步檢測(cè)抗生素清除效果,獲得無腸道菌小菜蛾幼蟲。

為獲得僅含PxG45的小菜蛾種群,我們將PxG45菌懸液回補(bǔ)給經(jīng)抗生素處理后所得的無腸道菌小菜蛾種群,回補(bǔ)12 h時(shí)解剖取腸道內(nèi)容物,涂板LB固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)24 h時(shí)觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況;以未回補(bǔ)PxG45的無菌小菜蛾種群作為對(duì)照,檢測(cè)PxG45是否回補(bǔ)成功(Wangetal., 2022)。

向回補(bǔ)和未回補(bǔ)PxG45的小菜蛾無菌種群飼喂球孢白僵菌孢子懸浮液(1×107CFU/mL),對(duì)2組小菜蛾的存活率進(jìn)行生物測(cè)定。將球孢白僵菌侵染后死亡的小菜蛾轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基,在溫度(25±1) ℃和相對(duì)濕度75%±5%條件下培養(yǎng),待菌絲體從死亡小菜蛾中萌發(fā)后使用體視鏡進(jìn)行觀察,確保球孢白僵菌在飼喂條件下成功侵染小菜蛾。

1.6 PxG45對(duì)病原真菌抗菌活性測(cè)定

采用平板對(duì)峙方法(Fernandesetal., 2021)測(cè)定PxG45對(duì)球孢白僵菌以及植物病原真菌希金斯炭疽菌、刺盤孢炭疽菌、茄鏈格孢菌、丁香假單胞菌楊梅致病變種、尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種和稻瘟病菌7種病原真菌的抗性,將活化的病原真菌接種在PDA固體培養(yǎng)基中心,在距菌餅2.5 cm的對(duì)稱處分別接種PxG45。使用只接種病原真菌的平板作為對(duì)照,在溫度(25±1) ℃和相對(duì)濕度75%±5%下倒置培養(yǎng)。根據(jù)病原真菌的生長(zhǎng)周期,測(cè)定處理組和對(duì)照組的菌落直徑,評(píng)估PxG45的抑菌作用。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=[(對(duì)照組中病原真菌菌落直徑-處理組中病原真菌菌落直徑)/(對(duì)照組中病原真菌菌落直徑)]×100。

1.7 數(shù)據(jù)分析

存活率數(shù)據(jù)使用艾波特公式(Abbott’s formula)校正(Abbott, 1925)。采用log-rank(Mantel-Cox)檢驗(yàn)對(duì)不同處理下小菜蛾存活率差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用F檢驗(yàn)對(duì)處理組(與PxG45拮抗生長(zhǎng))真菌菌落直徑與對(duì)照組(單獨(dú)接種真菌)進(jìn)行方差同質(zhì)性檢驗(yàn),方差同質(zhì)性檢驗(yàn)后采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。數(shù)據(jù)處理及圖表制作均使用 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 小菜蛾腸道菌PxG45形態(tài)

在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的PxG45菌株顏色為黃色,菌落呈扁平圓形中部見凸起,菌體濕潤(rùn)黏著度高,菌落四周有淡色黃暈(圖1: A)。革蘭氏染色后細(xì)菌呈現(xiàn)紅色(圖1: B),為革蘭氏陰性細(xì)菌(Kauretal., 2020)。通過透射電子顯微鏡對(duì)PxG45進(jìn)行觀察,結(jié)果表明該細(xì)菌是一種具有鞭毛的桿狀細(xì)菌(圖1: C)。

2.2 基于16S rDNA基因的PxG45系統(tǒng)發(fā)育

PCR結(jié)果顯示,PxG45的16S rDNA基因序列大約長(zhǎng)1 500 bp,通過測(cè)序結(jié)果確定序列全長(zhǎng)1 437 bp (GenBank登錄號(hào): SUB9019981)。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明(圖2), PxG45分布在泛菌屬進(jìn)化分支上,與成團(tuán)泛菌Pantoeaagglomerans16S rDNA (NR 041978.1)序列一致性最高,達(dá)98.9%。

