基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益氣祛風(fēng)方治療糖尿病腎病作用機(jī)制*

朱荔煒，王春國(guó)，洑曉哲，黃為鈞，李瀟然，趙進(jìn)喜

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029）

糖尿病腎病（DN）是糖尿?。―M）最常見的微血管并發(fā)癥之一，目前已成為全球引起終末期腎臟病的主要原因[1]。發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，探索中醫(yī)藥方法治療DN 十分必要。

DN 屬于“消渴病”并發(fā)“水腫”“關(guān)格”等疾病范疇。趙進(jìn)喜教授在繼承國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授關(guān)于DM 微血管并發(fā)癥“微型癥瘕形成”理論的基礎(chǔ)上，通過(guò)臨床實(shí)踐與證候?qū)W研究，發(fā)現(xiàn)絡(luò)脈“微型癥瘕”形成的過(guò)程中，“風(fēng)邪”亦為導(dǎo)致DN 進(jìn)展的另一重要致病因素，因此提出“腎絡(luò)伏風(fēng)”致病假說(shuō)。在此基礎(chǔ)上繼承前人臨床經(jīng)驗(yàn)和學(xué)術(shù)思想，提出“從風(fēng)論治”DN 的治療思路[2-4]，在臨床應(yīng)用中取得良好療效。代表方劑益氣祛風(fēng)方具有益氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，既往研究發(fā)現(xiàn)該治法具有一定的降低蛋白尿、延緩腎小球纖維化的作用，其機(jī)制與調(diào)控胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、P38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[5-8]。由于中藥作為天然產(chǎn)物，活性成分復(fù)雜，干預(yù)DN 的機(jī)制往往是多靶點(diǎn)、多途徑的，因此益氣祛風(fēng)方減少蛋白尿、延緩DN 病程進(jìn)展的機(jī)制仍待進(jìn)一步完善。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合多學(xué)科理論和技術(shù)，其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀念原則一致，可用于研究中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[9]。本研究采用超高效液相色譜-四級(jí)桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS）技術(shù)對(duì)益氣祛風(fēng)方中主要化學(xué)成分進(jìn)行快速分析，基于實(shí)測(cè)化學(xué)成分采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和功能分析，通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)判斷受體-配體結(jié)合度，探討本方的藥效物質(zhì)和作用機(jī)制，為DN 的中醫(yī)藥臨床治療和益氣祛風(fēng)方的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS：配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 4．2 化學(xué)工作站（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Vanquish 超高效液相色譜系統(tǒng)：含二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，DAD 檢測(cè)器（美國(guó)Thermo Scientific 公司）。Millipore Synergy UV 型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore 公司）；KH5200E 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；十萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

益氣祛風(fēng)方藥物生黃芪（批號(hào)：20102201）、穿山龍（批號(hào)：00251101）、炒牛蒡子（批號(hào)：2008062）、蟬蛻（批號(hào)：20092401）、鬼箭羽（批號(hào)：19090504）和燙水蛭（批號(hào)：20072001）飲片均購(gòu)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院藥房。甲酸、甲醇、乙腈等試劑均為質(zhì)譜純（美國(guó)Fisher 公司）。白細(xì)胞介素（IL）-1β（SC-52012）、趨化因子配體5（CCL5）（SC-365826）、核因子-κB（NF-κB）（SC-8414）購(gòu)于Santa Cruz；IL-6（bs-0782R）、β-actin（bs-0061R）購(gòu)于Bioss；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗鼠免疫球蛋白g（IgG）（SA00001-1）、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（SA00001-2）購(gòu)于Proteintech。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 周齡SPF 級(jí)雄性db/db 小鼠及db/m 小鼠，初始平均體質(zhì)量25 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pub chem．ncbi．nlm．nih．gov/）；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（https：//tcmspw．com/tcmsp． php）；SwissADME（http：//www．swissadme．ch//）；Swiss Target Prediction（http：//www．swisstargetprediction．ch/）；人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//www．omim．org/）；人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards，https：//www．genecards．org/）；STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db．org/）；Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape．org/）；RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www．rcsb．org）；AlphaFold 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//alphafold．ebi．a(chǎn)c．uk/）；Cytoscape 3．9．1 軟件（https：//cytoscape．org/）；CB Dock 平臺(tái)（http：//clab．labshare．cn/cb-dock/php/index．php）；微生信在線平臺(tái)（http：//www．bioinformatics．com．cn/）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 益氣祛風(fēng)方配方比例為生黃芪∶穿山龍∶牛蒡子∶蟬蛻∶鬼箭羽∶水蛭=10∶10∶5∶4∶4∶1，加10 倍量水煎煮2 次，每次1 h，合并濾液，濃縮和真空干燥（70 ℃，真空度為0．08 MPa），提取得率為19．66%。粉碎，過(guò)60 目篩，即得中藥干膏。取粉末約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，超聲提取30 min，放冷，搖勻，離心，取上清液過(guò)0．22 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件 色譜柱：AQUITY UPLC BEH C18柱（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；流動(dòng)相：0．1%甲酸水溶液（A），乙腈溶液（B）；梯度洗脫條件：0～3 min（5%～5%B），3～45 min（5%～75%B），45～45．1 min（75%～5%B），45．1～50 min（5%～5%B）；流速：0．3 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL；柱溫：35 ℃。

