健脾清化化瘀湯對幽門螺桿菌相關(guān)胃癌前病變大鼠胃黏膜miR-21、PTEN表達的影響

李一桐 汪紅兵

胃癌是臨床常見的惡性腫瘤之一。據(jù)流行病學報道,我國每年胃癌死亡病例數(shù)量超過全球胃癌死亡總病例的8.2%[1]。胃癌前病變是一種病理狀態(tài),一般包括腸上皮化生和上皮內(nèi)瘤變,主要存在于慢性萎縮性胃炎,是炎—癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。上皮內(nèi)瘤變又稱異型增生,慢性萎縮性胃炎伴異型增生是目前公認最主要的胃癌前病變。延緩胃癌前病變向胃癌進展,是減少胃癌發(fā)病率的重要手段之一。

研究發(fā)現(xiàn),miR-21作為一個致癌的miRNA,常在多種腫瘤細胞中呈異常表達,通過干擾miR-21的表達可在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長[2-3]。磷酸酯酶與張力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromosome ten,PTEN)基因作為一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌基因,已經(jīng)實驗證實為miR-21的靶基因之一[4-5]。多種研究證實,下調(diào)胃癌組織中PTEN的表達可引起磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑(phosphatidylinositol-3-kinase-protein kinase B pathway,PI3K/Akt)的激活,促進癌細胞增殖[6-7],而PTEN的上調(diào)可顯著抑制腫瘤增長[8]。miR-21、PTEN在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,可能是治療胃癌前病變,阻斷胃癌前病變向胃癌發(fā)展的潛在新靶點。

健脾清化化瘀湯是國家級名老中醫(yī)李乾構(gòu)教授的經(jīng)驗方,臨床主要用于治療幽門螺桿菌(helicobacter pylori,HP)相關(guān)性慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)伴異型增生(dysplasia,Dys)?；谡n題組前期研究結(jié)果,本實驗采用甲基-N-硝基-N亞硝基胍(MNNG)聯(lián)合HP感染、雷尼替丁、饑飽失常法建立CAG伴Dys大鼠模型,運用蘇木精—伊紅(hematoxylin and eosin staining,HE)染色、免疫組化法、RT-PCR法等方面觀察健脾清化化瘀湯對CAG伴Dys大鼠胃黏膜的影響,探討miR-21、PTEN與胃癌前病變的相關(guān)性,為中醫(yī)藥治療HP感染相關(guān)CAG黏膜異型增生提供新的方法和途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠90只,5周齡,體質(zhì)量約(150±10)g。購于北京華阜康生物科技有限公司,動物合格證號:1103221911001532,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004。于首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院研究所動物房內(nèi)屏蔽環(huán)境下進行分籠飼養(yǎng),室溫20～26℃,相對濕度40%～70%,自然晝夜節(jié)律,12小時光照和12小時黑暗循環(huán)進行。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 藥物制備

健脾清化化瘀湯組成:黨參10 g、丹參10 g、莪術(shù)15 g、白術(shù)15 g、茯苓15 g、甘草5 g、黃連5 g、大黃6 g、蒲公英20 g、白花蛇舌草20 g、三七3 g、土茯苓15 g、陳皮10 g、半夏曲10 g(生產(chǎn)廠家:北京太洋樹康藥業(yè)有限責任公司、北京杏林藥業(yè)有限責任公司,生產(chǎn)批號為18081403、18060502等)。經(jīng)標準化自動煎藥機煎煮后供實驗所用。根據(jù)《藥理實驗方法學》中規(guī)定,中藥灌胃劑量按60 kg成人劑量與大鼠體質(zhì)量比率換算法計算,以8.35g/(kg·d)作為低劑量組、16.70 g/(kg·d)作為中劑量組、33.39 g/(kg·d)作為高劑量組。

1.3 主要試劑及儀器

HP菌株(運用國際統(tǒng)一的悉尼菌株 1標準菌株,由中國疾病預(yù)防控制中心提供);雷尼替丁膠囊(東京化成工業(yè)株式會社,批號:PQR8E-HF);MNNG(日本東京化成工業(yè)株式會社,批號:2MTHL-PO);氨基胍(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號:BQFLB-PQ);SYBR Green試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:U8910);cDNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司,批號:U9116);TRIZOL裂解液(日本TAKARA BIO INC,批號:207002);PTEN一抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號:061220210104);通用二步法試劑盒(小鼠/兔增強聚合物法檢測系統(tǒng))(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號:2130D0104)。