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于16S rDNA基因序列小菜蛾3齡幼蟲腸道細(xì)菌PxG45與其他菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the gut bacterium PxG45 from the 3rd instar larva of Plutella xylostella and other bacterial species based on 16S rDNA gene sequences constructed by neighbor-joining method

2.3 PxG45生理生化特征

PxG45生理生化測(cè)定結(jié)果顯示,PxG45可利用甲基紅、果糖、淀粉、D-甘露糖、乳糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、麥芽糖、D-木糖、纖維二糖和葡萄糖,不可利用H2S、吲哚、檸檬酸鹽、乳糖、棉子糖和氧化酶。通過形態(tài)學(xué)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析和生理生化測(cè)定的綜合結(jié)果,確定PxG45是成團(tuán)泛菌P.agglomerans。

2.4 PxG45對(duì)小菜蛾幼蟲存活率的影響

結(jié)果如圖3所示,以只添加ddH2O無防腐劑人工飼料為食的小菜蛾3齡幼蟲存活率顯著低于以含有防腐劑的正常人工飼料為食的小菜蛾3齡幼蟲存活率(P<0.01),且在48 h時(shí)無防腐劑組小菜蛾幼蟲存活率下降到68%,而這一現(xiàn)象在向無防腐劑人工飼料中添加PxG45后被逆轉(zhuǎn),即在不含防腐劑的人工飼料中添加PxG45,小菜蛾3齡幼蟲存活率顯著高于添加ddH2O的假處理對(duì)照組(χ2=6.835,P=0.009)和添加PxG2的同型對(duì)照組(χ2=4.697,P=0.030)。24 h時(shí),假處理對(duì)照組小菜蛾3齡幼蟲存活率為83%,同型對(duì)照組小菜蛾3齡幼蟲存活率為87%,而飼喂PxG45的處理組小菜蛾3齡幼蟲存活率還在93%以上。此后36-48 h時(shí)飼喂PxG45組小菜蛾3齡幼蟲與假處理對(duì)照組和同型對(duì)照組小菜蛾3齡幼蟲存活率差異更加明顯,直到48 h后3組活蟲數(shù)均不再發(fā)生變化。此時(shí)2組對(duì)照組3齡幼蟲存活率分別是68%(ddH2O)和73%(PxG2),而飼喂PxG45處理組幼蟲存活率仍保持在91%以上。將混有PxG45的無防腐劑組與含有防腐劑組進(jìn)行比較,得到結(jié)果顯示兩組間小菜蛾3齡幼蟲存活率無顯著差異(χ2=1.879,P=0.171)。以上結(jié)果說明PxG45與防腐劑等效,可以通過抑制環(huán)境中的微生物延緩飼料變質(zhì),對(duì)小菜蛾幼蟲起到保護(hù)作用,提高小菜蛾幼蟲的存活率。

圖3 飼喂成團(tuán)泛菌PxG45后小菜蛾3齡幼蟲的存活率Fig. 3 Survival rate of the 3rd instar larva of Plutellaxylostella fed with Pantoea agglomerans PxG45ddH2O, PxG2, PxG45: 分別表示添加ddH2O(假處理對(duì)照), PxG2(同型對(duì)照)和PxG45的無防腐劑人工飼料Preservative-free artificial diets with ddH2O (false treatment control), PxG2(isotype control) and PxG45, respectively; 防腐劑Preservative: 正常人工飼料Normal artificial diet. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3);符號(hào)表示兩組間的差異顯著性(nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01)(對(duì)數(shù)秩檢測(cè))。Data in the figure are mean±SE (n=3). Symbols indicate significance of difference between two groups (nsP>0.05; *P<0.05; **P<0.01)[Log-rank (Mantel-Cox)] test. 圖4和5同。The same for Figs.4 and 5.

