靈芝菌絲水提物活性成分分析研究

孫國(guó)強(qiáng) 董金穎 曹發(fā)昊

（1 山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運(yùn)城 044000；2 運(yùn)城學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000）

靈芝Ganoderma lucidum，自古就是名貴的藥用真菌[1-2]，含有多糖類、三萜類、甾醇類、核苷類、氨基酸、多肽及多種微量元素，具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝、提高機(jī)體耐缺氧能力等作用[3-8]。2000 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定，赤芝、紫芝子實(shí)體為藥材來源[9]。市場(chǎng)上以靈芝子實(shí)體或孢子為原料的保健食品較多，但不管是野生還是人工栽培的靈芝都極易受自然條件限制，產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)大，生產(chǎn)規(guī)模遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求[10］。近年來，采用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝菌絲，實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；慨a(chǎn)，可有效解決以上問題[11]。研究表明，靈芝菌絲與子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)成分十分相似，對(duì)人體同樣有藥用作用[12]。

國(guó)內(nèi)外針對(duì)靈芝子實(shí)體及其孢子的成分、含量研究較多[2，3，6，9-10]，但對(duì)靈芝菌絲的相關(guān)研究報(bào)道卻較少[5-11]，且目前尚無較全面的靈芝菌絲水提物活性成分分析數(shù)據(jù)，限制了靈芝菌絲水提物活性成分產(chǎn)品開發(fā)。因此，筆者較系統(tǒng)地分析研究靈芝菌絲水提物的多糖、三萜、甾醇、靈芝酸、腺苷、氨基酸、微量元素、農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素的含量，以期為其作為食品新資源提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）靈芝菌絲水提物：靈芝菌絲水提物是由山西瑞芝生物科技有限公司的靈芝深層液態(tài)培養(yǎng)物經(jīng)過濾，水洗得靈芝菌絲，再按料液比1∶8用水煎煮提取2次，混合提取液即得。

（2）主要儀器：UV2550 紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津株式會(huì)社），DK615HTD超聲波清洗器（深圳市得康科技有限公司），Agilent1260 高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司），DHG9620A 電熱鼓風(fēng)恒溫箱（深圳市愛特爾電子科技有限公司），BP211D電子天平（德國(guó)賽多利斯集團(tuán)），AL204電子天平（梅特勒托利多科技中國(guó)有限公司），HHS4 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海致金儀器設(shè)備有限公司），EXPEC510 減壓平行濃縮儀（杭州譜育科技發(fā)展有限公司），GILSON GX274 全自動(dòng)固相萃取儀（美國(guó)吉爾森公司），XT-9 900 A 微波消解儀（上海新拓分析儀器科技有限公司），AA220 原子吸收分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司），300MS 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)瓦里安公司），UPLC-TQD液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)沃特斯公司）。

（3）主要試劑：無水葡萄糖、齊墩果酸、靈芝酸A、D、F、G 和腺苷（均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院）；硫酸、蒽酮、乙醇、甲醇、香草醛、冰醋酸、高氯酸、乙腈、甲酸、鹽酸、硝酸、苯酚、無水乙醇、濃硫酸、二水合磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉（均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖、三萜及甾醇測(cè)定

多糖測(cè)定采用蒽酮-硫酸法，三萜及甾醇測(cè)定采用香草醛-高氯酸法，方法依據(jù)參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.2 靈芝酸及腺苷測(cè)定

按文獻(xiàn)[14]方法分析靈芝酸、腺苷。

試樣制備：將靈芝菌絲水提物濃縮干制后，精密稱取粉末1.025 4 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL 溶解，超聲處理40 min，搖勻抽濾，收集濾液，藥渣再次加10 mL 甲醇，超聲處理40 min，抽濾。收集合并兩次濾液，旋干，用色譜級(jí)甲醇定容至10 mL，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取靈芝酸A、D、F、G和腺苷各 1.10 mg、1.06 mg、0.95 mg、1.11 mg、1.03 mg 于一離心管中，加入1 mL 色譜級(jí)甲醇，超聲溶解，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得對(duì)照品溶液。

測(cè)定條件：色譜柱為JADE-PAK?ODS-AQ（5 μm，250×4.6 mm），流動(dòng)相為乙腈（A）：0.1%甲酸水（B）。

表1 梯度洗脫條件

1.2.3 氨基酸組成測(cè)定

按文獻(xiàn)[15]方法分析氨基酸組成。

1.2.4 微量元素分析

按文獻(xiàn)[16]第一法電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）分析微量元素。

樣品處理方法：將靈芝菌絲水提物濃縮干制后，稱取0.3 g 樣品，于微波消解罐中，加入5 mL 純硝酸，搖勻，放入微波消解儀中，按微波消解程序進(jìn)行消解（表2）。消解完成后，將消解罐轉(zhuǎn)移至電熱板上趕酸，趕酸至近干，加水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。