HE半自動染色儀(德國Leica公司,AUTOSTAINERXL);輪轉(zhuǎn)切片機(德國Leica公司,RM2130);組織脫水機(德國Leica公司,TP1020);組織包埋機(德國Leica公司,EG1140H);石蠟烤片機(德國Leica公司,HI1220);分光光度計(新發(fā)現(xiàn)科技有限公司,22331);PCR擴增儀(美國ABI,8A,250VAC,SBCT);7500定量PCR儀(美國ABI,7500 Real-Time PCR);PCR熱循環(huán)儀(美國ABI,2720);細菌培養(yǎng)箱(廣州市華粵行儀器有限公司,DWS-A35)。

1.4 大鼠飼料

大鼠普通飼料購自北京華阜康生物科技有限公司。造模使用的0.03%雷尼替丁飼料由普通飼料添加0.03%鹽酸雷尼替丁制成,由北京華阜康生物科技有限公司制作。

1.5 分組與動物模型建立

90只SD大鼠,按照隨機數(shù)字表法隨機分為6組,包括正常組、模型組、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)抑制劑組、健脾清化化瘀湯高劑量組、健脾清化化瘀湯中劑量組、健脾清化化瘀湯低劑量組,每組15只。

除正常組外,其余5組每只大鼠均用HP菌液灌胃。HP菌液灌胃前,大鼠自由飲用5 mg/mL鏈霉素溶液3天,便于HP定植。灌胃前6小時,給予每只大鼠2 g/L吲哚美辛NaHCO3溶液灌胃2 mL。灌胃用HP菌液濃度1x109CFU/mL,每只大鼠灌胃2 mL。平均2次/周,共灌胃7次。第7次HP菌液灌胃結(jié)束后,給予大鼠正常食水2周,以便于HP定植,2周后對大鼠進行13C尿素呼氣實驗,以確認HP成功定植。確認大鼠HP定植成功后,除正常組外,其余5組大鼠予150 μg/mL MNNG溶液灌胃,每只大鼠每次灌胃3 mL,平均5次每周。同時予100 μg/mL MNNG溶液自由飲用(避光保存,隔天換一次),配合饑飽失常法(2天足量飼料喂養(yǎng),1天禁食不進水),5組大鼠均予0.03%雷尼替丁飼料喂養(yǎng),持續(xù)造模28周。造模第8、16、20、24、28周,分別隨機取材5只觀察胃黏膜病理改變,以評價造模情況(除取材的大鼠外,實驗過程中正常組、模型組、iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組大鼠死亡數(shù)量分別為2只、5只、4只、5只、3只、4只)。

1.6 干預(yù)及取材

造模成功后,正常組、模型組給予普通飼料及飲用水,生理鹽水灌胃,日1次;健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組給予相應(yīng)劑量中藥灌胃治療,日1次;iNOS抑制劑組給予氨基胍溶液50 mg/(kg·d)劑量進行灌胃干預(yù),日1次。干預(yù)均持續(xù)10周。

灌胃給藥10周末進行大鼠取材及標本收集。干預(yù)結(jié)束后,正常組、模型組、iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組存活大鼠的數(shù)量依次為:13只、5只、6只、5只、7只、6只。(正常組采用隨機數(shù)字表法抽取7只進行組織學檢測及分子生物學檢測)。采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠。摘離大鼠全胃取出,沿胃大彎剪開,運用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物。一部分組織固定于4%多聚甲醛內(nèi)48小時,存放于4℃冰箱,用于HE染色及免疫學檢測;另取部分胃組織置于EP管中,置于液氮中,后轉(zhuǎn)存于-80℃超低溫冰箱凍存,用于分子生物學檢測。

1.7 檢測指標

1.7.1 胃組織病理學 采用HE染色觀察,取多聚甲醛固定的胃組織,脫水透明后石蠟包埋。將蠟塊切成5 μm厚度的切片,固定于載玻片。按照常規(guī)HE染色步驟進行染色、脫水、透明、中性樹膠封片。運用光學顯微鏡觀察胃黏膜病理學變化。

1.7.2 免疫組化法 檢測胃組織PTEN蛋白表達情況。將制好的石蠟切片進行脫蠟和水化:二甲苯20分鐘(2次)、無水乙醇3分鐘(3次)、95%乙醇3分鐘(2次)、75%乙醇3分鐘(2次)、蒸餾水1分鐘,檸檬酸緩沖液中100℃水浴20分鐘,冷卻至室溫。滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10分鐘。滴加正常山羊血清封閉,37℃孵育30分鐘。加一抗,4℃冰箱孵育過夜。PBS緩沖液沖洗3次,滴加反應(yīng)增強液,室溫孵育20分鐘。滴加二抗,室溫孵育2分鐘。沖洗后滴加DAB工作液,室溫孵育4.5分鐘。洗滌后蘇木素染色20秒,沖洗。脫水、透明,中性樹膠封片,顯微鏡下閱片。