2.5 PxG45對(duì)球孢白僵菌殺蟲活性的影響

如圖4所示,與飼喂ddH2O和球孢白僵菌的對(duì)照組相比,飼喂PxG45后球孢白僵菌侵染小菜蛾3齡幼蟲存活率顯著提高(χ2=4.169,P=0.041),在24 h時(shí)對(duì)照組已經(jīng)出現(xiàn)3齡幼蟲死亡,而處理組幼蟲存活率為100%; 36-108 h時(shí)兩組存活率差異更加明顯,在108 h后兩組活蟲數(shù)均不再發(fā)生變化,此時(shí)對(duì)照組存活率是53%,而處理組存活率保持在75%以上,表明PxG45顯著提高了球孢白僵菌侵染條件下小菜蛾幼蟲的存活率。

圖4 飼喂小菜蛾3齡幼蟲成團(tuán)泛菌PxG45后球孢白僵菌侵染后的存活率Fig. 4 Survival rate of the 3rd instar larva of Plutellaxylostella fed with Pantoea agglomerans PxG45 followed by Beauveria bassiana infectionBb: 球孢白僵菌B. bassiana; ddH2O+Bb: 對(duì)照組Control group.

如圖5所示,與未回補(bǔ)PxG45的對(duì)照組相比,回補(bǔ)PxG45的無菌小菜蛾3齡幼蟲對(duì)球孢白僵菌的敏感度顯著降低,幼蟲存活率顯著提高(χ2=9.897,P=0.024),在球孢白僵菌侵染36 h時(shí),未回補(bǔ)PxG45的小菜蛾無菌種群3齡幼蟲出現(xiàn)死亡,而回補(bǔ)PxG45的小菜蛾無菌種群3齡幼蟲存活率保持100%。48-96 h時(shí)兩組小菜蛾存活率差異更加明顯,在96 h后兩組活蟲數(shù)均不再發(fā)生變化。最后,在球孢白僵菌侵染96 h后,未回補(bǔ)PxG45的小菜蛾無菌種群3齡幼蟲存活率為80%,回補(bǔ)PxG45組的存活率為95%。以上結(jié)果表明PxG45可以顯著降低球孢白僵菌的殺蟲活性。

圖5 小菜蛾無菌種群3齡幼蟲回補(bǔ)成團(tuán)泛菌PxG45后球孢白僵菌侵染后的存活率Fig. 5 Survival rate of the 3rd instar larva of axenic Plutellaxylostella population reintroducted with Pantoea agglomerans PxG45 followed by Beauveria bassiana infectionBb: 球孢白僵菌B. bassiana; ddH2O: 對(duì)照組Control group; +PxG45, -PxG45: 分別為Bb侵染前回補(bǔ)PxG45和未回補(bǔ)PxG45 Reintroduction and non-reintroduction of PxG45 before Bb infection, respectively.

PxG45與球孢白僵菌拮抗培養(yǎng)的結(jié)果如圖6(A, B),PxG45對(duì)球孢白僵菌的抑制率為51.88%,在劃有PxG45菌株培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的球孢白僵菌菌落直徑為(31.98±0.09) mm,而單獨(dú)培養(yǎng)的球孢白僵菌菌落直徑為 (66.46±0.373) mm, 顯著大于與PxG45拮抗培養(yǎng)的處理組(P<0.001)。即PxG45對(duì)球孢白僵菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用。以上結(jié)果表明, PxG45可以通過抑制球孢白僵菌生長(zhǎng)降低病原真菌對(duì)小菜蛾的殺蟲活性,幫助宿主昆蟲抵御外來病原微生物侵染。

圖6 成團(tuán)泛菌PxG45與球孢白僵菌的拮抗培養(yǎng)Fig. 6 Antagonistic culture between Pantoea agglomerans PxG45 and Beauveria bassianaA: Control, 單獨(dú)接種球孢白僵菌(對(duì)照組) Control, inoculation with B. bassiana alone (control group); B: PxG45, 球孢白僵菌與PxG45拮抗培養(yǎng)(處理組) PxG45, antagonistic culture between B. bassiana and PxG45 (treatment group).