2.3 質(zhì)譜條件 正離子檢出模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350 ℃，噴霧電壓3．5 KV，S-Lens RF電壓60 V，毛細(xì)管溫度300 ℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌龋?9．99%），鞘氣流速：40 arb，輔助氣流速流速：20 arb；負(fù)離子檢出模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350 ℃，電離源電壓3．2 KV，S-Lens RF 電壓60 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)猓兌龋?9．99%），鞘氣流速：35 arb，輔助氣流速流速：10 arb。

掃描模式：一級(jí)全掃描（Full Scan，m/z 100-2 000）與數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（data-dependent acquisistion）ddMS2；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD），碰撞能量：NEC30，Stepped NEC50%。

2.4 化學(xué)成分的鑒定及其活性成分的篩選 通過(guò)Xcalibur 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，經(jīng)與自建數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普網(wǎng)及PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并構(gòu)建益氣祛風(fēng)方原藥材相關(guān)化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，在Compound Discoverer 3．1 軟件檢索在線及構(gòu)建的化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，并比對(duì)精確相對(duì)分子質(zhì)量，根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的保留時(shí)間及二級(jí)碎片離子信息進(jìn)行確證。

2.5 藥物活性成分靶點(diǎn)篩選、DN 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將上一步藥物質(zhì)譜分析得到的成分逐一輸入PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得分子結(jié)構(gòu)并以*．sdf 格式保存。將*．sdf 格式文件上傳至Swiss ADME 平臺(tái)，使用TCMSP 平臺(tái)進(jìn)行補(bǔ)充，獲得吸收度及類藥性等相關(guān)參數(shù)，篩選吸收度高、類藥性好的成分。將篩選后成分的*．sdf 格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)，設(shè)置屬性為“Homo sapiens”，收集預(yù)測(cè)到的所有靶點(diǎn)，同時(shí)在TCMIP、HERB 等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索成分名稱，補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，整合后得到藥物活性成分靶點(diǎn)庫(kù)。以“Diabetic Nephropathies”為關(guān)鍵詞在Gene Card 數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，將搜索結(jié)果整合去重獲得DN 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)庫(kù)。通過(guò)R 語(yǔ)言將藥物活性腳本和疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到藥物-疾病交集靶點(diǎn)。

2.6 核心靶點(diǎn)篩選及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 平臺(tái)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值為“Highest confidence（0．90）”，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。將該網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3．9．1 軟件，使用“Analyze Network”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，利用連接度（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）3 個(gè)拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行篩選，獲得核心基因靶點(diǎn)。

2.7 基因本體（GO）功能分析及京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)核心靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 功能分析和KEGG通路富集分析，物種為“Homo sapiens”，設(shè)定P＜0．01，分析益氣祛風(fēng)方的治療DN 涉及的生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）、細(xì)胞組成（CC）和通路，根據(jù)富集基因數(shù)目由多到少進(jìn)行降序排列，利用微生信平臺(tái)對(duì)位居前列的生物學(xué)過(guò)程和通路繪制GO 功能富集分析柱狀圖和KEGG 通路富集分析氣泡圖。