1.7.3 熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR) 檢測胃組織miR-21、PTEN mRNA的表達情況。運用Trizol法提取總RNA,測定260 nm、280 nm OD值。利用快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。以其為模板,采用SYBR Green熒光定量試劑盒進行PCR擴增反應(yīng),檢測相關(guān)基因的表達情況。以GAPDH作為PTEN的內(nèi)參基因,以U6作為miR-21的內(nèi)參基因,引物序列見表1。運用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃組織病理形態(tài)學變化比較

正常組:胃黏膜上皮細胞排列規(guī)律,腺體排列緊密整齊,呈單層柱狀上皮,細胞形態(tài)大小均一,無明顯慢性炎性細胞浸潤。模型組:胃黏膜上皮層變薄,腺體排列紊亂,固有腺體萎縮消失, 腺管結(jié)構(gòu)不規(guī)則,固有層內(nèi)可見淋巴細胞、漿細胞浸潤,局部可見細胞核異型性,細胞核固縮深染,部分可見局灶性腸上皮杯狀細胞。iNOS抑制劑組:胃黏膜上皮層變薄,腺體萎縮,腺體排列尚規(guī)則,但仍會出現(xiàn)紊亂狀態(tài),形狀不規(guī)則,局部可見少量杯狀細胞,固有層可見炎性細胞浸潤,總體較模型組減輕。健脾清化化瘀湯低劑量組:胃黏膜上皮層變薄,固有腺體萎縮,排列紊亂,結(jié)構(gòu)不規(guī)則,固有層可見淋巴細胞浸潤,間質(zhì)少量紅細胞,可見杯狀細胞及核深染,總體較模型組稍有減輕,但好轉(zhuǎn)不明顯。健脾清化化瘀湯中劑量組:胃黏膜腺體排列較為規(guī)律,腺體輕度萎縮或無明顯萎縮,胃小凹完整,腺上皮和腺管分界較清,黏膜淺層炎性細胞浸潤,固有層可見散在淋巴細胞,細胞形態(tài)較均一,總體改善最佳。健脾清化化瘀湯高劑量組:黏膜炎癥較模型組及中藥低劑量組輕,較中藥中劑量組重,腺體排列尚規(guī)律,可見中性粒細胞浸潤,鏡下可見胃黏膜組織充血水腫,細胞形態(tài)較為均一,較少見杯狀細胞及異型增生。見圖1。

注:A 正常組;B 模型組;C iNOS抑制劑組;D 健脾清化化瘀湯低劑量組;E 健脾清化化瘀湯中劑量組;F 健脾清化化瘀湯高劑量組。

2.2 各組大鼠胃組織PTEN蛋白表達

免疫組化法檢測大鼠胃組織PTEN蛋白表達及平均光密度值(累積光密度/面積,IOD/Area),結(jié)果顯示,正常組的PTEN染色較深,表現(xiàn)為深棕色,蛋白表達水平明顯較高;模型組PTEN染色淺,鮮少著色,PTEN蛋白較少表達;iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯低、中、高劑量組PTEN染色介于正常組與模型組之間,陽性表達較正常組少(見圖2)。運用Image-Pro Plus 6.0計算PTEN免疫組化的平均光密度值。結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組PTEN蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組比較,iNOS抑制劑及中藥的干預(yù)對PTEN蛋白表達有一定的逆轉(zhuǎn)作用,健脾清化化瘀湯高劑量組PTEN蛋白表達上調(diào)(P<0.05),健脾清化化瘀湯中劑量組、iNOS抑制劑組PTEN蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀湯低劑量組PTEN蛋白表達上調(diào)不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

注:A 正常組;B 模型組;C iNOS抑制劑組;D 健脾清化化瘀湯低劑量組;E 健脾清化化瘀湯中劑量組;F 健脾清化化瘀湯高劑量組。

表2 各組大鼠PTEN平均光密度值檢測結(jié)果比較

2.3 各組大鼠miR-21 mRNA表達比較

RT-PCR結(jié)果顯示,各組大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常組相比,模型組胃黏膜中miR-21 mRNA表達顯著升高(P<0.05);與模型組相比,iNOS抑制劑及中藥的干預(yù)對CAG伴Dys大鼠胃黏膜miR-21 mRNA的低表達有顯著逆轉(zhuǎn)趨勢,健脾清化化瘀湯高劑量組miR-21 mRNA表達下調(diào)(P<0.05),iNOS抑制劑組、健脾清化化瘀湯中劑量組miR-21 mRNA表達顯著低于模型組(P<0.05;P<0.05),而健脾清化化瘀湯低劑量組miR-21 mRNA表達相對模型組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠胃黏膜miR-21 mRNA表達比較