2.6 PxG45對(duì)植物病原真菌的抑制

為了探究十字花科蔬菜的病原真菌無法在小菜蛾腸道中定殖的原因是否與PxG45有關(guān),PxG45與可引起多種十字花科蔬菜炭疽病的植物病原真菌希金斯炭疽菌C.higginsianum拮抗培養(yǎng)的結(jié)果如圖7(A)所示,根據(jù)平板對(duì)峙結(jié)果統(tǒng)計(jì)所得的抑制率如表1所示。與PxG45拮抗培養(yǎng)的希金斯炭疽菌菌落直徑顯著小于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的菌落直徑(P<0.001),希金斯炭疽菌生長(zhǎng)被顯著抑制,抑制率為49.00%。

圖7 成團(tuán)泛菌PxG45與植物病原真菌的拮抗培養(yǎng)Fig. 7 Antagonistic culture between Pantoea agglomerans PxG45 and plant pathogenic fungiA: 希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum; B: 刺盤孢炭疽菌C. camelliae; C: 尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4; D: 茄鏈格孢菌Alternaria solani; E: 稻瘟病菌Magnaporthe oryzae; F: 丁香假單胞菌楊梅致病變種Pseudomonas syringae pv. myricae. Control: 單獨(dú)接種真菌Fungal inoculation alone; PxG45: 真菌與PxG45拮抗培養(yǎng)Antagonistic culture between fungi and PxG45.

結(jié)合PxG45對(duì)希金斯炭疽菌的抑菌結(jié)果,我們對(duì)PxG45是否具備廣譜性抑制植物病原真菌的能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。平板對(duì)峙結(jié)果如圖7(B-F)所示,抑制率如表1所示,PxG45對(duì)5種不同的植物病原真菌的抑菌率均在50%以上,且接種PxG45后真菌菌落直徑均顯著小于同組中未接種的(P<0.05)。其中PxG45對(duì)刺盤孢炭疽菌的抑制率為50.01%,對(duì)茄鏈格孢菌的抑制率為51.24%,對(duì)稻瘟病菌的抑制率為51.07%,對(duì)尖孢鐮刀菌古巴專化型4號(hào)生理小種的抑制率為53.11%,對(duì)丁香假單胞菌楊梅致病變種的抑制率最高,為61.56%。以上結(jié)果說明PxG45對(duì)植物病原真菌具有廣譜性抑制作用。

3 討論

成團(tuán)泛菌是昆蟲腸道中一種重要的共生細(xì)菌,已在多種昆蟲腸道中被分離(張靜宇, 2017)。本研究從小菜蛾腸道中分離純化出1株腸道細(xì)菌PxG45,通過形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育和生理生化特征鑒定(圖1, 2),確定PxG45為成團(tuán)泛菌。生測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示PxG45在體外與防腐劑效果類似,可以逆轉(zhuǎn)飼喂無防腐劑飼料導(dǎo)致的小菜蛾幼蟲死亡率高的問題(圖3)。植物來源的成團(tuán)泛菌通過編碼一種類似溶菌酶的效應(yīng)蛋白抑制環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)性細(xì)菌(Carobbietal., 2022)。我們推測(cè)PxG45通過抑制環(huán)境微生物生長(zhǎng)、延緩飼料腐敗,從而提高小菜蛾幼蟲的存活率。