2.8 益氣祛風(fēng)方主要成分篩選與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接 2．6 中形成PPI 靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的成分即為主要成分。從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)或AlphaFold 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心靶點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)，與2．5 中獲得的活性成分的sdf式，通過(guò)CB Dock 進(jìn)行分子對(duì)接[10]，分析結(jié)合能。結(jié)合能體現(xiàn)兩者能否形成穩(wěn)定對(duì)接結(jié)構(gòu)，故如結(jié)合能＜-5 kcal/mol 則說(shuō)明結(jié)合構(gòu)象相對(duì)穩(wěn)定。

2.9 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 db/db 小鼠普通飼料無(wú)干預(yù)適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，自由攝食飲水。2 周后，禁食不禁水6 h 后測(cè)定小鼠空腹尾尖血糖，≥16．7 mmol/L 為造模成功，隨機(jī)分為模型組、益氣祛風(fēng)方組，db/m 小鼠為空白組，每組6 只。db/db 小鼠給藥劑量換算后灌胃益氣祛風(fēng)方干膏粉3．04 g/（kg·d），db/m 小鼠灌胃等量生理鹽水，共干預(yù)8 周。提取腎組織總蛋白進(jìn)行Western Blotting，加入冰盒控制電轉(zhuǎn)溫度，將轉(zhuǎn)好的PVDF 膜于慢搖床上用5%的脫脂牛奶封閉1 h。稀釋一抗IL-1β（1∶300）、CCL5（1∶300）、NF-κB（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃封閉過(guò)夜。TBST 清洗5 次，每次5 min，室溫孵育二抗90 min，TBST 清洗5 次。ECL 顯色液激發(fā)PVDF 膜1 min，進(jìn)行曝光、顯影、拍照，使用ImageJ 分析灰度值以反映不同組別間蛋白表達(dá)量。使用GraphPad Prism 9 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0．05 為差異性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0．05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 益氣祛風(fēng)方活性成分分析及篩選 從益氣祛風(fēng)方中共鑒定出115 個(gè)化學(xué)成分，總離子流圖見圖1，鑒定信息見開放科學(xué)計(jì)劃（OSID）二維碼。通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得所有成分的CID、Canonical SMILES 及分子結(jié)構(gòu)文件（*．sdf），導(dǎo)入Swiss ADME平臺(tái)，在結(jié)果中篩選GI absorption 為“High”（即消化道吸收度高），用于篩選口服生物利用度較好的活性化合物；篩選Druglikeness 預(yù)測(cè)中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge5 項(xiàng)有2 項(xiàng)或2 項(xiàng)以上為“Yes”的化合物，選擇具有較好類藥性的化合物，共得到滿足條件的活性成分66 個(gè)。在TCMSP 中檢索GI absorption 為“Low”（即消化道吸收度低）的成分，補(bǔ)充牛蒡子苷（Arctiin，OB 34．45%，DL 0．84）及香蜂草苷（Didymin，OB 38．55%，DL 0．24）。根據(jù)文獻(xiàn)補(bǔ)充黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ[11]、山奈苷[12]、柳穿魚黃素[13]、京尼平苷[14]、纖細(xì)薯蕷皂苷[15]、粗糠柴苦素[16]及大豆皂苷Ⅰ[17]。這些成分雖然消化道吸收度低，但有文獻(xiàn)報(bào)道其通過(guò)口服途徑取效，故納入后續(xù)分析。共篩選得到76 個(gè)成分。

圖1 益氣祛風(fēng)方中UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鑒定的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Yiqi Qufeng Formula by UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS

3.2 益氣祛風(fēng)方治療DN 的潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將上一步篩選得到的76 個(gè)成分SDF 格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction 平臺(tái)，同時(shí)使用TCMIP、HERB 平臺(tái)檢索化合物名稱補(bǔ)充靶點(diǎn)，整合預(yù)測(cè)結(jié)果，共預(yù)測(cè)到作用靶點(diǎn)5 064 個(gè)。根據(jù)預(yù)測(cè)所得靶點(diǎn)的“Probability”值，取中位數(shù)（0．111 5）以上的靶點(diǎn)共2 688 個(gè)，去重后共得到作用靶點(diǎn)615 個(gè)。