2.4 各組大鼠PTEN mRNA表達比較

RT-PCR結(jié)果顯示,各組大鼠胃黏膜組織PTEN mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與正常組相比,模型組胃黏膜中PTEN mRNA表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,iNOS抑制劑及中藥的干預(yù)對CAG伴Dys大鼠胃黏膜PTEN mRNA的低表達有逆轉(zhuǎn)趨勢,健脾清化化瘀湯高劑量組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達高于模型組(P<0.05),健脾清化化瘀湯中劑量組、iNOS抑制劑組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達顯著高于模型組(P<0.05;P<0.05),健脾清化化瘀湯低劑量組大鼠胃黏膜PTEN基因表達與模型組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠胃黏膜PTEN mRNA表達比較

3 討論

CAG伴Dys臨床癥狀主要表現(xiàn)為胃脘痞滿、胃脘痛、呃逆噯氣、食欲不振等。中醫(yī)對于CAG伴Dys尚無確切病名,根據(jù)臨床癥狀大致可歸屬于“痞滿”“胃脘痛”范疇。李乾構(gòu)認為,本病病機以脾胃氣虛為本,以痰、瘀、毒為標。而HP感染導致的CAG伴Dys又多兼夾濕熱。故本病的治療應(yīng)以健脾益氣、清熱化濕、活血化瘀為主要治則[9]。健脾清化化瘀湯首以四君子湯健脾益氣,充實脾土為先,使脾胃運化功能恢復正常。脾胃為氣血生化之源,中氣健旺,氣血方能生化無窮。另取黃連、大黃及土茯苓清化濕熱,陳皮、半夏曲燥濕化痰,消痞散結(jié),莪術(shù)、三七、丹參活血化瘀、軟堅散結(jié),蒲公英、白花蛇舌草清熱解毒化濕,能消除胃粘膜慢性炎癥,蒲公英、白花舌蛇草、三七、土茯苓清瘀熱,化濕毒,具有較強的抗HP作用。諸藥配伍具有攻補兼施、扶正祛邪的作用。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[10],健脾清化湯(組成包括黨參、茯苓、白術(shù)、大黃、黃連、蒲公英、甘草、丹參)對HP相關(guān)胃炎SD大鼠具有一定的治療作用,其機制可能與上調(diào)熱激蛋白70的表達,進而抑制核因子-κB的表達以減輕炎癥反應(yīng)有關(guān),另外,熱激蛋白70可能通過抑制胃黏膜iNOS及一氧化氮產(chǎn)生,保護胃黏膜,減輕胃黏膜損傷。通過對耐藥HP菌株的體外研究表明[11],健脾清化湯可抑制甲硝唑耐藥幽門螺旋桿菌的生長。進一步運用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),健脾清化湯可能通過抑制甲硝唑耐藥HP菌株外排基因hefA、hefC的表達,從而發(fā)揮抗耐藥HP的作用。健脾清化化瘀湯由健脾清化湯加減化裁而成,用于治療CAG伴Dys具有一定的臨床療效,但其機制有待明確。

本實驗通過MNNG聯(lián)合HP感染、雷尼替丁、饑飽失常方法造模CAG伴Dys大鼠模型。選擇氨基胍作為陽性對照藥物,可抑制iNOS活性,進而降低胃黏膜一氧化氮含量,一方面可減輕炎癥反應(yīng),一方面可減弱iNOS對miR-21表達的促進作用[12]。實驗結(jié)果顯示,給予干預(yù)治療10周后,健脾清化化瘀湯高、中劑量組、iNOS組較模型組有不同程度改善,HE染色鏡下可見腺體排列相對規(guī)則,腺體數(shù)目尚可,腸上皮化生及異型增生較少見,胃黏膜病變逐漸有好轉(zhuǎn)趨勢。健脾清化化瘀湯低劑量組胃黏膜好轉(zhuǎn)不明顯。說明健脾清化化瘀湯及iNOS抑制劑可改善CAG伴Dys大鼠胃黏膜情況,結(jié)合中藥組各組大鼠胃黏膜變化情況,認為健脾清化化瘀湯中劑量組改善效果最明顯。

