電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定板藍(lán)根中重金屬元素

彭 剛,高 明,馬恩耀,楊詩慧,張路娣,劉奇越,李嘉珉,陳偉華

(1.嶺南中藥飲片有限公司,廣東佛山 528244;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510006;3.廣東漢潮中藥科技有限公司,廣東廣州 510360;4.廣州采芝林藥業(yè)有限公司,廣東廣州 510360)

中藥承載著中醫(yī)的基本理論、安全性及有效性,其質(zhì)量優(yōu)劣及穩(wěn)定性是影響中醫(yī)藥走出國門走向世界的重要因素,中藥安全性也是國內(nèi)外共同關(guān)注的焦點(diǎn)問題,影響中藥安全性的外源性有害物質(zhì)主要有二氧化硫、重金屬、農(nóng)藥殘留、黃曲霉毒素等,這些外源性有害物質(zhì)對人體健康造成較強(qiáng)的毒害作用或在人體某些器官中累積造成慢性中毒[1-4],從而發(fā)生疾病。植物類中藥由于自身特點(diǎn),受土壤污染、化肥污染、工業(yè)污染等生長環(huán)境影響、農(nóng)藥使用不規(guī)范及后期產(chǎn)地加工和貯藏缺乏規(guī)范,均易造成重金屬污染。

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的干燥根,其性寒、味甘,具有清熱解毒、涼血利咽的功效[5],是大宗品種常用中藥材之一,廣泛用于治療感冒、抗病毒和抗流感等方面,具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、保肝降酶、提高免疫力等藥理作用[6]。在臨床用藥方面,板藍(lán)根主要用于治療上呼吸道感染、急性傳染性肝炎、流行性乙型腦炎、流行性結(jié)膜炎等疾病[7]。板藍(lán)根亦是連花清瘟膠囊、疏風(fēng)解毒膠囊這2個(gè)中成藥中的成分之一,在新型冠狀病毒感染防治中起著很大的防疫和治療作用[8]。現(xiàn)代研究表明,板藍(lán)根化學(xué)成分含有苷類、木脂素類、氨基酸類、生物堿類、有機(jī)酸類、多糖類及Cu、Cd等無機(jī)元素[9]。無機(jī)元素與中藥藥效緊密相關(guān),如Cu參與造血過程和酶的合成,從而達(dá)到補(bǔ)血補(bǔ)氣和增強(qiáng)免疫力功效[10-11]。同時(shí)有害重金屬元素的含量過高會使人體出現(xiàn)異常,引起不同系統(tǒng)或部位的病變,甚至導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,如Hg、Pb、As可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等毒性損害[12-13]。因此,測定板藍(lán)根的無機(jī)元素含量具有重要的意義。

板藍(lán)根為根類藥材,易受到土壤中重金屬元素的污染,目前關(guān)于板藍(lán)根藥材重金屬方面相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少,且板藍(lán)根藥材在2020版《中國藥典》中重金屬及有害元素沒有作出規(guī)定值[14]。該研究通過對30批不同產(chǎn)地板藍(lán)根中藥材中重金屬含量進(jìn)行檢測,探討不同產(chǎn)地板藍(lán)根植物藥中重金屬元素的殘留特性;建立板藍(lán)根的重金屬快速檢測方法,為板藍(lán)根重金屬的限量規(guī)定提供一定的數(shù)據(jù)和方法支持。

1 材料與方法

1.1 儀器Agilent 7800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Agilent公司);MultiwavePro 型微波消解儀[安東帕(上海)商貿(mào)有限公司];XPR303S型萬分之一天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];Comfort Ⅰ 型超純水機(jī)[賽多利斯斯泰迪生物設(shè)備(北京)有限公司];空氣置換型移液器(武漢拉普蘭德科技有限公司);超純水系統(tǒng)(Comfort 1,德國賽多利斯公司)。

1.2 試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度1 000 μg/mL)均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心,Pb GSB 04-1742-2004,批號213015-2;Cd GSB 04-1721-2004,批號212005-5;As GSB 04-1714-2004,批號211040-4;Hg GSB 04-1729-2004,批號211002-6;Cu GSB 04-1725-2004,批號211050-5。硝酸(德國默克股份有限公司,65%優(yōu)級純);水由Milli-Q超純水處理系統(tǒng)制得。

1.3 樣品采集該試驗(yàn)30批板藍(lán)根樣品采自甘肅、安徽、河南、河北、山西5個(gè)省,所采集樣品經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)高明教授鑒定確認(rèn)板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的干燥根。采集樣品50 ℃烘干,粉碎過3號篩。樣品來源詳見表1。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1儀器工作條件。ICP-MS射頻功率1 550 W;采樣深度為5 mm;蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速0.10 r/s;噴霧室溫度為2 ℃;等離子氣流速15.0 L/min;吹掃氣體為氬氣;碰撞氣體為氦氣,氣體流速5 L/min;輔助氣(氬氣)流速1 L/min;測試前用調(diào)諧液進(jìn)行調(diào)諧,掃描100次,重復(fù)次數(shù)3次。微波消解程序和條件參數(shù)詳見表2。