通過(guò)Gene Cards 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)，結(jié)合OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充，合并后刪除重復(fù)值，得到相關(guān)靶點(diǎn)4 911 個(gè)。篩選“Relevance score”為中位數(shù)（3．549 8）以上的靶點(diǎn)，最終得到DN 相關(guān)靶點(diǎn)共2 025 個(gè)。將活性成分作用靶點(diǎn)與DN 相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得益氣祛風(fēng)方治療DN 的潛在靶點(diǎn)266 個(gè)，并使用R 語(yǔ)言繪制韋恩圖，見圖2。

圖2 益氣祛風(fēng)方治療DN 的潛在作用靶點(diǎn)Fig.2 Potential targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

3.3 益氣祛風(fēng)方治療DN 的主要成分及核心靶點(diǎn)篩選 將266 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)輸入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置最小相互作用閾值為“Highest confidence（0．90）”并隱藏游離節(jié)點(diǎn)后，保留227 個(gè)靶點(diǎn)，1 133 條連線，average node degree=8．52，PPI enrichment Pvalue＜1．0e-16，得到潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。這227 個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分即為主要成分，部分成分信息見表2。將該蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3．9．1，選擇介數(shù)中心性、接近中心性、連接度均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)，即介數(shù)中心性≥0．010 525 717、接近中心性≥0．412 322 275、連接度≥6，篩選得到78 個(gè)靶點(diǎn)，即為益氣祛風(fēng)方治療DN 的核心靶點(diǎn)。3 個(gè)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)中，介數(shù)中心性表示點(diǎn)在其他點(diǎn)之間的中介調(diào)節(jié)效應(yīng)，數(shù)值越大表明網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間的聯(lián)系經(jīng)過(guò)該點(diǎn)次數(shù)越多；接近中心性表示點(diǎn)在復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的價(jià)值，數(shù)值越大表明點(diǎn)越在中心位置；連接度則強(qiáng)調(diào)節(jié)點(diǎn)單獨(dú)的價(jià)值[18]。以介數(shù)中心性為主，接近中心性、連接度為次進(jìn)行排序，見表3、圖4。

表2 益氣祛風(fēng)方治療DN 的部分主要成分Tab.2 Parts of the active components of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

表3 益氣祛風(fēng)方排名前20 的核心靶點(diǎn)拓?fù)湫畔ab.3 Topological information of the top 20 core targets of Yiqi Qufeng Formula

圖3 益氣祛風(fēng)方治療DN 潛在作用靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network of the potential targets of YQQF in the treatment of DN

圖4 益氣祛風(fēng)方治療DN 核心靶點(diǎn)互作圖Fig.4 Interaction diagram of the core targets of Yiqi Qufeng Formula in the treatment of DN

圓形越大BC 越大，顏色越深CC 越大，連線越深CombineScore 越高，核心靶點(diǎn)以外的節(jié)點(diǎn)已隱藏。

3.4 核心靶點(diǎn)的GO 功能與KEGG 通路富集分析 將78 個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析。GO 富集分析共得到223 個(gè)BP 相關(guān)條目，包括response to hormone（對(duì)激素的反應(yīng)）、protein phosphorylation（蛋白質(zhì)的磷酸化）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway（跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路）、positive regulation of cell migration（細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)） 與regulation of defense response（防御反應(yīng)的調(diào)節(jié)）等。74 個(gè)CC 相關(guān)條目，包括membrane raft（膜筏）、receptor complex（受體復(fù)合物）、perinuclear region of cytoplasm（細(xì)胞質(zhì)的核周圍區(qū)域）等。84 個(gè)MF 相關(guān)條目，包括protein kinase activity（蛋白激酶活性）、phosphatase binding（磷酸酶結(jié)合）與protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）等，圖5 為依據(jù)P 值排序后的前15 個(gè)BP 條目與前7 個(gè)CC、MF 條目。KEGG 信號(hào)通路富集分析共獲得176 條結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)篩選前20 條與DN 相關(guān)的通路并進(jìn)行分類注釋，包括PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路/脂質(zhì)及動(dòng)脈硬化、糖尿病并發(fā)癥中晚期糖基化終產(chǎn)物及受體信號(hào)傳導(dǎo)通路（AGE/RAGE）、趨化因子（Chemokine）信號(hào)傳導(dǎo)通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)傳導(dǎo)通路等，見圖6、7。