研究表明,miR-21可通過調(diào)節(jié)多種靶基因調(diào)控PI3K/Akt信號通路,進而參與細胞增殖、侵襲、凋亡、壞死和血管生成[13]。PI3K產(chǎn)生的第二信使可參與細胞增殖、運動等多種細胞活動[14]。Akt作為PI3K的下游因子,也可參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、凋亡等細胞功能[15-16]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn),伊馬替尼在治療急性淋巴細胞白血病時產(chǎn)生耐藥性的分子機制為miR-21的上調(diào)使PTEN基因表達下調(diào),進一步阻斷了PI3K/Akt信號通路,從而抑制了伊馬替尼引起的細胞凋亡。當在Sup-b15細胞中聯(lián)合使用伊馬替尼及miR-21抑制劑時發(fā)現(xiàn),PTEN表達的增加可阻斷PI3K/Akt信號通路從而促進細胞凋亡。PDCD4在腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。Zhang等[18]的研究發(fā)現(xiàn),在乳頭狀甲狀腺癌細胞系TPC-1中,上調(diào)miR-21的表達可減少PDCD4蛋白生成,并激活PI3K/Akt信號通路,從而抑制細胞的凋亡,提高細胞的增殖與侵襲。本項實驗結(jié)果顯示,在干預(yù)治療后模型組miR-21表達最高,與正常組有顯著差異,這與相關(guān)文獻中論述的miR-21在胃癌組織及胃癌前病變胃組織的高表達相吻合。經(jīng)過健脾清化化瘀湯治療后,中、高劑量組大鼠胃組織miR-21表達比模型組降低(P<0.05),說明健脾清化化瘀湯可顯著抑制miR-21的表達。與正常組相比,模型組PTEN mRNA及蛋白表達顯著降低,說明在CAG伴Dys階段PTEN表達出現(xiàn)下調(diào)。經(jīng)過健脾清化化瘀湯治療后,中藥中、高劑量組大鼠胃組織PTEN在mRNA及蛋白層面表達量均明顯升高。結(jié)合國內(nèi)外文獻報道,miR-21對抑癌基因PTEN的調(diào)控已受到廣泛認可。由本實驗結(jié)果可進一步推測,健脾清化化瘀湯可能通過下調(diào)miR-21表達,減輕對抑癌基因PTEN表達的抑制,使PTEN表達上調(diào),并進一步激活PTEN下游信號通路,達到逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用。另外,中藥中、高劑量組效果明顯優(yōu)于低劑量組,這一情況表明健脾清化化瘀湯對于CAG伴Dys的療效與藥物濃度存在一定關(guān)系。

考慮胃癌前病變的形成是多因素、多階段參與的過程,且單因素造模周期較長、造模成功率低,本實驗運用以MNNG為主的綜合多因素造模的方法進行CAG伴Dys大鼠造模。MNNG是一種化學致癌劑,是目前建立CAG、CAG伴胃黏膜腸化生、CAG伴Dys及胃癌大鼠模型的公認用藥。MNNG可直接作用于胃黏膜使細胞DNA改變從而發(fā)生癌變。而對于MNNG使用劑量的掌握,國內(nèi)外文獻尚無公認定論。本實驗選用150 μg/mL MNNG溶液灌胃配合100 μg/mL MNNG溶液自由飲用進行造模,并由HE染色確認經(jīng)造模大鼠胃黏膜上皮病變與胃癌前病變一致,最終成功建立胃癌前病變大鼠模型。但實驗期間大鼠死亡率較高,考慮可能由于大劑量MNNG導致消化道損傷,進而引起大鼠胃腸道脹氣,影響飲食飲水,造成大鼠死亡。此外,饑飽失常法與MNNG法聯(lián)合,大鼠空腹飲用MNNG,增加了對腸道黏膜的刺激,引起腸道腫瘤的形成,也可能是大鼠死亡率高的原因之一。如何建立造模周期短、模型穩(wěn)定的胃癌前病變大鼠模型尚需進一步探索。

綜上所述,健脾清化化瘀湯可能通過直接或間接下調(diào)胃黏膜miR-21的表達,解除miR-21對抑癌基因PTEN表達的抑制,提高PTEN的表達,進一步調(diào)控PTEN下游信號通路,從而達到控制胃癌前病變向胃癌進展的作用。本實驗從健脾清化化瘀立論,并將miR-21與胃癌前病變相聯(lián)系,為中醫(yī)藥治療Hp感染相關(guān)CAG黏膜異型增生提供新的方法和途徑,也為健脾清化化瘀湯安全可靠地用于臨床提供實驗依據(jù)。本次實驗未進一步探究PTEN下游信號通路,猜測其作用機制可能與PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān),這一方面仍需進一步深入探究。