表2 微波消解升溫程序Table 2 Microwave digestion heating procedure

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液的制備。分別精密量取Pb、As、Cd、Hg、Cu單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成分別含Pb、As、Cd、Hg、Cu為1.0、0.5、1.0、1.0、10.0 μg/mL的溶液,即得。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密量取Pb、As、Cd、Cu標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成含Pb、As 0、1、5、10、20 ng/mL,含Cd 0、0.5、2.5、5.0、10.0 ng/mL,含Cu 0、50、100、200、500 ng/mL的系列濃度混合溶液。另精密量取Hg標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量,用10%硝酸溶液稀釋制成分別含Hg 0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的溶液,本液應(yīng)臨用配制。

1.4.4內(nèi)標(biāo)溶液的制備。精密量取鍺、銦、鉍單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用水稀釋制成各含1 μg/mL的混合溶液,即得。

1.4.5供試品與空白溶液的制備。精密稱取藥材粉末0.5 g于微波消解罐中,加入硝酸7 mL,按設(shè)定的微波消解程序進(jìn)行消解,冷卻后取出,緩慢打開罐蓋排氣待消解液冷卻后,用少量水多次洗滌消解罐3次,將消解液和洗滌液合并于50 mL容量瓶中,加入200 μL金單元素標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 μg/mL),用水定容至刻度,搖勻備用,即得供試品溶液。除不加金單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外,其余同法制備空白溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系考察。取“1.4.3”項(xiàng)下不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液各1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進(jìn)樣測定。以重金屬質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、重金屬與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見表3,可知各重金屬元素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999 6)。

2.1.2檢出限、定量限。取“1.4.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進(jìn)樣測定11次,記錄儀器各個(gè)重金屬元素響應(yīng)值,分別以儀器響應(yīng)值10、3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限、檢出限,結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationship,detection limit and quantitative limit

2.1.3重復(fù)性。取1號樣品粉末0.5 g,精密稱6份,按“1.4.5”方法平行制備供試品溶液,在“1.4.1”儀器工作條件下進(jìn)行測定,測得各元素含量并計(jì)算RSD,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量RSD分別為2.4%、1.6%、1.7%、1.4%、2.3%,說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4精密度。取“1.4.3”標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL,在“1.4.1”儀器工作條件下進(jìn)樣測定6次,測得各元素響應(yīng)值并計(jì)算RSD,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量RSD分別為2.6%、1.4%、1.7%、1.3%、2.1%,表明儀器精密度良好。

2.1.5加樣回收率。準(zhǔn)確稱取1號粉末0.25 g,共6份樣品,分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,在“1.4.1”儀器工作條件下進(jìn)行測定各元素含量,計(jì)算平均回收率,結(jié)果如表4所示。從表4可以看出,Pb、Cd、As、Hg、Cu含量的平均回收率分別為99.61%、99.65%、99.58%、97.63%、99.96%,RSD分別為1.43%、2.64%、3.25%、3.83%、1.43%。

表4 5種元素的加樣回收率試驗(yàn)(n=3)Table 4 Sampling recovery test for five elements

2.1.6板藍(lán)根樣品各元素含量測定。根據(jù)試驗(yàn)方法,利用ICP-MS測定5個(gè)省30批板藍(lán)根樣品中Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量,結(jié)果見表5。從表5可以看出,Pb含量為0.22～1.19 mg/kg,Cd含量為0.18～31.09 mg/kg,As含量為0.12～1.89 mg/kg;Hg含量為0.00～0.14 mg/kg,Cu含量為2.36～31.06 mg/kg。5種重金屬元素含量在不同產(chǎn)地的板藍(lán)根中均有差異。其中,Cd元素在不同產(chǎn)地板藍(lán)根之間含量差異最大,含量高低極值差約為30.91 mg/kg;而不同產(chǎn)地板藍(lán)根中Hg含量相差最小,含量高低極值差約為0.14 mg/kg。

2.2 不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材質(zhì)量綜合評價(jià)

2.2.1主成分分析。利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,對5個(gè)省份30批樣品的質(zhì)量進(jìn)行因子水平分析。為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否適合進(jìn)行主成分分析,該研究對主成分分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行KMO檢驗(yàn)和Barlett球形檢驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),KMO為0.625,大于0.6,且Bartlett球形檢驗(yàn)顯著性P=0.000,小于0.05,說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持主成分分析。同時(shí),按照特征值大于1的原則,提取2個(gè)主成分(PC1、PC2),如表6中顯示,2個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到72.577%,故提取2個(gè)公共因子可以反映原變量的72.577%的方差,表明提取的主成分可以代表大部分板藍(lán)根重金屬元素含量的信息。