圖5 益氣祛風(fēng)方治療DN 核心靶點(diǎn)的GO 富集分析圖Fig.5 GO enrichment analysis of the key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN

圖6 益氣祛風(fēng)方治療DN 核心靶點(diǎn)的KEGG 富集通路圖Fig.6 KEGG enrichment analysis of key targets of Yiqi Qufeng Formula for treatment of DN

圖7 KEGG 通路注釋圖Fig.7 KEGG pathway annotation map

3.5 益氣祛風(fēng)方“主要成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述信號(hào)通路、相關(guān)靶點(diǎn)及活性成分關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape3.9.1，得到“核心成分-核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖8。

3.6 主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接 用于分子對(duì)接的受體根據(jù)拓?fù)鋮?shù)選擇核心靶點(diǎn)中的HSP90AA1（G3V2J8）、PIK3R1（P27986）、EP300（Q09472）、PRKCZ（Q05513）、HRAS（6Q21）、MAPK3（P27361）、IL6（P05231）、ESR1（P03372）、MAPK1（P28482）、NR3C1（P04150）和STAT3（P40763），配體即活性成分根據(jù)篩選結(jié)果及文獻(xiàn)選擇生松素、薺苧黃酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚體-1、N-乙酰多巴胺二聚體-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黃芪甲苷及纖細(xì)薯蕷皂苷。分子對(duì)接結(jié)果顯示，所選主要活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能均大于-5 kcal/mol，見圖9。當(dāng)配體和受體的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)，能量越低，結(jié)合的可能性越大，結(jié)合能＜0 表示可以自發(fā)結(jié)合，該值越低則結(jié)合強(qiáng)度越大?；钚耘c蛋白靶點(diǎn)有效的結(jié)合是藥物發(fā)揮作用的前提，分子對(duì)接結(jié)果表明大部分活性成分與核心靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性。

圖10 部分分子對(duì)接圖Fig.10 Partial molecular docking diagram

3.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 對(duì)部分關(guān)鍵靶點(diǎn)如IL-6、NFκB 及關(guān)鍵通路PI3K/Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路的下游效應(yīng)炎性因子進(jìn)行驗(yàn)證。Western blotting結(jié)果顯示，模型組小鼠腎臟pNF-κB、IL-6、IL-1β、CCL5 表達(dá)量均顯著增加（P＜0．05，P＜0．001），與模型組相比，益氣祛風(fēng)方組pNF-κB、IL-6、IL-1β 表達(dá)量顯著下降（P＜0．05），CCL5 表達(dá)量趨勢(shì)性下降，見圖12、13。

4 討論

DN 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體的發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，根據(jù)目前研究進(jìn)展，認(rèn)為DN 的發(fā)生發(fā)展與血流動(dòng)力學(xué)改變、糖脂代謝紊亂、免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、氧化應(yīng)激及micro RNAs 等多因素相關(guān)[19]。本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技術(shù)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多平臺(tái)、多數(shù)據(jù)庫(kù)分析，探討益氣祛風(fēng)方治療DN 相關(guān)的活性成分、靶點(diǎn)及機(jī)制。