盡管已在飛蝗Locustamigratoria(Tanetal., 2023)、沙漠蝗(Dillon and Charnley, 1986)等多種昆蟲中證明成團(tuán)泛菌可以影響經(jīng)體壁入侵的球孢白僵菌的殺蟲活性,但關(guān)于其在球孢白僵飼喂侵染過程中所起作用鮮有報(bào)道。與此同時(shí),多數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置條件:預(yù)先在體外混合成團(tuán)泛菌與真菌,并以兩者混合物作為侵染源,這導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能證明成團(tuán)泛菌可以在蟲體內(nèi)影響球孢白僵菌生長(zhǎng)。本研究通過提前飼喂PxG45排除球孢白僵菌在體外被抑制的可能,生測(cè)結(jié)果顯示PxG45顯著降低以飼喂方式入侵小菜蛾的球孢白僵菌的殺蟲活性,幫助宿主昆蟲抵御外來病原真菌侵染(圖4, 5)。觀察死亡小菜蛾萌發(fā)的球孢白僵菌:宿主死亡后,真菌隨體液從宿主口器、氣門和外生殖器溢出,此時(shí)無法觀察到真菌菌絲和孢子體;培養(yǎng)一段時(shí)間后可在溢出的體液附近觀察到萌發(fā)的菌絲體和孢子體。這與球孢白僵菌體壁入侵導(dǎo)致的外部癥狀區(qū)別顯著,經(jīng)體壁感染的蟲體表面直接萌發(fā)出菌絲,體表呈現(xiàn)白茸毛狀(王硯妮等, 2023),無體液外溢現(xiàn)象。綜合以上結(jié)果得出,本研究設(shè)置球孢白僵菌飼喂法可成功侵染小菜蛾,并以腸道而非體外作為成團(tuán)泛菌功能行使場(chǎng)所。

平板對(duì)峙結(jié)果顯示,與PxG45拮抗培養(yǎng)的球孢白僵菌菌落直徑顯著小于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的菌落直徑,球孢白僵菌生長(zhǎng)被顯著抑制(圖6)。這與分離自切葉蟻體壁的泛菌屬細(xì)菌體外抑真菌圈結(jié)果相同(Mattosoetal., 2012),不僅如此我們的結(jié)果具體到種水平,對(duì)泛菌屬下有抑制球孢白僵菌生長(zhǎng)作用的菌種進(jìn)行補(bǔ)充。

盡管小菜蛾以十字花科蔬菜為食,但可以感染十字花科蔬菜的病原真菌無法在小菜蛾腸道中定殖,這很可能是由于小菜蛾腸道中存在可以抑制植物病原真菌生長(zhǎng)的腸道菌。在本研究中,通過將PxG45與可引起多種十字花科蔬菜炭疽病的植物病原真菌希金斯炭疽菌拮抗培養(yǎng),結(jié)果顯示PxG45可以顯著抑制希金斯炭疽菌生長(zhǎng)(圖7: A)。已有報(bào)道表明,成團(tuán)泛菌在植食性昆蟲腸道中是保守的,影響植物病原菌在蟲體的定殖(Vorwerketal., 2007),這與本研究所得結(jié)果相似。植物內(nèi)生成團(tuán)泛菌具備廣譜抗植物病原真菌作用,其中包括分離自草莓(de Mouraetal., 2021)、辣根(Egamberdievaetal., 2020)和小麥(Thisseraetal., 2020)的。這些報(bào)道暗示成團(tuán)泛菌作為生防菌有著較大應(yīng)用前景。目前多數(shù)拮抗成團(tuán)泛菌分離自植物,來源于昆蟲的菌株鮮有報(bào)道。本研究通過增設(shè)PxG45與刺盤孢炭疽菌、尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種、茄鏈格孢菌、稻瘟病菌和丁香假單胞菌楊梅致病變種5種植物病原真菌的平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)(圖7: B-F),明確昆蟲來源的成團(tuán)泛菌PxG45具備廣譜抗真菌活性。

昆蟲腸道共生菌有著很高的應(yīng)用價(jià)值,我們的發(fā)現(xiàn)鑒定了1株可以直接抑制病原微生物生長(zhǎng)保護(hù)宿主昆蟲的小菜蛾腸道菌PxG45,并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)多種植物病原真菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。這不僅填補(bǔ)了昆蟲來源的拮抗成團(tuán)泛菌研究的空白,同時(shí)為昆蟲腸道共生菌的開發(fā)利用提供了一條以菌治菌的新思路。