表2 微波消解程序

1.2.5 農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素測(cè)定

按文獻(xiàn)[17]2341 農(nóng)藥殘留量測(cè)定法項(xiàng)下第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農(nóng)藥殘留測(cè)定法，2351真菌毒素測(cè)定法項(xiàng)下黃曲霉毒素測(cè)定法，分析33種禁用農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌絲水提物多糖、三萜及甾醇含量

由表3可以看出，靈芝菌絲水提物與子實(shí)體、菌絲體一樣含有多糖、三萜及甾醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.43%、0.18%。

表3 靈芝菌絲水提物中多糖、三萜及甾醇含量

2.2 靈芝菌絲水提物靈芝酸及腺苷含量

由表4 可以看出，靈芝菌絲水提取中含有靈芝酸A、D、F、G 以及腺苷，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g、42.1 μg/g。

表4 靈芝菌絲水提物中靈芝酸及腺苷含量 單位：μg/g

2.3 靈芝菌絲水提物氨基酸及含量

由表5 可以看出，靈芝菌絲水提物中氨基酸種類豐富，含有除色氨酸外的7 種人體必需氨基酸在內(nèi)的16種常見氨基酸，其中含量較多的氨基酸依次為谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.88 g/100 g、1.78 g/100 g、1.15 g/100 g，這些氨基酸為其主要氨基酸。靈芝菌絲水提物中氨基酸總量達(dá)13.70 g/100 g，必需氨基酸總量、支鏈氨基酸總量和芳香族氨基酸總量分別占氨基酸總量的31.02%、15.77%、8.25%。靈芝菌絲水提物中含有高量支鏈氨基酸和低量芳香族氨基酸，可利用這種特殊的氨基酸模式開發(fā)產(chǎn)品[18]。

表5 靈芝菌絲水提物中氨基酸及含量 單位：g/100 g

2.4 靈芝菌絲水提物微量元素含量

由表6 可以看出，靈芝菌絲水提物中含有鉀、鈣、鎂、鐵、錳、鋅、銅等7 種人體必須微量元素在內(nèi)的12種微量元素，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育等起著重要作用。靈芝菌絲水提物具有高鉀低鈉的特點(diǎn)，其中鉀的含量最多，質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)2 342 mg/kg，還含有豐富的鎂（541 mg/kg）和鈣（193 mg/kg），以及0.15 mg/kg的硒。

表6 靈芝菌絲水提物中微量元素含量 單位：mg/kg

2.5 靈芝菌絲水提物農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素分析結(jié)果

為了確保靈芝菌絲水提物的安全無毒，按照《中國(guó)藥典》2020年版四部“0212藥材和飲片檢定通則”檢測(cè)甲胺磷、久效磷、磷胺、苯線磷、地蟲硫磷、六六六、滴滴涕、除草醚、殺蟲脒等33種禁用農(nóng)藥殘留及黃曲霉毒素，詳見表7。

由表7 可以看出，靈芝菌絲水提物的33 種禁用農(nóng)藥殘留和黃曲霉毒素均未檢出，證實(shí)其安全無毒，具備開發(fā)成食品新資源的前提條件。

3 小結(jié)與討論

靈芝子實(shí)體、孢子、菌絲體因含有多種類似的有效成分，如多糖、三萜、氨基酸和微量元素，已被應(yīng)用于開發(fā)藥品、保健食品、特醫(yī)食品等[3-8]。當(dāng)前靈芝正作為一種重要的藥食同源物質(zhì)按照國(guó)家衛(wèi)生健康委、國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局聯(lián)合發(fā)布的《關(guān)于對(duì)黨參等9種物質(zhì)開展按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材的物質(zhì)管理試點(diǎn)工作的通知》在福建、廣東、廣西、江蘇等十幾個(gè)省開展試點(diǎn)工作。

研究結(jié)果表明，靈芝菌絲水提物未檢測(cè)到33種禁用農(nóng)藥殘留和黃曲霉毒素，含有0.43%多糖和0.18%三萜及甾醇；靈芝酸A、D、F、G 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.2 μg/g、6.9 μg/g、32.0 μg/g、12.6 μg/g，腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為42.1 μg/g；含有7 種人體必需氨基酸在內(nèi)的16 種常見氨基酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的氨基酸依次為谷氨酸（1.88 g/100 g）、天冬氨酸（1.78 g/100 g）、精氨酸（1.15 g/100 g），氨基酸總量達(dá)13.7 g/100 g；含有7 種人體不可缺的微量元素在內(nèi)的12種微量元素，其中鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)2 342 mg/kg，含有豐富的鎂（541 mg/kg）和鈣（193 mg/kg），還含有0.15 mg/kg 的硒。靈芝菌絲水提物含有的多種生物活性成分與子實(shí)體和菌絲保持一致，表明其能被用于藥品、保健食品、食品等領(lǐng)域，還可作為一種天然營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。

研究較全面地分析靈芝菌絲水提物的活性成分，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為其進(jìn)一步開發(fā)提供理論支撐，對(duì)推動(dòng)靈芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有深遠(yuǎn)意義。