本研究鑒定出益氣祛風(fēng)方中115 個(gè)活性成分，篩選出55 個(gè)主要成分和78 個(gè)核心靶點(diǎn)，主要成分中包括生松素、薺苧黃酮、槲皮素、N-乙酰多巴胺二聚體-1、N-乙酰多巴胺二聚體-2、京尼平苷、牛蒡子苷、黃芪甲苷及纖細(xì)薯蕷皂苷等。生松素來(lái)源于黃芪，為天然黃酮類化合物，具有廣泛的抗炎、抗菌、抗癌及神經(jīng)保護(hù)作用，可通過(guò)抑制AGE-RAGE 通路進(jìn)一步抑制NF-κB 活化，阻斷Caspase 3/7 和9的活化[20]，在DN 動(dòng)物模型中可改善腎功能、尿蛋白及血脂譜，緩解氧化應(yīng)激，減輕基底膜增厚[21]。薺苧黃酮來(lái)源于鬼箭羽，可清除自由基、抑制炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 等的釋放，降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)[22]。槲皮素是一種抗炎及抗纖維化的化合物，來(lái)源于黃芪、鬼箭羽，可以通過(guò)減少氧化應(yīng)激、減輕炎癥、消除自由基和抑制腎小球乳頭狀細(xì)胞增生（DN 的早期病理變化之一）來(lái)延緩DN 的進(jìn)展[23]。它調(diào)控PI3k/Akt 和HIF1-α 信號(hào)通路，以緩解慢性腎臟疾病或腎臟炎癥[24-25]；影響參與胰島素抵抗和2 型糖尿病發(fā)病機(jī)制的許多因素和信號(hào)通路，包括TNF-α、NF-κB、AMPK、AKT 和Nrf2[26]。N-乙酰多巴胺二聚體-1 與N-乙酰多巴胺二聚體-2 來(lái)源于蟬蛻，兩者均可有效抑制活性氧類（ROS）和一氧化氮（NO）產(chǎn)生，抑制NF-κB 活性以及促炎分子如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、IL-6、TNF-α 和環(huán)氧合酶（COX）-2 的表達(dá)[27]，還可改善脂質(zhì)代謝[28]。京尼平苷來(lái)源于水蛭，可有效改善DN 小鼠的腎功能，減輕基底膜增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低炎性因子水平，可通過(guò)調(diào)控APMK/SIRT1/NF-κB 發(fā)揮作用[14]。牛蒡子苷是牛蒡子的主要藥效成分之一，在DN 動(dòng)物模型中可顯著降低24 h 尿白蛋白水平，防止腎小球硬化，并通過(guò)上調(diào)nephrin 和podocin 的表達(dá)，下調(diào)乙酰肝素酶（HPSE）水平，有效地恢復(fù)腎小球?yàn)V過(guò)屏障損傷[29]；還可通過(guò)激活Rho 關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶（ROCK1）和基因功能磷脂酶和張力蛋白同源物（PTEN）、抑制PI3K/Akt 通路來(lái)下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），從而抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[30]。黃芪甲苷是黃芪皂苷中的主要成分，可降低DN 大鼠尿蛋白水平，減輕足細(xì)胞及腎小管損傷，減緩DN 腎纖維化進(jìn)展，可通過(guò)調(diào)控TGF-β1/PI3K/Akt 信號(hào)通路、Toll 樣受體4（TLR4）/NF-κB 信號(hào)通路、NLRP3/Caspase-1 信號(hào)通路等諸多途徑發(fā)揮作用[31]。纖細(xì)薯蕷皂苷是來(lái)源于穿山龍甾體皂苷類成分，目前研究主要關(guān)注其抗腫瘤作用，其調(diào)控自噬與凋亡主要通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR 通路和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)蛋激活蛋白3（STAT3）、JAK2 等靶點(diǎn)[32]，與本研究中富集分析得到的核心通路、靶點(diǎn)一致，分子對(duì)接結(jié)果也可提供證據(jù)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析提示本方通過(guò)以HSP90AA1、EP300 基因編碼E1A 結(jié)合蛋白P300（EP300）、PIK3R1、MAPK3、MAPK1、HRAS、IL-6、PRKCZ、雌激素受體1（ESR1）、核受體亞家族3C 組成員1（NR3C1）及STAT3 等為核心的一系列靶點(diǎn)起作用。HSP90AA1 基因編碼熱休克蛋白90α，是熱休克蛋白C（HSP90）的一種應(yīng)激誘導(dǎo)型異構(gòu)體，可在腎小球足細(xì)胞中表達(dá)。抑制HSP90 可以改善DM 小鼠的胰島素敏感性和高脂飲食引起的腎衰竭[33-34]；進(jìn)一步可抑制NF-κB 和STAT 信號(hào)通路調(diào)節(jié)的細(xì)胞過(guò)程來(lái)改善DM 相關(guān)的腎損傷和動(dòng)脈硬化[35]。EP300是賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶和基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白。EP300 基因多態(tài)性與DN 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，機(jī)制可能為增加缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF2α）的表達(dá)以促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的纖維化[36]。PIK3R1 基因編碼磷脂酰肌醇3-激酶p85α 調(diào)節(jié)亞基1 蛋白（PIK3R1），它與p110 催化亞基緊密連接，共同構(gòu)成PI3K 蛋白，是AKT 信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、分化、葡萄糖運(yùn)輸和利用。PIK3R1 在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中起直接作用，突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島素抵抗[37]。MAPK3 與MAPK1 同源，兩者分別編碼絲裂原活化蛋白激酶3 和1（或稱胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶2 和1，MAPK3/ERK2、MAPK1/ERK1），作為多種生化信號(hào)的整合點(diǎn)參與多種細(xì)胞過(guò)程，如增殖、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育。DN 動(dòng)物模型中，ERK1/2 的異常激活可抑制足細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞自噬[38]，或促使下游JNK 和P38 激活，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎纖維化[39]。PRKCZ 編碼蛋白激酶C 的ζ 型，在PI3K 和MAPK級(jí)聯(lián)中起作用，參與有絲分裂信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性、炎癥反應(yīng)等生理過(guò)程。胰島素信號(hào)通路中可作為PI3K 的下游效應(yīng)子，并有助于激活葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC2A4/GLUT4 的易位和葡萄糖在脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)。該基因也與2DM 易感性相關(guān)[40]。