運(yùn)用主成分分析的方法對30批樣品中Pb(X1)、Cd(X2)、As(X3)、Hg(X4)、Cu(X5)含量經(jīng)SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出各主成分得分表達(dá)式(公式1～2)及綜合主成分得分表達(dá)式(公式3),可用于揭示不同產(chǎn)地板藍(lán)根各重金屬元素含量與板藍(lán)根質(zhì)量的關(guān)系,且從結(jié)果可知板藍(lán)根質(zhì)量表現(xiàn)出地域差異的特性,通過主成分得分表達(dá)式(公式1～3)計(jì)算5個(gè)產(chǎn)地30個(gè)樣品質(zhì)量的主成分得分、綜合得分及質(zhì)量排名,結(jié)果如表7所示。

表6 主成分分析特征值、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 6 Principal component analysis eigenvalues and cumulative variance contribution rates

F1= 0.554X1+0.528X2+0.495X3+0.305X4-0.277X5

(1)

F2= -0.011X1+0.214X2-0.387X3+0.740X4+0.506X5

(2)

F= 0.510F1+0.216F2

(3)

從表7可以看出,主成分綜合得分越高,質(zhì)量評價(jià)越好,在5個(gè)省份產(chǎn)區(qū)中,可以推斷出河北安國(19號)的板藍(lán)根藥材質(zhì)量最佳,其次是安徽鳳陽(7號)、河北邢臺(16號),而甘肅隴西2批樣品(1號、2號)及河南洛陽2批樣品(10號、11號)的主成分綜合得分(F)小于1,質(zhì)量較差。

表7 30批樣品板藍(lán)根藥材主成分得分(F1、F2)、綜合得分(F)及排名Table 7 Main component scores(F1,F2),comprehensive scores(F)and ranking of Radix Isatidis medicinal materials in 30 batch samples

2.2.2聚類分析。采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對30批不同產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材中5種重金屬(Pb、Cd、As、Hg、Cu)含量進(jìn)行聚類分析,以重金屬含量作為聚類變量,進(jìn)行Zscore標(biāo)準(zhǔn)化后,采用組間連接方法、平方歐氏距離進(jìn)行層次聚類,得到聚類樹狀譜系圖(圖1)。圖1結(jié)果顯示,當(dāng)平均Euclidean距離為10時(shí),將30批樣品共分為六大類,其中,批號9、18、17、19、16、25為第一類,批號4、13、21、22、20、3、12、30、29、26為第二類,批號27、28為第三類,批號23、24、7、8為第四類,批號2、11、1、10為第五類,批號6、15、5、14為第六類。聚類分析樹狀圖顯示,同類間的重金屬含量結(jié)果相似度較高,不同類之間差異較大。因此,可以初步判斷不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材中重金屬含量的差異。

3 結(jié)論與討論

數(shù)據(jù)分析參考2020版《中國藥典》部分植物藥規(guī)定限度標(biāo)準(zhǔn):Pb ≤ 5 mg/kg,Cd ≤ 1 mg/kg,As ≤ 2 mg/kg,Hg ≤ 0.2 mg/kg,Cu ≤ 20 mg/kg;計(jì)算不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材中5種重金屬元素含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),板藍(lán)根Pb含量為0.22～1.19 mg/kg;Cd含量為0.18～31.09 mg/kg,有86.67%樣品超標(biāo),可能是與當(dāng)?shù)氐闹参锷L環(huán)境、土壤污染程度有關(guān),且所檢測的5個(gè)省份產(chǎn)地板藍(lán)根樣品中Cd含量均較高,推測板藍(lán)根可能是Cd富集植物;As含量為0.12～1.89 mg/kg;Hg含量為0.00～0.14 mg/kg;Cu含量為2.36～31.06 mg/kg,有26.67%樣品Cu含量超標(biāo),主要是山西、安徽、河南、河北所采板藍(lán)根Cu超標(biāo);66.67%板藍(lán)根樣品未檢測出Hg,所采集的30批樣品中Hg、Pb和As含量均不超標(biāo)。

圖1 板藍(lán)根藥材中5種重金屬系統(tǒng)聚類分析結(jié)果 Fig. 1 Systematic clustering analysis results of five heavy metals in Radix Isatidis medicinal materials

該試驗(yàn)采用微波消解結(jié)合ICP-MS的方法同時(shí)測定不同產(chǎn)地板藍(lán)根藥材中重金屬Pb、Cd、As、Hg、Cu的含量。該樣品前處理方法簡單,檢測方法靈敏度和準(zhǔn)確度高、檢出限低,線性關(guān)系良好,可用于快速準(zhǔn)確測定板藍(lán)根藥材重金屬元素含量,為板藍(lán)根重金屬元素限量范圍制定提供參考依據(jù)。對檢測結(jié)果進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地板藍(lán)根樣品指標(biāo)含量差異較大。主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)30批不同產(chǎn)地的板藍(lán)根樣本中重金屬元素含量均有較大差異,且Pb和Cd含量對板藍(lán)根質(zhì)量有較大貢獻(xiàn),依據(jù)主成分綜合得分進(jìn)行評價(jià),以河北安國(19號)的板藍(lán)根藥材質(zhì)量最佳,其次是安徽鳳陽(7號)、河北邢臺(16號)種植的板藍(lán)根質(zhì)量較高,可考慮在上述地區(qū)對板藍(lán)根進(jìn)行規(guī)范化種植發(fā)展。