通路富集分析結(jié)果包含PI3K/Akt 信號(hào)傳導(dǎo)通路、脂質(zhì)及動(dòng)脈硬化、AGE/RAGE 信號(hào)傳導(dǎo)通路等。PI3K/AKT 信號(hào)通路具有促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞凋亡的作用，是DN 免疫炎癥機(jī)制中的一條重要信號(hào)通路，與系膜基質(zhì)增生、基底膜增厚、足細(xì)胞損傷以及腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等具有密切的聯(lián)系[41]。AGEs 是高糖環(huán)境下的代謝產(chǎn)物，一方面直接損傷腎臟細(xì)胞和組織，另一方面與RAGE 結(jié)合形成AGE/RAGE 信號(hào)通路，可激活下游包括PI3K/AKT、MAPK/ERK 和NF-κB 等在內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路，共同參與DN 的氧化應(yīng)激、炎癥和足細(xì)胞凋亡過(guò)程[41-42]。DN 的發(fā)展和進(jìn)展與血脂異常密切相關(guān)[43]，由于DM患者胰島素功能失調(diào)，血脂異常在DM 患者中很常見。由于脂質(zhì)代謝過(guò)程中動(dòng)脈粥樣硬化脂質(zhì)化合物的增加，加劇腎臟微血管病變[44-45]，成為DN 的發(fā)生發(fā)展因素之一。本課題組前期研究已證明益氣祛風(fēng)通絡(luò)法在動(dòng)物模型中可以起到降低蛋白尿、減輕腎間質(zhì)纖維化以及延緩腎小球硬化的作用，延緩動(dòng)脈硬化效果明顯；經(jīng)藥物干預(yù)后，腎組織中p-PI3K、p-AKT 水平顯著低于模型組，且通路抑制因子PTEN的表達(dá)明顯高于模型組，故其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路進(jìn)而下調(diào)NF-κB、單柱細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子的表達(dá)水平有關(guān)[8]。本研究通過(guò)對(duì)益氣祛風(fēng)方與DN 之間PPI 的構(gòu)建與益氣祛風(fēng)通絡(luò)方化合物-蛋白分子對(duì)接的研究，初步分析了益氣祛風(fēng)方中黃芪、牛蒡子、穿山龍、鬼箭羽、蟬蛻、水蛭的有效活性成分，在益氣祛風(fēng)方治療DN 的機(jī)制方面提供了理論依據(jù)。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測(cè)出益氣祛風(fēng)方中黃芪、牛蒡子、穿山龍、鬼箭羽、蟬蛻、水蛭治療DN 的潛在作用靶點(diǎn)和通路，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)與文獻(xiàn)研究，得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行補(bǔ)充分析，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用于疾病的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探討益氣祛風(fēng)方和中醫(yī)“從風(fēng)論治”法的作用機(jī)制提供新思路，也為DN 的治療作用機(jī)制研究提供了新的參考和方向。